臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)-臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn).pptx

第四篇 臨床免疫學(xué)與檢驗(yàn),吉普塞舞神,第一章 概述,免疫應(yīng)答的過(guò)程 1、識(shí)別階段：巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞對(duì)外來(lái)抗原或自身變性抗原 進(jìn)行識(shí)別、攝取、降解和遞呈抗原信息給t輔助細(xì)胞 （thc）及相關(guān)淋巴細(xì)胞的過(guò)程。 2、活化階段：b細(xì)胞接受抗原刺激后活化、增殖、分化為漿細(xì)胞； t細(xì)胞在接受抗原刺激和協(xié)同刺激雙信號(hào)后活化、增殖、 分化為效應(yīng)細(xì)胞。 3、效應(yīng)階段：漿細(xì)胞分泌特異性抗體，執(zhí)行體液免疫功能；t細(xì)胞中 的th細(xì)胞分泌細(xì)胞因子等效應(yīng)分子，t殺傷細(xì)胞執(zhí)行細(xì) 胞毒效應(yīng)功能。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫系統(tǒng)由免疫器官、免疫細(xì)胞、免疫分子組成。 （一）中樞免疫器官 1、骨髓：造血干細(xì)胞（hsc）分化、發(fā)育、成熟 2、胸腺：t細(xì)胞發(fā)育的重要中樞器官 （二）外周免疫器官及組織 1、淋巴結(jié) 2、脾：最大的外周淋巴器官 3、粘膜伴隨的淋巴組織：如扁桃體、小腸的派氏集合淋巴結(jié)、闌尾 淋巴細(xì)胞再循環(huán)與歸巢 淋巴細(xì)胞在體內(nèi)依靠歸巢受體由定居地經(jīng)淋巴循環(huán)及血液循環(huán)不斷往返于外周免疫器官、二級(jí)淋巴組織及全身器官組織、淋巴循環(huán)匯集于胸導(dǎo)管，經(jīng)上腔靜脈進(jìn)入血液循環(huán)。 血液循環(huán)中的淋巴細(xì)胞及各類免疫細(xì)胞在毛細(xì)血管后微靜脈處穿越高壁內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)入淋巴組織及淋巴器官，再次進(jìn)入淋巴循環(huán)。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫細(xì)胞 （一）淋巴細(xì)胞 1、t細(xì)胞：胸腺依賴淋巴細(xì)胞；約占淋巴細(xì)胞的70%75%。 t細(xì)胞受體（tcr）：又稱t細(xì)胞抗原受體，是t細(xì)胞特有的表面標(biāo)志。t細(xì)胞識(shí)別抗原和轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)是由tcr特異識(shí)別mhc分子遞呈的抗原肽，cd3分子轉(zhuǎn)導(dǎo)t細(xì)胞活化的第一信號(hào)。 簇分化抗原（cd）：t細(xì)胞發(fā)育不同階段的亞群存在不同的分化抗原，這是區(qū)分t淋巴細(xì)胞的重要標(biāo)志。 2、b細(xì)胞：骨髓依賴性淋巴細(xì)胞，約占淋巴細(xì)胞的5%25%。 主要功能：產(chǎn)生抗體、遞呈抗原、分泌細(xì)胞因子參與免疫調(diào)節(jié)。 b細(xì)胞受抗原刺激后可分化為產(chǎn)生抗體的漿細(xì)胞和長(zhǎng)壽記憶細(xì)胞。 3、自然殺傷細(xì)胞（nk） nk細(xì)胞無(wú)需抗原刺激，可非特異直接殺傷腫瘤和病毒感染的細(xì)胞，因此在免疫監(jiān)視和早期抗感染免疫過(guò)程中起重要作用?；罨痭k細(xì)胞可分泌ifn和tnf等細(xì)胞因子，參與免疫調(diào)節(jié)作用。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫細(xì)胞 （二）免疫輔助細(xì)胞 1、單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng) 共同特點(diǎn)是表達(dá)mhc類分子及具有吞噬作用。 2、樹突狀細(xì)胞 專職抗原遞呈細(xì)胞,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子 （一）免疫球蛋白 分泌型（sig）：主要存在于體液中，具有抗體的各種功能。 膜型（mig）：表達(dá)于b細(xì)胞表面，稱為膜表面免疫球蛋白，為抗原 受體。 化學(xué)結(jié)構(gòu)：2條重鏈（h）和2條輕鏈（l）以二硫鍵連接在一起。 v-可變區(qū)；c-恒定區(qū) 按照體內(nèi)含量的多少分為：igg、iga、igm、igd、ige ig的輕鏈分為鏈和鏈，一個(gè)天然ig分子的兩條輕鏈相同。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子 （一）免疫球蛋白 1、igg：血清中含量最高的免疫球蛋白，是再次應(yīng)答的主要抗體， 也是唯一能通過(guò)胎盤的抗體。大多數(shù)抗菌抗體、抗病毒抗 體都是igg，某些自身抗體及超敏型抗體也是igg，免疫 檢測(cè)中第二抗體也以igg為主。 2、iga：大部分血清型ig為單體；分泌型siga為二聚體。每一個(gè)siga 分子含一個(gè)j鏈和一個(gè)分泌片。siga性能穩(wěn)定，主要存在于 胃腸道、支氣管分泌液、初乳、唾液、淚液中，是參與黏 膜局部免疫的主要抗體。 3、igm：五聚體，ig分子中最大的，主要存在于血液。是個(gè)體發(fā)育 最早合成的抗體，也是抗原刺激后最先產(chǎn)生的抗體。感 染過(guò)程中igm水平升高，說(shuō)明近期感染；新生兒臍血中若 igm增高，說(shuō)明有宮內(nèi)感染。 4、igd：作用不明，b細(xì)胞膜上的igd可作為b細(xì)胞分化成熟的標(biāo)志。 5、ige：?jiǎn)误w結(jié)構(gòu)，血清中最少。親細(xì)胞抗體，介導(dǎo)型超敏反應(yīng)， 在特異性過(guò)敏反應(yīng)和寄生蟲早期感染患者血清中可升高。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子 （二）補(bǔ)體系統(tǒng) 補(bǔ)體是存在于人和脊椎動(dòng)物正常新鮮血清及組織液中的一組具有酶樣活性的球蛋白。 補(bǔ)體的大多數(shù)組分都是糖蛋白，多屬于球蛋白。 