花生四烯酸發(fā)酵動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型.pdf

億 與 生 物 互 程 2 0 0 7 ， V o 1 2 4 N o 6 Ch e mis t r y & Bioe n gin e e r in g 花生 四烯 酸發(fā) 酵動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型 金 明杰 ， 黃和 ， 劉欣 ， 任 路 靜 ， 張昆 ( 南京 工業(yè) 大學(xué)制 藥 與生命 科 學(xué) 學(xué)院 ， 江 蘇 南京 2 1 0 0 0 9 ) 摘 要 ： 分析 了高山被孢 霉發(fā) 酵生產(chǎn)花生四烯酸的動(dòng) 力學(xué)特征 ， 建立 了氮源與 葡萄糖雙底 物限制 動(dòng)力 學(xué)模 型 ， 并結(jié) 合 代謝 流分析理論提 出了花生 四烯酸發(fā) 酵動(dòng)態(tài)代 謝通量分析模 型 ， 通過非 線性 最 小二 乘法優(yōu)化 擬合 獲得 參數(shù) 。進(jìn) 一步 實(shí)驗(yàn)表 明這個(gè)模 型具有較 高的精確度 ， 能很好地模擬發(fā) 酵過程 ， 并能很容 易地 獲得 不同發(fā) 酵時(shí)間的代謝流分布。 關(guān)鍵 詞 ： 動(dòng) 態(tài)代謝通 量分析 ； 動(dòng) 力學(xué)模型 ； 發(fā)酵 ； 花生四烯酸 中圖分類號(hào) ： T Q 9 2 0 1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 ： A 文章編號(hào) ： 1 6 7 2 5 4 2 5 ( 2 0 0 7 ) 0 6 -0 0 4 1 0 4 花生 四烯酸 ( Ar a c h i d o n i c a c i d ， AA) 屬于 6 0 6系列 長(zhǎng)鏈 多不飽 和 脂 肪 酸 ， 具 有 多 種 生 理 活 性 j ， 應(yīng) 用 廣泛 。微 生物 發(fā)酵 法生 產(chǎn) AA 的研 究 主要集 中在 培 養(yǎng)基的優(yōu)化 、 菌種的篩選和關(guān)鍵酶 等方面 ， 同時(shí) 氮源 充足 條件下 碳源 限制 發(fā) 酵過程 動(dòng)力 學(xué)模 型 也 已建 立 ， 但 花生 四烯 酸 發(fā) 酵 過 程 的定 向調(diào) 控 一 直 是 個(gè) 難 題。代謝通量分析 ( MF A) 通過量化 細(xì)胞體 內(nèi)的代 謝流 獲得 代謝通 量分 布 圖 ， 為 明確 細(xì)胞 內(nèi)代 謝過 程 、 產(chǎn) 物合 成過 程提供 了可能 。 鑒 于 高 山被 孢霉 在氮 源受 限制 發(fā) 酵時(shí) AA 產(chǎn)量 比 氮源 充足 時(shí)高 ， 同 時(shí) 目前 大 部分 發(fā) 酵 過 程都 采 用 限 制性氮 源發(fā) 酵 。 ， 作 者 在此 建 立 了氮 源 與碳 源 雙底 物 限制 動(dòng)力 學(xué)模 型 ， 并 進(jìn) 一 步根 據(jù) 代 謝 通 量 分 析 理論 構(gòu)建 了花生 四烯 酸 動(dòng)態(tài) 代 謝 通 量 分 析模 型 ， 擬 為定 向 調(diào) 控發(fā) 酵過 程提 供依據(jù) 。 l 實(shí) 驗(yàn) 1 1菌種 和培 養(yǎng)基 高 山被孢 霉 ME 一 1 ( Mo r t i e r e l l a a l p i n e ME 一 1 ) ， 南 京工業(yè) 大學(xué) 代謝 工程實(shí) 驗(yàn) 室保存 。 種 子培 養(yǎng) 基 ( gL ) ： 葡 萄糖 6 0 ，酵 母 膏 5 0 ， KH2 P ( ) 4 3 0 ， p H 值 6 0 。 