含量最高的補(bǔ)體：c3、c4 含量最低的補(bǔ)體：c2 補(bǔ)體性質(zhì)不穩(wěn)定，加熱56、30min可使血清中絕大部分補(bǔ)體組分喪失活性，稱為滅活。 補(bǔ)體的激活途徑： 1、經(jīng)典途徑：以結(jié)合抗原后的igg或igm類抗體為主要激活劑，補(bǔ)體 c1c9共11種成分全部參與了激活途徑。 2、替代途徑：又稱旁路途徑。病原微生物等細(xì)胞壁成分提供接觸面 直接激活補(bǔ)體c3，然后完成c5c9的激活過(guò)程。激活 物主要是細(xì)胞壁成分。 3、mbl途徑：由急性炎癥期產(chǎn)生的甘露糖結(jié)合凝集素（mbl）與病 原體結(jié)合后啟動(dòng)激活。 補(bǔ)體既可參與機(jī)體的防御效應(yīng)和自身穩(wěn)定，亦可引起免疫損傷。,吉普塞舞神,第一章 概述,免疫分子 （三）細(xì)胞因子 免疫細(xì)胞分泌的多肽或小分子蛋白質(zhì)。 通過(guò)自分泌、旁分泌、內(nèi)分泌的方式發(fā)揮作用。 按生物學(xué)功能分：白細(xì)胞介素、干擾素、生長(zhǎng)因子、趨化因子家族、 腫瘤壞死因子、集落刺激因子。 細(xì)胞因子受體分：免疫球蛋白基因超家族、i型細(xì)胞因子受體家族、 型細(xì)胞因子受體家族、型細(xì)胞因子受體家族、 趨化性細(xì)胞因子受體家族。 （四）黏附分子 黏附分子（cam）是介導(dǎo)細(xì)胞間或細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間相互結(jié)合和黏附作用的小分子多肽或糖蛋白。以受體-配體的結(jié)合形式發(fā)揮作用。參與機(jī)體免疫應(yīng)答、炎癥發(fā)生、凝血、創(chuàng)傷愈合和腫瘤轉(zhuǎn)移等病理生理過(guò)程。 （五）cd抗原 人類白細(xì)胞分化抗原（hla）是指血細(xì)胞在分化成熟及活化過(guò)程中，出現(xiàn)或消失的細(xì)胞表面標(biāo)記分子。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),一、抗原抗體反應(yīng)的原理 抗原抗體是一種非共價(jià)結(jié)合、不形成共價(jià)鍵。 1、靜電引力；2、范德華力；3、氫鍵結(jié)合力； 4、疏水作用力：是這些結(jié)合力中最強(qiáng)的。 親和性：是指抗體分子上一個(gè)抗原結(jié)合點(diǎn)與對(duì)應(yīng)的抗原表位之間相 適應(yīng)而存在的引力，它是抗原抗體間固有的引力。 親和性用平衡常數(shù)k來(lái)表示，k值越大，親和性越強(qiáng)，結(jié)合越牢固。 抗體是球蛋白，溶解在水中為膠體溶液，不會(huì)發(fā)生自然沉淀。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),二、抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 1、特異性； 2、可逆性：親和層析法就是利用這個(gè)原理來(lái)純化抗原或抗體。 3、比例性：只有當(dāng)抗原抗體分子比例合適時(shí)充分結(jié)合，沉淀物形 成快而多，稱為抗原抗體反應(yīng)的等價(jià)帶； 若抗原或抗體極度過(guò)剩則無(wú)沉淀形成，稱為帶現(xiàn)象， 抗體過(guò)量時(shí)，稱為前帶，抗原過(guò)量時(shí)，稱為后帶。 4、階段性：第一階段為抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合的階段，反應(yīng)快； 第二階段為可見反應(yīng)階段，反應(yīng)慢。,吉普塞舞神,第二章 抗原抗體反應(yīng),三、影響抗原抗體反應(yīng)的因素 抗體的濃度、特異性和親和性都影響抗原抗體的反應(yīng)。等價(jià)帶的寬窄也影響抗原抗體復(fù)合物的形成，單克隆抗體不適于沉淀反應(yīng)。 顆粒性抗原出現(xiàn)凝集反應(yīng)； 可溶性抗原出現(xiàn)沉淀反應(yīng)； 單價(jià)抗原與相應(yīng)抗體結(jié)合不出現(xiàn)沉淀反應(yīng)。 環(huán)境因素 1、電解質(zhì)：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合后，由親水膠體變?yōu)槭杷z體， 此過(guò)程需要電解質(zhì)參加，常用0.85%nacl。 2、酸堿度：一般在ph 69之間。 3、溫度：一般以1540為宜。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,免疫原：指能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體或致敏淋巴細(xì)胞，并能在體內(nèi)外與 抗體或致敏淋巴細(xì)胞發(fā)生特異性反應(yīng)的物質(zhì)。 一、顆粒型抗原的制備 各種細(xì)胞、細(xì)菌、寄生蟲等皆為顆粒型抗原 1、細(xì)胞抗原（如綿陽(yáng)紅細(xì)胞）一般情況下經(jīng)生理鹽水或其他溶液洗凈，配置一定濃度即可。 2、細(xì)菌抗原多用液體或固體培養(yǎng)基，經(jīng)集菌后處理。 顆粒性抗原大多用靜脈內(nèi)注射免疫法。 二、可溶性抗原的制備與純化 蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、酶、補(bǔ)體、細(xì)菌毒素、免疫球蛋白片段、核酸等。 胃蛋白酶或胰酶處理，可獲得游離的單個(gè)細(xì)胞。 溶菌酶、蝸牛酶、纖維素酶等使細(xì)菌或組織裂解。 木瓜酶將igg裂解成2個(gè)fab片段和1個(gè)fc片段； 胃蛋白酶可將igg裂解成f（ab，）2片段及數(shù)個(gè)小片段； 胰蛋白酶可將igg切成不規(guī)則的肽鏈。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,三、半抗原性免疫原的制備 半抗原：某物質(zhì)在獨(dú)立存在時(shí)只具有抗原性而無(wú)免疫原性。 半抗原與蛋白質(zhì)載體或高分子聚合物結(jié)合后才有免疫原性。 載體 1、蛋白質(zhì)類：以牛血白蛋白最常用。 2、多肽聚合物：常用多聚賴氨酸。 3、大分子聚合物和某些顆粒。 半抗原性免疫原的鑒定 一般認(rèn)為至少要20個(gè)以上的半抗原分子連接到一個(gè)載體分子上，才能有效刺激免疫動(dòng)物產(chǎn)生抗體。因此，在半抗原與載體連接后，應(yīng)測(cè)定半抗原與載體的比例。 1、吸收光譜分析法 2、放射性核素標(biāo)記半抗原滲入法,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,免疫佐劑 佐劑的種類 1、化合物，如弗氏不完全佐劑 2、生物制劑，經(jīng)處理改造的細(xì)菌及代謝產(chǎn)物，如卡介苗； 細(xì)胞因子及熱休克蛋白等。 弗氏佐劑分為弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑 弗氏完全佐劑=弗氏不完全佐劑+卡介苗 使用時(shí)加入水溶性抗原并充分乳化，使抗原與佐劑形成油包水乳劑。 佐劑和抗原的比例為1:1。 佐劑的作用 1、改變抗原的物理性狀、延緩抗原降解和排除，從而更有效地刺激免疫系統(tǒng)； 2、刺激單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)，增強(qiáng)其處理和遞呈抗原的能力； 3、刺激淋巴細(xì)胞增殖和分化； 4、致變抗體的產(chǎn)生類型和誘導(dǎo)遲發(fā)型超敏反應(yīng)。,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的制備 含有抗體的血清即抗血清。 抗原來(lái)源與動(dòng)物種屬差異越大，免疫原性越強(qiáng)，免疫效果越好。 r型抗血清：用家兔及其他動(dòng)物免疫產(chǎn)生的抗體，抗原抗體反應(yīng)比 例合適范圍較寬，適于作為診斷試劑。 h型抗血清：用馬等大型動(dòng)物免疫產(chǎn)生的抗體，抗原抗體反應(yīng)比例 合適范圍較窄，一般作為免疫治療。 某些動(dòng)物體內(nèi)有類似物質(zhì)時(shí)，蛋白質(zhì)抗原對(duì)這些動(dòng)物免疫原性極差。 如：ige對(duì)綿羊；胰島素對(duì)家兔；多種酶類對(duì)山羊。,吉普塞舞神,免疫程序 1、免疫原的劑量： 劑量過(guò)大或過(guò)小都有可能產(chǎn)生免疫耐受，在一定劑量范圍內(nèi)，免疫原劑量越大，產(chǎn)生的抗體效價(jià)越高。 2、免疫途徑： 皮內(nèi)、皮下、肌內(nèi)、靜脈、腹腔、淋巴結(jié)等途徑。皮內(nèi)或皮下免疫時(shí)一般采用多點(diǎn)注射。初次免疫一般選擇皮內(nèi)接種，加強(qiáng)免疫和顆粒性抗原一般選擇靜脈注射。寶貴抗原可選擇淋巴結(jié)內(nèi)微量注射。 3、免疫間隔時(shí)間 第1次與第2次免疫間隔時(shí)間以1020天為好，第3次及以后的間隔一般為710天。 采血法 1、頸動(dòng)脈采血法 2、心臟采血法 3、靜脈采血法,第三章 免疫原和抗血清的制備,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的鑒定 1、抗體特異性的鑒定 常用雙向免疫擴(kuò)散法，觀察沉淀線。 2、抗體效價(jià)的測(cè)定 顆粒型抗原-凝集試驗(yàn) 可溶性抗原-雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、elisa等 稀釋方法： 將經(jīng)過(guò)系列稀釋的血清分別與一個(gè)濃度的抗原反應(yīng)； 同時(shí)稀釋抗原和抗血清，分別與不同濃度的抗血清進(jìn)行雙向免 疫擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)（棋盤滴定） 3、抗體純度的鑒定 sds-page、雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)、免疫電泳等 抗血清的保存 短期保存：28； 冷凍：-80-20，分為小包裝，一般保存5年，避免反復(fù)凍融。 真空干燥：510年,吉普塞舞神,第三章 免疫原和抗血清的制備,抗血清的純化 igg類抗體的純化方法有鹽析法、凝膠過(guò)濾法、離子交換層析法、親和層析法。 雜質(zhì)的去除：1、親和層析法 2、吸附劑法,吉普塞舞神,第四章 單克隆抗體與基因工程抗體的制備,雜交瘤技術(shù)：利用聚乙二醇（peg）為細(xì)胞融合劑，使免疫的小鼠脾細(xì)胞與具有體外生長(zhǎng)繁殖能力的小鼠骨髓瘤細(xì)胞融為一體。這種雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，接種于小鼠腹腔積液中即可得到高效價(jià)的單克隆抗體。 小鼠骨髓瘤細(xì)胞：次黃嘌呤鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)化酶（hgprt）或胸腺 嘧啶激酶（tk）的缺陷株 腫瘤細(xì)胞合成dna一般有兩條途徑：一條是生物合成的主要途徑，利用糖和氨基酸合成核苷酸進(jìn)而合成dna，葉酸拮抗物（甲氨蝶呤）可阻斷該途徑；另一條是替代途徑，當(dāng)葉酸代謝受阻時(shí)，細(xì)胞通過(guò)hgprt和tk利用核苷酸的前體合成核苷酸，進(jìn)而合成dna。因此篩選雜交瘤細(xì)胞用hat培養(yǎng)液。 hat培養(yǎng)液：在基礎(chǔ)細(xì)胞培養(yǎng)液內(nèi)添加次黃嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。 細(xì)胞的選擇： 有限稀釋法、顯微操作法、熒光激活細(xì)胞分選儀、軟瓊脂平板法。,吉普塞舞神,第四章 單克隆抗體與基因工程抗體的制備,單克隆抗體的特性： 1、高度特異性 2、高度的均一性和可重復(fù)性 3、弱凝集反應(yīng)和不呈現(xiàn)沉淀反應(yīng) 4、對(duì)環(huán)境敏感性 局限性：?jiǎn)慰寺】贵w反應(yīng)強(qiáng)度不如多克隆抗體 基因工程抗體 1、人源化抗體：減少抗體異源性，利于臨床應(yīng)用。 嵌合抗體：從雜交瘤細(xì)胞里分離出可變區(qū)基因，與人ig恒定區(qū)的基 因連接，表達(dá)鼠-人嵌合抗體。 改型抗體：將人抗體可變區(qū)（v）中互補(bǔ)決定簇（cdr）序列改成鼠 源單抗cdr序列。 2、小分子抗體：可在大腸桿菌等原核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。 3、抗體融合蛋白：指利用基因工程技術(shù)將抗體片段與其他生物活 性蛋白融合得到的產(chǎn)物。 4、雙特異性抗體：兩個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)具有不同的特異性。 5、噬菌體抗體庫(kù)技術(shù)：可以得到完全人源性的抗體，在hiv等病毒 感染和腫瘤的診斷與治療方面有其獨(dú)特的優(yōu)越性。,吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),凝集反應(yīng)是一個(gè)定性或半定量的檢測(cè)方法，將抗體做一系列稀釋，與抗原結(jié)合產(chǎn)生凝集的最高稀釋倍數(shù)作為其效價(jià)或滴度。 兩個(gè)階段：抗原抗體特異性結(jié)合；出現(xiàn)可見的顆粒聚集。 直接凝集反應(yīng) 原理：細(xì)菌、螺旋體和紅細(xì)胞等顆粒性抗原，在適當(dāng)?shù)碾娊赓|(zhì)參與下可直接與相應(yīng)抗體結(jié)合出現(xiàn)凝集。 抗原凝集原 抗體凝集素 1、玻片凝集試驗(yàn)：定性分析，一般用來(lái)鑒定菌種和abo血型測(cè)定。 2、試管凝集試驗(yàn)：半定量，用定量抗原懸液與一系列梯度倍比稀釋的待檢血清混合，保溫靜置后，根據(jù)每管內(nèi)顆粒凝集的程度，判斷待檢血清中有無(wú)相應(yīng)抗體及效價(jià)。 如肥達(dá)試驗(yàn)診斷傷寒、副傷寒； 外斐試驗(yàn)診斷立克次體； 輸血時(shí)的交叉配血試驗(yàn)。,吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),間接凝集反應(yīng) 是將可溶性抗原（或抗體）先吸附于適當(dāng)大小的顆粒性載體表面，然后與相應(yīng)抗體（或抗原）作用，在適宜電解質(zhì)存在的條件下，出現(xiàn)特異性凝集現(xiàn)象。 間接凝集反應(yīng)的類型 1、正向間接凝集反應(yīng)： 可溶性抗原致敏載體，用以檢測(cè)標(biāo)本中待測(cè)抗體的凝集反應(yīng)。 2、反向間接凝集反應(yīng)： 特異性抗體致敏載體，用以檢測(cè)標(biāo)本中待測(cè)抗原的凝集反應(yīng)。 3、間接凝集抑制試驗(yàn)： 先將可溶性抗原（或抗體）與相應(yīng)抗體（或抗原）試劑混合，然后再加入抗原（抗體）致敏的載體顆粒，則能抑制原先的凝集現(xiàn)象，稱為正向（或反向）間接凝集抑制試驗(yàn)。 4、協(xié)同凝集反應(yīng)： 用金黃色葡萄球菌a蛋白（spa）做載體，它能夠與igg的fc段結(jié)合，稱為抗體致敏的顆粒載體。如與相應(yīng)抗原接觸，即出現(xiàn)反向間接血凝抑制試驗(yàn)。可用于細(xì)菌、病毒的直接檢測(cè)。 間接血凝抑制試驗(yàn)載體常用紅細(xì)胞、膠乳顆粒及明膠顆粒,吉普塞舞神,第五章 凝集反應(yīng),明膠凝集試驗(yàn)：血清中含有病毒抗體則呈肉眼可見的粉紅色凝集。廣泛用于hiv-1抗體和抗精子抗體等的檢測(cè)。 自身紅細(xì)胞凝集試驗(yàn) 抗人o型紅細(xì)胞的單克隆抗體能與任何型紅細(xì)胞結(jié)合，但不引起凝集反應(yīng)，這種抗體與另一特異性抗體連接成的雙功能抗體，可用于檢測(cè)標(biāo)本中的抗原。反應(yīng)中的紅細(xì)胞是未經(jīng)致敏的受檢者新鮮紅細(xì)胞，因此反應(yīng)中的標(biāo)本為受檢者的全血?？捎糜趆iv抗體，hbsag的檢測(cè)。 抗球蛋白試驗(yàn) 又稱coombs試驗(yàn)，是檢測(cè)抗紅細(xì)胞不完全抗體的一種有效方法。 包括直接c試驗(yàn)和間接c試驗(yàn)，分別檢測(cè)紅細(xì)胞上的不完全抗體和游離在血清中的不完全抗體。 廣泛應(yīng)用于血液病的檢測(cè)，如自身免疫性溶血性貧血、藥物誘導(dǎo)的貧血、新生兒溶血癥等，還可采用專一特異性的抗球蛋白的血清，如抗igg血清、抗iga或抗igm以及抗補(bǔ)體血清等，分析結(jié)合于紅細(xì)胞上的不完全抗體的免疫球蛋白亞類。,吉普塞舞神,第六章 沉淀反應(yīng),沉淀反應(yīng)：指可溶性抗原與相應(yīng)抗體在特定條件下發(fā)生特異性結(jié)合時(shí) 出現(xiàn)的沉淀現(xiàn)象。 沉淀反應(yīng)的抗原多為蛋白質(zhì)、多糖、血清、毒素等可溶性物質(zhì)。 第一階段：抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合，肉眼不可見，時(shí)間短。 第二階段：形成可見的免疫復(fù)合物，如沉淀線、沉淀環(huán)， 約需幾十分鐘到數(shù)小時(shí)。,吉普塞舞神,液體內(nèi)沉淀實(shí)驗(yàn) 抗原抗體溶液在電解質(zhì)的存在下結(jié)合，形成絮狀沉淀物，這種絮狀沉淀受抗原抗體比例的直接影響，因此常用來(lái)作為測(cè)定抗原抗體反應(yīng)最適比例的方法。 1、抗原稀釋法； 2、抗體稀釋法； 3、方陣滴定法（棋盤滴定法）。 免疫濁度測(cè)定本質(zhì)上屬于液體內(nèi)沉淀反應(yīng)，可進(jìn)行液體中微量抗原、抗體及小分子半抗原定量檢測(cè)。 抗原過(guò)量：形成ic（免疫復(fù)合物）分子小，且會(huì)發(fā)生再解離，濁 度下降，這叫做高劑量鉤狀效應(yīng)。 抗體過(guò)量：ic的形成隨著抗原的增加而增加，抗原抗體最適比例 處達(dá)到高峰，這就是經(jīng)典的海德堡曲線理論。 免疫比濁法的基本原理就是在反應(yīng)體系中保持抗體適當(dāng)過(guò)量。 抗體的選擇：特異性強(qiáng)、效價(jià)高、親和力強(qiáng)，使用r型抗體。 ph6.58.5 使用磷酸鹽緩沖液做反應(yīng)液 增濁劑：聚乙二醇（peg）、吐溫-20,第六章 沉淀反應(yīng),吉普塞舞神,凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 利用可溶性抗原和相應(yīng)抗體在凝膠內(nèi)擴(kuò)散，形成濃度梯度，在抗原抗體濃度比例恰當(dāng)?shù)奈恢眯纬扇庋劭梢姷某恋砭€或沉淀環(huán)。 凝膠支持物：瓊脂、瓊脂糖、葡聚糖、聚丙烯酰胺凝膠等。 1、單向擴(kuò)散試驗(yàn) 在瓊脂內(nèi)混入抗體，待測(cè)抗原從局部向瓊脂內(nèi)自由擴(kuò)散，如抗原和相應(yīng)抗體結(jié)合，形成沉淀環(huán)。 mancini曲線（m曲線）：適用大分子抗原和長(zhǎng)時(shí)間擴(kuò)散（48h）結(jié) 果，沉淀環(huán)直徑的平方與抗原濃度呈線性關(guān)系。 fahey（f曲線）：適用于小分子抗原和較短時(shí)間（24h）擴(kuò)散的結(jié)果， 用半對(duì)數(shù)紙畫線，濃度對(duì)數(shù)與擴(kuò)散環(huán)直徑呈線性關(guān)系。 