發(fā) 酵培 養(yǎng) 基 ( gL ) ： 葡 萄 糖 6 0 ，酵 母 膏 5 0 ， KH2 P O 3 0 ， Mg S O4 1 ， NA N( ) 3 3 ， p H 值 6 0 。 1 2發(fā) 酵工 藝 用 5 mI 無菌水 將 活化斜 面菌 種洗 入 裝有 5 0 mL 田 種子 培養(yǎng) 基 的 2 5 0 mL三 角 瓶 中 ， 2 5 、 1 5 0 rmi n 下 搖瓶 培養(yǎng) 2 d得 種 子液 ， 接入 5 L發(fā) 酵罐 進(jìn) 行發(fā) 酵 。 發(fā) 酵條 件 ： 溫度 2 6 ， 攪 拌轉(zhuǎn) 速 2 5 0 r mi n ， 裝液 量 3 L， 通氣量 2 0 L mi n ， p H 值 6 0 。 1 3分析 方法 糖 濃度 的測(cè) 定 ： S B A 生物 傳感 分析 儀測(cè)定 。 菌 絲體 干 重的測(cè) 定 ： 將 培養(yǎng) 物 抽濾 ， 并 用 蒸餾水 洗 滌 3次 。抽 干 后 ， 6 0 烘 干 至 恒 重 ( 含 水 量 在 4 以 下 ) ， 稱 重 。 菌油的提取 ： 索氏提取法提取粗菌油 。 脂肪酸測(cè)定 ： 參見文獻(xiàn)E 1 2 。 菌體碳 、 氮元 素含量 的測(cè)定 ： 利用 E A l 1 1 2元素分析 儀測(cè)得 菌體 ( 不 含 油脂 ) 中 的碳 含 量 為 4 1 9 6 、 氮 含 量 為 5 9 6 。 發(fā)酵液氮元素 的衡算 ：發(fā)酵液氮濃度 一 發(fā)酵液 起始 氮 濃度 菌 體干重 5 2 雙底物 限制動(dòng)力學(xué)模 型的構(gòu)建 花生四烯酸限制氮源發(fā)酵曲線如圖 1 所示( 所提到 的菌體量都是扣除油脂后的) 。從 圖 1可知 ， 菌體生長(zhǎng) 存在一個(gè)遲滯期 ， 菌體生長(zhǎng)加快氮源消耗也迅速加快， 隨著氮源 的基本耗盡 菌體也停止 生長(zhǎng) ， 表 明氮 源濃度是 影 響菌體生 長(zhǎng) 的限制 性 基質(zhì) 。在 菌體 生 長(zhǎng) 階段 ( 0 9 6 h ) 葡萄糖基本是充足的， 同時(shí)其它條件( 如溶氧等) 對(duì)菌 體生長(zhǎng)影響不大。而到了穩(wěn)定期 ( 9 6 1 4 4 h ) 葡萄糖濃 度成 了限制 脂肪酸合成 的因素 。基于 以上分 析 ， 建立模 基金項(xiàng) 目： 江蘇省 自然科學(xué)基金 資助項(xiàng) 目( B K 2 0 0 5 1 1 4 ) ， 江 蘇省博士后科研 資助計(jì) 劃項(xiàng) 目 收稿 日期 ： 2 0 0 7 0 3 3 0 作者 簡(jiǎn)介 ： 金 明杰( 1 9 8 1 一) ， 男， 江 蘇吳 江人 ， 碩士 研 究生 ， 主要 研 究方 向： 代謝 工程 ； 通訊聯(lián) 系人 ： 黃和 ， 教授 。E ma i l ：h u a n g h n j u t e d u C F I 。 維普資訊 囝 型如下 。 圖 1 花生 四烯酸 限制氮源 曲線 F i g 1 T i me - c o u r s e s o f b i o ma k s a n d f a t t y a c i d s s y nt h esi s i n f e r me nt at i o n 2 1 氮 源受 限制菌 體 生 長(zhǎng)及 氮 源 消 耗 動(dòng) 力學(xué) 模 型 的 構(gòu)建 選 擇氮 源為 影響 菌 體 生 長(zhǎng) 的唯 一 限 制性 基 質(zhì) ， 考 慮到菌 體濃度 的增 加對(duì) 自身 生長(zhǎng) 的抑 制作用 及生 長(zhǎng)存 在遲滯期 ， 采用 B e r g t e r 1 模型并略加修正 ， 建立 如下 生 長(zhǎng)動(dòng) 力學(xué)模 型 ： c 由于氮源只用來合成菌體 ， 因此氮源消耗動(dòng)力學(xué) 模型 可用下 式表 示 ： 牟 一 一 0 0 5 ( 2 ) 2 2 碳 源 消耗動(dòng) 力 學(xué)模 型 及 受碳 源濃 度 限 制 的 油脂 生成模 型 由于遲滯期、 指數(shù)生長(zhǎng)期葡萄糖充足而穩(wěn)定期葡 萄糖成 為脂 肪酸合 成 的 限制 條 件 ， 為 更 準(zhǔn) 確地 描 述 脂 肪 酸 的合 成及 葡萄糖 的消耗 ， 對(duì) 遲 滯期 、 指數(shù)生 長(zhǎng)期 與 穩(wěn) 定期分別 用模 型描 述 。 用 L u e d e k i n g和 P i r e t L l 模 型來 描 述 葡萄 糖 的消 耗與菌體生長(zhǎng)的關(guān)系如下 ： 一一鋤 d c x 一 屆f x ( 0 9 6 h ， 遲滯期 、 指數(shù)生長(zhǎng)期) ( 3 ) 一一口 d c x 一 屈f x ( 9 6 1 4 4 h ， 穩(wěn)定期) ( 4 ) 遲滯期 、 指數(shù)生長(zhǎng)期葡萄糖充足 ， 對(duì)脂肪酸合成的 限制性影響不大 ， 并且脂肪酸的合成與菌體 生長(zhǎng)部分 偶聯(lián)， 因此用 L P方程描述這個(gè)時(shí)期脂肪酸的合成 ： dC P d t - b f + d c 穩(wěn) 定期 菌體 生 長(zhǎng)基 本 停 止 ， 脂 肪 酸 的合 成 相 當(dāng)于 一 個(gè)酶催化轉(zhuǎn)化過程 ， 且此 階段葡萄糖濃度對(duì)脂肪酸 合成有 限制 性作 用 ， 因此選 擇 Mi c h a e l i s 方 程描 述此過 程 ： 明杰等 ： 花生 四烯酸發(fā)酵動(dòng)態(tài)代謝通 量分析模型 2 0 0 7年I i i 6期 dC p m g Cs 2 c 、 ( 6) 式 ( 1 ) ( 6 ) 構(gòu)成 了花 生 四烯 酸發(fā)酵 雙底 物 限制 的 動(dòng)力 學(xué)模 型 。 3 基 于動(dòng)力學(xué)模 型的動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型 3 1 代 謝通 量模 型的構(gòu) 建 高山被孢霉體內(nèi) AA合成代謝 網(wǎng)絡(luò)見 圖 2 。在高 山被孢霉菌體內(nèi)， 用于合成脂肪酸的 NAD P H 由蘋果 酸 酶 ( Ma l i c e n z y me ) 脫 羧 作 用 即 轉(zhuǎn) 氫 酶 循 環(huán) ” 提 供 。 Gl u c o _r Bi 0m s s l N A D P H + c l ， ， 工 、 I 叫 -c 。 。 n z J 1 6 ： 0 -q8 ：0E n l o n g a s e Ar a c h i d o mc a c i d5 , 8 ， I I ， 1 4 - 2 0 ： 4 f AA ) 圖 2高 山被孢霉體 內(nèi) A A合成代謝網(wǎng)絡(luò) Fi g 2 M e t ab o l i c pa t hwa y ne t wo r k of AA s y nt h esi s 根 據(jù)擬穩(wěn) 態(tài)假設(shè) ， 代 謝 中間物 的積 累為 零 ， 因此整 個(gè)代謝途徑碳流的去路可用化學(xué) 計(jì)量反應(yīng)式表示 ， 從 而構(gòu)成 了 AA 發(fā) 酵代 謝通 量 的分析 模 型 。 ( 1 ) 經(jīng) 過 E MP +T C A 循環(huán) 完全 氧化 的碳 流 ： l ：6 CO2 + 1 2 NADH + 4 ATP C6 Hl 2 O6 0 ( 2 ) 丙 酮酸 一草酰 乙酸 一蘋果 酸 一丙酮 酸循 環(huán)“ 轉(zhuǎn) 氫酶循環(huán)” ： r 2 ： 一 ATP NADH + NADPH= 0 將消耗的 NADH 和 ATP折算成完全通過 E MP +TC A循 環(huán) 消耗 的碳 流 ， 則 r 可表 示為 ： m 9 J 4 3 2O 1 O O O O O O O n 口 君 g u g u 0 u j 0 維普資訊 金明杰等： 花生四烯酸發(fā)酵動(dòng)態(tài)代謝通量分析模 2 0 0 7年囊 6期 一 C6H1 2 U6 十 1 0NADPH 一 0 ( 3 ) 完全用于產(chǎn) Ac C o A的碳 流， 即進(jìn)入脂肪酸合 成 的碳 流 ： 。 