雙環(huán)現(xiàn)象：出現(xiàn)兩種抗原性相同成分。,第六章 沉淀反應(yīng),吉普塞舞神,凝膠內(nèi)沉淀試驗(yàn) 2、雙向擴(kuò)散試驗(yàn) 讓抗原和抗體雙方都在瓊脂中各自向?qū)Ψ綌U(kuò)散，在比例恰當(dāng)處形成抗原抗體沉淀線，觀察這種沉淀線的位置、形狀以及對(duì)比關(guān)系，可對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定性分析。 平板法是最常用的方法。 抗原或抗體的存在與否以及相對(duì)含量的估計(jì)： 抗原抗體相對(duì)分子量的估計(jì)：擴(kuò)散慢者圈子小，局部濃度大，形成的沉淀線彎向分子量大的一方，如果分子量大致相等，則呈直線。 抗原性質(zhì)的分析：兩條沉淀線相互吻合，說(shuō)明抗體和兩個(gè)抗原的相同表位結(jié)合而沉淀，兩個(gè)抗原相同；沉淀線呈部分相切，說(shuō)明兩個(gè)抗原之間有部分相同；兩條沉淀線交叉而過(guò)，說(shuō)明兩個(gè)抗原完全不同。 抗體效價(jià)的滴定：出現(xiàn)沉淀線最高的抗體稀釋度為該抗體效價(jià)。 抗原或抗體純度鑒定：多條沉淀線說(shuō)明抗體不純。,第六章 沉淀反應(yīng),吉普塞舞神,免疫電泳技術(shù) 1、對(duì)流免疫電泳 實(shí)質(zhì)是將雙向免疫擴(kuò)散與電泳相結(jié)合的定向加速的免疫擴(kuò)散技術(shù)。 抗原帶負(fù)電荷向正極移動(dòng)；抗體在電滲作用下隨水流向負(fù)極。 2、火箭免疫電泳 實(shí)質(zhì)是加速的單向擴(kuò)散試驗(yàn)。 3、免疫電泳 是區(qū)帶電泳與免疫雙擴(kuò)散相結(jié)合的免疫分析技術(shù)。 抗原經(jīng)電泳分區(qū)帶，沿電泳方向挖一平行抗體槽，加入相應(yīng)抗血清做雙向擴(kuò)散，形成弧形沉淀線。 多發(fā)性骨髓瘤患者血清在免疫電泳后，可觀察到異常的m蛋白沉淀弧。 4、免疫固定電泳 電泳加沉淀反應(yīng)技術(shù)，可用于各種蛋白質(zhì)鑒定。 先將待測(cè)樣品做區(qū)帶電泳，覆蓋抗血清，形成抗原抗體復(fù)合物而沉淀。分辨率強(qiáng)，敏感性高，操作周期短，結(jié)果易于分析，目前作為常規(guī)檢測(cè)。 5、交叉免疫電泳 將區(qū)帶電泳和火箭免疫電泳相結(jié)合，可一次同時(shí)對(duì)多種抗原定量。,第六章 沉淀反應(yīng),吉普塞舞神,第七章 放射免疫分析,放射免疫分析（ria） 是以放射性核素標(biāo)記的抗原與反應(yīng)系統(tǒng)中未標(biāo)記抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合特異性抗體為基本原理來(lái)測(cè)定待檢樣品中抗原量的一種分析方法。 免疫放射分析（irma） 是用放射性核素標(biāo)記的過(guò)量抗體與待測(cè)抗原直接結(jié)合，采用固相免疫吸附載體分離結(jié)合與游離標(biāo)記抗體的非競(jìng)爭(zhēng)放射免疫分析法。 常用的放射性核素：125i、131i、3h、14c 放射性碘原子通過(guò)取代反應(yīng)置換被標(biāo)記物分子中酪氨酸或酪胺殘基及組胺殘基上的氫原子。 比較：irma反應(yīng)速率、特異性、靈敏度和檢測(cè)范圍都較ria高。 應(yīng)用：常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等測(cè)定。,吉普塞舞神,第八章 熒光免疫技術(shù),常用熒光色素： 1、異硫氰酸熒光素（fitc）：黃綠色熒光，最常用； 2、四乙基羅丹明（rb200）：橘紅色熒光； 3、四甲基異硫氰酸羅丹明（tritc）：橙紅色熒光； 4、藻紅蛋白（r-re）：橙色熒光。 其他熒光物質(zhì)：某些3價(jià)稀土鑭系元素，其中銪（eu3+）應(yīng)用最廣，其熒光衰變時(shí)間長(zhǎng)，最適合用于時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定。 時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（trfia）：是一種非放射性核素免疫分析技術(shù)，用鑭系元素標(biāo)記抗原或抗體，根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測(cè)量熒光，同時(shí)檢測(cè)波長(zhǎng)和時(shí)間兩個(gè)參數(shù)進(jìn)行信號(hào)分辨，可有效排除非特異性熒光的干擾，極大提高了分析靈敏度。 熒光偏振免疫測(cè)定：利用抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)原理，根據(jù)熒光素標(biāo)記抗原與其抗原抗體復(fù)合物的熒光偏振程度的差異，測(cè)定體液中小分子物質(zhì)的含量。常用fitc標(biāo)記小分子抗原。,吉普塞舞神,第八章 熒光免疫技術(shù),熒光酶免疫測(cè)定：利用酶標(biāo)記抗原或抗體，與待檢物反應(yīng)，借助酶反應(yīng)熒光底物，經(jīng)酶促反應(yīng)生成穩(wěn)定且高效的熒光物質(zhì)，通過(guò)測(cè)定熒光強(qiáng)度確定待檢抗原或抗體的含量。常用堿性磷酸酶alp標(biāo)記。 熒光免疫技術(shù)的應(yīng)用 1、自身抗體檢測(cè)； 2、病原體檢測(cè)； 3、免疫病理檢測(cè)； 4、細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè)。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),酶免疫技術(shù)：在酶標(biāo)抗體（抗原）與抗原（抗體）的特異性反應(yīng)完成后，加入酶的相應(yīng)底物，通過(guò)酶對(duì)底物的顯色反應(yīng)，對(duì)抗原或抗體進(jìn)行定位、定性或定量的測(cè)定分析。 常用酶及其底物 1、辣根過(guò)氧化物酶（hrp）：由無(wú)色的糖蛋白（主酶）和亞鐵血紅素（輔基）結(jié)合而成的復(fù)合物。輔基是酶活性基團(tuán)。 底物：鄰苯二胺（opd）、四甲基聯(lián)苯胺（tmb）應(yīng)用廣泛 2、堿性磷酸酶（ap） 底物：對(duì)硝基苯磷脂酸（p-npp） 3、-半乳糖苷酶（-gal）：因人血中缺乏此酶，以其制備的酶標(biāo)志物在測(cè)定時(shí)不易受到內(nèi)源性酶的干擾，從而提高特異性，被用于均相酶免疫測(cè)定中。 