。 。 。 P y m v 缸 e 。 A ：一 C 6 H1 2 O6 + 2 H2 0+ 2 NADH 一 2 ATP+ 2 NADPH + 2 Ac C o A+ 2 CO2 0 ( 4 ) 用于 菌體 生長(zhǎng) 的碳 流 ， 作碳 元 素衡 算 ： d c x X 41 一 4 o ( G lu 表 示 用 于 菌 體 合 成 的葡萄糖分流濃度 ) 一 0 00 57 d c x ( 7) 3 2 基 于 動(dòng)力學(xué) 模 型 的動(dòng) 態(tài) 代 謝 通 量 分 析模 型 的構(gòu) 建 指數(shù) 生 長(zhǎng)期及 穩(wěn)定 期脂 肪 酸組成 及 生成各 脂肪 酸 所 消耗 的 NAD P H 見 表 1 。經(jīng) 衡算 脂肪 酸 中各 時(shí)期 碳 含量基本都為 7 6 。對(duì) 以上代謝 通量模 型做碳元素 衡算得 ： o 0 1 6 X ( 8 ) 四 4結(jié)果與討 論 4 1動(dòng)力 學(xué)模 型參數(shù) 的 求取 用 四階 Ru n g e - Ku t t e 法求 解上 述微 分方 程 ， 用非 線 性最t - - 乘法優(yōu)化擬合 得到動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)見表 2 。 表 2 動(dòng)力學(xué)模 型參數(shù) Tab 2 Pa r ame t e r s of k i n e t i c mo de l s d K t t 口 l 口 2 b d g m K p O 0 7 3 1 0 5 0 0 5 2 6 7 1 4 1 0 0 3 3 1 4 3 0 0 1 0 1 7 0 0 0 3 0 0 2 3 5 7 擬合效果見 圖 3 ， c 、 c 計(jì)算值與實(shí)驗(yàn)值之 間 的 平 均 相 對(duì) 誤 差 分 別 為 1 0 、 2 1 、6 8 、 1 4 ，擬合效果較好。 一 ：， +， +， 。 + 圖 3模型擬合效果 圖 對(duì) NAD P H 做 衡算 ， 則 可得 ： F i g 3 c 。 m p 。 “ 。 。 p 。 m 。 m 。 d “ d t h o r 。 d r 一0 0 0 2 6 ( 遲滯 期和指數(shù)生長(zhǎng)期) ( 9 ) 可將 穩(wěn)定 期流 入脂 肪酸 的碳 流近 似看 作全 部 流入 AA合成 ， 對(duì) NAD P H做衡算得 ： r 2 一O 0 0 3 3 X d C p ( 穩(wěn) 定期) ( 1 0 ) 于是 有 n一一o 0 0 5 6 X d C s 2 r 2 - r 3一 l 1 ) 式( 1 ) ( 1 1 ) 便構(gòu)成 了動(dòng)態(tài)代謝 通量分析模 型。 求解 此模 型 可 獲 得 任 意 時(shí) 間 段 ( 點(diǎn) ) 的 r ， r 反 應(yīng) 速 率 ， 繼 而 歸一化 便可 得到 代謝 通量 分布 圖 ， 從 而 獲得 發(fā) 酵過程中代謝通量動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)。 表 1油脂 中各脂肪 酸含量以及合成各脂肪酸 N A D P H的消耗 Ta b 1 Co n t e n t of v ari o u s f a t t y a c i d s i n l i pi d s a nd c o s t s o f NADPH ， C o n t e n t o f v a r i o u s f a t t y a c i d s i n l i p id s 百 麗T百 _ i _ 9 6 2 7 1 7 1 2 6 5 8 5 2 O 5 2 2 O 1 2 1 1 6 8 1 5 5 4 0 1 7 6 5 0 1 0 5 0 4 5 0 3 0 C o s t s o f NA D P H 1 4 1 5 1 6 1 7 1 8 1 9 2 O 1 7 mo I m o l 一 4 2 模 型 的驗(yàn) 證 為 了驗(yàn)證模型的誤差 ， 對(duì)另一組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù) 與模型 預(yù)測(cè)值 進(jìn)行 比較 ， 結(jié) 果 見 圖 4 。C 、 C 、 C 、 C 計(jì) 算 值 與 實(shí)驗(yàn)值 之 間 的 平 均 相 對(duì) 誤 差 分 別 為 2 1 9 6 、 4 4 、 1 2 、 3 4 ， 說 明該 模 型 能 很 好 地 描 述 氮 源 受 限 制 發(fā) 酵過 程 。 圖 4實(shí) 驗(yàn)數(shù) 據(jù) 與 預(yù) 測(cè) 值 的 比 較 Fi g 4 Co m pa r i s o n o f e x p e r i m e nt al da t a a n d p r e d i c t e d da t a 4 3代 謝流 量分 布探 討 通過動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型計(jì)算得到菌體發(fā)酵過 程典型生長(zhǎng)期第 4 8 h的 r ， r 速率， 歸一化后得到代 謝 流分 布 圖( 圖 5 ) 。從 圖 5很 明 顯地 可 以看 出 ， 要 提 ， 0 是g聳8 s p 【d I 1 萋 0 西 O O 0 O O O ) 。 -0 們 _ 宣0 口是 最 u g u o 。 Z 雌 們 _ 1 ， u 0 是 8 g 2j 0 。 Z 維普資訊 圈 高脂肪 酸 的產(chǎn)量 就得 調(diào) 控代 謝 流 在 菌體 生 長(zhǎng) 、 三 羧 酸 循環(huán)和脂肪酸合成中的分配 ， 在保證 細(xì)胞正常運(yùn)轉(zhuǎn) 的 情況下將流人三羧酸循環(huán)的代謝流降到最低 ， 而將 流 人脂 肪 酸合成 的代謝 通量 調(diào)至最 高 。因此 如何 限制 三 羧酸循 環(huán) 的活性 、 引 導(dǎo)代 謝 流 向脂 肪 酸 合 成遷 移 是 調(diào) 控花生 四烯 酸發(fā) 酵 的重 點(diǎn) 。 4 3 刪 Bi o S s Lip i d s l288 5 結(jié) 論 圖 5 4 8 h時(shí)點(diǎn)的代謝 流分 布 Fi g 5 Fl u x di s t r i b ut i o n at 48 t h h ou r 建 立 了氮源 與葡 萄 糖 雙底 物 限 制 動(dòng)力 學(xué) 模 型 ， 在 此基礎(chǔ)上結(jié)合代謝流分析理論提出了花生四烯酸發(fā)酵 動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型， 并通過非線性最 小二乘法擬 合獲 得參 數(shù) 。該 模 型能 很 好 地模 擬 發(fā) 酵 過 程 ， 并 且 能 很容 易地 獲得 不 同發(fā)酵 時(shí)間 的 代謝 流 分 布 ， 為 指 導(dǎo) 花 生 四烯 酸發(fā) 酵調(diào) 控 、 探 討 代 謝 網(wǎng) 絡(luò) 剛?cè)?節(jié) 點(diǎn) 以 及探 究 代謝機(jī)理提供了依據(jù)。 符號(hào)說明 ： c 。 ： 油脂濃度 ， g L - 。t ： 時(shí)間 ， h c “ 氮源濃度 ， g L _ 。t 延滯期時(shí)間 ， h c ： 葡萄糖濃度 ， g L c ： 菌體濃度( 不包含油脂 ) ， gL K。 ： 油脂形成 動(dòng)力學(xué)常數(shù) ， g L ：最 大比油脂 生成速率 ， h ：菌體 的最大 比生長(zhǎng)速率 ， h r 1 、 r 2 、 r 3 、 ： 反應(yīng)速率 ， m mo l g h K ， a ， 們， 9 1 ， 口 ， ， b ， d： 模型參數(shù) 參 考 文 獻(xiàn) ： 1 C a r l s o n S E L o n g - c h a i n p o l y u n s a t u r a t e d f a t t y a c i d s a n d d e v e lo p me n t o f h u ma n i n f a n t I- j Ac t a P a e d i a t r i c S u p p l e me n t ， 1 9 9 9 ， 8 8 ( 4 3 0 )： 7 2 7 7 明杰等 ： 花生四烯酸發(fā)酵動(dòng)態(tài)代謝通量分析模型 2 0 0 7年一 6霸 E 2 3 Me y d a n i MMo d u l a t io n o f t h e p l a t e l e t t h r o mb o x a n e A 2 a n d a o r t i c p r o s t a c y c l i n s y n t h e s i s b y d i e t a r y s e l e n i u m a n d v i t a mi n E J 3 Bio l Tr a c e El e m Re s ， 1 9 9 2，3 3： 7 9 8 6 3 Va n d e r Z e e L，Ne l e ma n s A，D e n He r t o g AAr a c h i d o n i c a c i d i s f u nc t i o n i n g a s a s e c o n d me s s e n ge r i n a c t i v a t i n g t h e Ca e n t r y p r o c e s s o n H 1 一 hi s t a m ino c e p t o r s t i mu l a t i o n i n DDT1 M F一 2 c e l l s J B i o c h e m J ，1 9 9 5， 3 0 5 ( P t 3 ) ： 8 5 9 8 6 4 4 汪志明 花生 四烯酸生產(chǎn)及應(yīng)用 J 中國食品添加 劑， 2 0 0 1 ， ( 1 ) ： 3 0 3 3 5 3 周蓬蓬 ， 余 龍江 ， 吳元喜 ， 等 高山被孢霉 產(chǎn)花生 四烯酸發(fā)酵 條件 的研究F J 工業(yè)微生物，2 0 0 3 ，3 3 ( 2 ) ： 4 卜4 5 6 S a k u r a d a n i E，Hi r a n o Y，Ka ma d a N，e t a 1 I mp r o v e me n t o f a r a e h i d on i e a c i d p r o du c t ion b y mu t a n t s wit h l o we r n 一 3 d e s a t u r a t io n a c t i v i t y d e r i v e d f r o m Mo r t i e r e l l a a l p i n a 1 S - 4 J Ap p l i e d M i c r o b i o l o g y a n d Bi o t e c h n o l o g y ，2 0 0 4，6 6 ( 3 )： 2 4 3 2 4 8 ， 7 3 Wy n n J P ，R a t l e d g e C E v i d e n c e t h a t t h e r a t e - l i mi t i n g s t e p f o r t he b i o s y n t h e s i s o f a r a c h i d o n i c a c id i n M o r t i e r e l l a a l pi n e i s a t t h e l e v e l o f t h e 1 8：3 t o 2 0：3 e l o n g