底物：4-muu,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),酶免疫技術(shù)： 1、酶免疫測(cè)定（eia）：用于液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量。 2、酶免疫組織化學(xué)技術(shù)：用于組織切片或其他標(biāo)本中抗原的定位。 均相酶免疫測(cè)定 利用酶標(biāo)志物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變的原理，可以在不將結(jié)合和游離酶標(biāo)志物分離的情況下，通過(guò)測(cè)定標(biāo)記酶的活性的改變而確定抗原或抗體的含量。 異象酶免疫測(cè)定 是目前應(yīng)用最廣泛的一類，分為液相和固相酶免疫測(cè)定兩類。 如elisa。,吉普塞舞神,第九章 酶免疫技術(shù),elisa 三個(gè)必要的試劑：固相的抗原或抗體；酶標(biāo)記的抗原或抗體； 酶反應(yīng)的底物。 抗原測(cè)定： 雙抗體夾心法：常用。 雙位點(diǎn)一步法：針對(duì)抗原上的兩個(gè)不同的抗原決定簇的兩種抗體，一個(gè)用來(lái)包被，一個(gè)用來(lái)酶標(biāo)記。當(dāng)抗原過(guò)量時(shí)可分別結(jié)合固相抗體和酶標(biāo)記抗體，出現(xiàn)鉤狀效應(yīng)。 競(jìng)爭(zhēng)法：針對(duì)只有單個(gè)抗原決定簇的小分子。 抗體測(cè)定： 間接法：固相抗原-待測(cè)抗體-酶標(biāo)抗抗體復(fù)合物。 雙抗原夾心法 競(jìng)爭(zhēng)法：多用于乙型肝炎病毒核心抗體（hbcab）和乙型肝炎病毒e抗體（hbeab）的檢測(cè)。 捕獲法：又稱反向間接法，常用病原體急性感染診斷中的igm抗體。 應(yīng)用：elisa可用于病毒（甲肝、乙肝兩對(duì)半等）風(fēng)疹、皰疹、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核、hp等，也用于各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物等。,吉普塞舞神,第十章 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù),直接化學(xué)發(fā)光劑：1、吖啶酯；2、三聯(lián)吡啶釕 酶促反應(yīng)發(fā)光劑：標(biāo)記酶有hrp和堿性磷酸酶； hrp催化的發(fā)光劑為魯米諾及其衍生物； ap催化的發(fā)光底物為amppo。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-親和素放大技術(shù),生物素（biotin，b）、親和素（avidin，a） 生物素-親和素系統(tǒng)（bas）是一種以生物素和親和素具有的多級(jí)放大結(jié)合特性為基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)，既能偶聯(lián)抗原抗體等大分子生物活性物質(zhì)，又可被熒光素、酶、放射性核素等材料標(biāo)記。 生物素：可以標(biāo)記蛋白質(zhì)氨基、醛基、巰基和核酸。 親和素（av）和鏈霉親和素（sa）是生物素的天然特異性結(jié)合物。 1個(gè)av和sa能結(jié)合4個(gè)生物素分子，因此具有放大效應(yīng)。,吉普塞舞神,第十一章 生物素-親和素放大技術(shù),bas的應(yīng)用 1、bab法：也稱僑聯(lián)親和素-標(biāo)記生物素法（brab），以游離的親和素 作為僑聯(lián)劑，利用親和素的多價(jià)性，將檢測(cè)體系中的抗原-生 物素化抗體復(fù)合物與標(biāo)記生物素連接起來(lái)。 抗原-生物素+親和素+生物素-標(biāo)記 2、abc法：預(yù)先按一定比例將親和素與酶標(biāo)生物素結(jié)合，當(dāng)其與反應(yīng)體 系中的生物素化抗體相遇時(shí)，abc中未飽和的親和素結(jié)合部位 即可與抗體上的生物素結(jié)合。 抗體-生物素+親和素-生物素-酶標(biāo)復(fù)合物 3、ba法：也叫l(wèi)ab法，以標(biāo)記親和素直接與免疫復(fù)合物中的生物素化抗 體連接進(jìn)行檢測(cè)。 酶標(biāo)記-親和素+生物素-抗體 bas用于熒光抗體技術(shù)，通常用ba法，用熒光素直接標(biāo)記親和素。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫測(cè)定,以微孔膜作為固相，固相膜的特點(diǎn)：多孔性、高度吸附抗體或抗原、易于漂洗，可被液體穿過(guò)流出，液體也可通過(guò)毛細(xì)管作用在膜上向前移行。 標(biāo)記物可用酶、彩色乳膠、膠體金、膠體硒等。 常用固相膜：玻璃纖維素膜、尼龍膜、聚偏氟乙烯（pvdf）膜和 硝酸纖維素（nc）膜，最長(zhǎng)用nc膜 免疫金標(biāo)記技術(shù)：標(biāo)志物在配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)。 免疫滲濾實(shí)驗(yàn)（ifa）用于檢測(cè)各種傳染病的抗體和腫瘤標(biāo)志物等。用以檢測(cè)尿液hcg的“金標(biāo)”早孕診斷試劑也已廣泛使用。 結(jié)果：膜中央有清晰的淡紅色或紅色斑點(diǎn)為陽(yáng)性，反之陰性。 免疫層析實(shí)驗(yàn)（ica）：常用膠體金，稱為金免疫層析實(shí)驗(yàn)（gica） 與ifa的不同在于液體的移動(dòng)不是直向穿流，而是基于層析作用的橫流。 結(jié)果：陰性為一條棕紅線條帶；陽(yáng)性為兩條，無(wú)條帶為試劑失效。,吉普塞舞神,第十二章 固相膜免疫測(cè)定,斑點(diǎn)酶免疫吸附實(shí)驗(yàn)（do-elisa）：與elisa不同之處在于載體為蛋白質(zhì)、nc膜，沒作用于底物后形成有色的沉淀物，使nc膜染色。 結(jié)果：陽(yáng)性者在膜上出現(xiàn)肉眼可見的染色斑點(diǎn)，靈敏度比elisa高。 酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（elispot）：體外檢測(cè)特異性抗體分泌b細(xì)胞和細(xì)胞因子分泌t細(xì)胞。