a s e J Mi c r o b i o l o g y ，2 0 0 0 ， 1 4 6( 9 )： 2 3 2 5 2 3 3 1 8 3 鮑時(shí) 翔， 朱 法科 ， 林煒 鐵 ， 等 花 生 四烯 酸發(fā) 酵過 程 動(dòng)力 學(xué)模 型 J 化工學(xué)報(bào) ，1 9 9 7 ，4 8 ( 3 ) ： 3 0 0 3 0 3 9 B a i l e y J ET o wa r d a s c i e n c e o f me t a b o l i c e n g i n e e r i n g J S c i e n c e ，1 9 9 1 ， 2 5 2( 5 01 3 )： 1 6 6 8 1 6 7 5 1 o 3 Wy n n J P，Ha mi d A A，R a t l e d g e C， e t a 1 B i o c h e mi c a l e v e n t s l e a d i n g t o t h e d i v e r s ion o f c a r bo n i n t o s t o r a g e l i pids i n t h e o l e a g i n o u s f u n g i Mu c o r c i r c i n e l l o i d e s a n d Mo r t i e r e l l a a l p i n e J Mi c r o b i o l o g y，2 0 01 ， 1 4 7( 1 0 )： 2 8 5 7 2 8 6 4 1 1 3貢國鴻 ，尚耘 ， 高 翔， 等微 生物 發(fā)酵 法 生產(chǎn) 花生 四烯 酸油 脂 J 中國油脂 ，2 0 0 2 ， 2 7 ( 1 ) ： 4 3 4 4 1 2 3 黃和 ， 李學(xué)坤 ， 張 昆 ， 等應(yīng)用尿素包 合法提 純花生 四烯 酸 J 化學(xué)與生物工程 ， 2 0 0 6 ，2 3 ( 4 ) ： 2 9 3 1 1 3 3 Go r i n P A， B e r g t e r J B T h e p o 1 y s a c c h r i d e s J Ne w Y o r k ； Ac a d e mi c P r e s s ， 1 9 8 3： 4 1 2 - 49 0 1 4 L u e d e k in g R， P i r e t E I A k i n e t i c s t u d y o f l a c t i c a c i d p r o d u c t i o n c ou p l i n g f o r La c t o b a c i l l u s h e l v e t i c u s c u l t i v a t e d o n s u p p l e me n t e d wh e y ： I n f l u e n c e o f p e p t i d i c n i t r o g e n d e f i c i e n c y J J B i o c h e m M i c r o b i o l Te c h n o l En g，1 9 5 9，1 ( 4) ：3 9 3 41 3 1 5 3 馬正飛， 殷翔 數(shù)學(xué)計(jì)算方法與 軟件 工程應(yīng)用 M 北京 ： 化學(xué)工 業(yè) 出 版 社 ， 2 0 0 2 ：1 3 7 - 1 7 1 Dy na mi c Fl u x An a l y s i s M o d e l f o r Ar a c hi d o ni c Ac i d Fe r me n t a t i o n J I N Mi n g - j i e ， HU A NG He ， L I U X i n ， R E N L u - j i n g ，Z HA N G Ku n ( C o l l e g e o f L i f e S c i e n c e a n d Ph a r ma c e u t i c a l En g i n e e r