檢測(cè)活細(xì)胞。 結(jié)果：陽(yáng)性pvdf膜出現(xiàn)紫色斑點(diǎn)。1個(gè)斑點(diǎn)代表一個(gè)細(xì)胞，靈敏度高。 應(yīng)用非常廣泛： 如移植中排斥反應(yīng)的預(yù)測(cè)，疫苗發(fā)展、th1/th2分析、自身免疫性疾病研究、腫瘤研究、過(guò)敏性疾病研究、感染性疾病研究、抗原決定簇圖譜分析、化合物和藥物免疫學(xué)反應(yīng)的篩選。 免疫印跡法（western blot）：常用多克隆抗體。,吉普塞舞神,第十三章 免疫組織化學(xué)技術(shù),標(biāo)本： 1、活體組織：應(yīng)取材于病變組織及病變與正常組織交織處。 2、各種體液、穿刺液：直接涂片或經(jīng)離心涂片。 3、培養(yǎng)細(xì)胞：?jiǎn)螌蛹?xì)胞直接固定。 固定劑：10%福爾馬林 制片方法 1、冰凍切片：使抗原得到最大限度保存，但形態(tài)保存不佳 2、石蠟切片：研究形態(tài)學(xué)的主要制片方法 常用抗原暴露方法：微波法、高壓鍋法 標(biāo)本的保存：最好直接鏡檢，4干燥可保存1個(gè)月。 但病毒和某些組織抗原標(biāo)本抗原性喪失很快，需-20下保存。,吉普塞舞神,第十三章 免疫組織化學(xué)技術(shù),酶免疫組織化學(xué)技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)（與熒光免疫技術(shù)相比）： 可長(zhǎng)期保存、可用普通光鏡觀察、可觀察組織細(xì)胞的細(xì)微結(jié)構(gòu)、敏感度高。 1、直接法：將酶標(biāo)記在特異抗體上，直接與組織內(nèi)抗原反應(yīng)。 2、間接法：將酶標(biāo)記在二抗上，先將一抗與相應(yīng)的組織抗原結(jié)合， 再連接二抗。應(yīng)用廣泛。 免疫組化中常用的酶及顯色底物 1、hrp：底物為二氨基聯(lián)苯胺（dab），反應(yīng)產(chǎn)物呈棕色。 2、氨基乙基卡巴唑（aec）：反應(yīng)產(chǎn)物呈橘紅色。 3、4-氯-1-萘酚：產(chǎn)物灰藍(lán)色。 廣義的親和組織化學(xué)染色包括： 抗原與抗體；植物凝集素與糖類；生物素與親和素；spa與igg； 陽(yáng)離子與陰離子；配體與受體。,吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測(cè)技術(shù),外周血單個(gè)核細(xì)胞的分離 密度梯度離心 2份6%聚蔗糖蒸餾水+1份34%泛影葡胺生理鹽水，比重為1.0770.002； 作為淋巴細(xì)胞分離液，即ficoll液。 上到下依次為：稀釋的血漿層、單個(gè)核細(xì)胞層、粒細(xì)胞層和紅細(xì)胞層。 淋巴細(xì)胞的分離 利用單核細(xì)胞在37和ca2+存在時(shí)，能主動(dòng)黏附在玻璃、塑料等材料上的特性，從單個(gè)核細(xì)胞懸液中去除單核細(xì)胞，從而獲得淋巴細(xì)胞。也可用percoll分離液法。 分離細(xì)胞的保存 1、短期保存：將細(xì)胞用含10%20%滅活小牛血清的培養(yǎng)液稀釋重懸， 4保存。 2、長(zhǎng)期保存：液氮，加dmso。 活力測(cè)定：臺(tái)盼藍(lán)藍(lán)色，活細(xì)胞不著色，死細(xì)胞呈藍(lán)色。,吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測(cè)技術(shù),淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類 一、t細(xì)胞表面標(biāo)志及其亞群 t細(xì)胞共同的標(biāo)志抗原：cd3 輔助性t細(xì)胞（th）：cd3+cd4+cd8-； 細(xì)胞毒性t細(xì)胞（tc/ctl）：cd3+cd4-cd8+； 調(diào)節(jié)性t細(xì)胞（tr/treg）：cd4+cd25+。 cd2：表達(dá)于全部人t細(xì)胞和nk細(xì)胞，因能與綿陽(yáng)紅細(xì)胞（srbc） 結(jié)合，又稱綿羊紅細(xì)胞受體。 cd3：表達(dá)于全部t細(xì)胞表面，是tcr-cd3復(fù)合物的重要組成部分。 cd4/cd8：表達(dá)cd4的主要是輔助性t細(xì)胞、表達(dá)cd8的主要是細(xì)胞 毒性t細(xì)胞。 其他表面標(biāo)志：致有絲分裂受體 輔助性t細(xì)胞分為：th1、th2 th1主要分泌il-2、ifn-或tnf-等細(xì)胞因子輔助細(xì)胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)，本身具有明顯的細(xì)胞毒作用。 th2主要分泌il-4、il-5、il-6和il-10等細(xì)胞因子輔助體液免疫，參與速發(fā)型超敏反應(yīng)，但本身不具有明顯的細(xì)胞毒作用。 細(xì)胞毒性t細(xì)胞分為：tc1、tc2都有典型的細(xì)胞毒作用。,吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測(cè)技術(shù),淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志及亞群分類 二、b細(xì)胞表面標(biāo)志 b細(xì)胞的重要表面標(biāo)志：膜免疫球蛋白（smig）、fc受體、補(bǔ)體受體、eb病毒受體、小鼠紅細(xì)胞受體。 smig為b細(xì)胞特有，是鑒定b細(xì)胞的可靠指標(biāo)。 smig又稱bcr，mig的主要作用是結(jié)合特異性抗原，故又稱抗原受體。成熟的b細(xì)胞的mig主要為migm和migd。 b細(xì)胞的表面特異cd分子有cd19、cd20、cd21、cd22和cd23等。 b細(xì)胞及其亞群的檢測(cè)是研究自身免疫性疾病及疾病中免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。 三、nk細(xì)胞表面標(biāo)志 nk細(xì)胞典型標(biāo)志：cd3-cd16+cd56+ cd16分子又稱為低親和性igg fc受體，行使針對(duì)靶細(xì)胞的定向非特異性殺傷作用，也即nk細(xì)胞的抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用（adcc）。,吉普塞舞神,第十四章 免疫細(xì)胞的分離及其表面標(biāo)志檢測(cè)技術(shù),其他免疫細(xì)胞 抗原遞呈細(xì)胞（apc） “專職”抗原遞呈細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和b細(xì)胞，它們均可表達(dá)mhc-類分子； “非專職”抗原遞呈細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞和激活t細(xì)胞等。 單核-吞噬細(xì)胞系統(tǒng)（mps）典型表面標(biāo)志是cd14。 dc細(xì)胞的主要特征表面標(biāo)志是cd1a、cd11c和cd83。 免疫細(xì)胞表面標(biāo)志的檢測(cè)方法： 1、抗體致敏花環(huán)法 2、免疫細(xì)胞化學(xué)法 3、免疫熒光法 4、流式細(xì)胞分析法 cd4/cd8比值升高常見于自身免疫性疾?。欢鴆d4/cd8比值降低常見于病毒感染、惡性腫瘤和再障等。,吉普塞舞神,第十五章 免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù),一、淋巴細(xì)胞的功能檢測(cè) 體內(nèi)試驗(yàn)：主要是進(jìn)行遲發(fā)型超敏反應(yīng)，借此間接了解淋巴細(xì)胞對(duì) 抗原、半抗原或有絲分裂原的應(yīng)答反應(yīng)； 體外試驗(yàn)：主要包括淋巴細(xì)胞對(duì)抗原或有絲分裂原刺激后的增值反 應(yīng)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)及淋巴細(xì)胞分泌產(chǎn)物的測(cè)定。 （一）t細(xì)胞功能試驗(yàn) 1、t細(xì)胞增殖試驗(yàn) 體外刺激物：植物血凝素（pha）、刀豆素a、白喉類毒素、破傷 風(fēng)類毒素、白色念珠菌等。 2、t細(xì)胞分泌功能測(cè)定 分別檢測(cè)細(xì)胞因子的含量、生物活性和基因表達(dá)水平。 3、t細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒試驗(yàn) 適當(dāng)?shù)陌屑?xì)胞（腫瘤細(xì)胞）與待檢淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察腫瘤細(xì)胞殺傷情況。 4、體內(nèi)試驗(yàn) 正常機(jī)體對(duì)某種特殊抗原建立了細(xì)胞免疫后，如用相同抗原做皮膚試驗(yàn)，?？沙霈F(xiàn)陽(yáng)性的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。目前臨床上用來(lái)診斷某些病原生物感染（結(jié)核、麻風(fēng)等）和細(xì)胞免疫缺陷等疾病。 結(jié)核菌素皮膚試驗(yàn)；pha皮膚試驗(yàn)用于檢測(cè)機(jī)體的細(xì)胞免疫水平。,吉普塞舞神,第十五章 免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù),（二）b細(xì)胞功能檢測(cè) 1、b細(xì)胞增殖試驗(yàn)：小鼠b細(xì)胞用lps刺激； 人b細(xì)胞用含spa的金黃色葡萄球菌及抗igm抗體刺激。 2、溶血空斑試驗(yàn)： 經(jīng)典溶血空斑試驗(yàn)：檢測(cè)動(dòng)物抗體形成細(xì)胞的功能。 被動(dòng)溶血空斑試驗(yàn)：人抗體形成細(xì)胞產(chǎn)生的ig與srbc上的抗原結(jié)合， 在補(bǔ)體作用下出現(xiàn)溶血反應(yīng)。 3、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)實(shí)驗(yàn)（elispot） 既可檢測(cè)抗體分泌細(xì)胞，又可檢測(cè)抗體分泌量。 4、體內(nèi)試驗(yàn) 常用白喉毒素、破傷風(fēng)毒素、多價(jià)肺炎鏈球菌菌苗等，將適量抗原皮下或肌肉注射免疫，并與免疫前后分別采血，測(cè)定受試者相應(yīng)抗體效價(jià)，判斷b細(xì)胞功能。 （三）nk細(xì)胞活性測(cè)定 nk細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共同培養(yǎng)，觀察腫瘤細(xì)胞的存活情況。 測(cè)定人nk細(xì)胞常用k562細(xì)胞株； 測(cè)定小鼠nk細(xì)胞活性常用yac-1細(xì)胞株。,吉普塞舞神,第十五章 免疫細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù),二、吞噬細(xì)胞功能檢測(cè)技術(shù) （一）中性粒細(xì)胞功能檢測(cè) 1、趨化功能檢測(cè) boyden小室法、瓊脂糖平板法 2、吞噬和殺菌功能測(cè)定 顯微鏡檢查法、溶菌法、nbt還原實(shí)驗(yàn) （二）巨噬細(xì)胞功能檢測(cè) 1、炭粒廓清試驗(yàn) 2、吞噬功能檢測(cè) 3、巨噬細(xì)胞溶酶體酶的測(cè)定 4、細(xì)胞毒作用測(cè)定 5、巨噬細(xì)胞促凝血活性測(cè)定,吉普塞舞神,第十六章 細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附因子的測(cè)定,細(xì)胞因子的本質(zhì)是蛋白質(zhì)或多肽；黏附分子的本質(zhì)是糖蛋白。 常見的測(cè)定方法：分子生物學(xué)測(cè)定基因或mrna； 生物活性測(cè)定； 生物活性測(cè)定法 1、促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞增殖測(cè)定法 常用放射性核素?fù)饺敕ê蚼tt比色法 2、細(xì)胞毒活性測(cè)定法 對(duì)指示細(xì)胞具有破壞作用的細(xì)胞因子，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡，檢測(cè)細(xì)胞死亡數(shù)作為檢測(cè)指標(biāo)，本法常用作tnf等測(cè)定。 3、抗病毒活性測(cè)定 用于ifn等細(xì)胞因子的檢測(cè)。 4、趨化活性測(cè)定法 趨化因子誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞或淋巴細(xì)胞等定向遷移，其誘導(dǎo)遷移的方式包括趨化性和化學(xué)增活性。 趨化性：誘導(dǎo)細(xì)胞由趨化因子低濃度處向趨化因子高濃度處定向移 動(dòng)的特性。采用boyden小室趨化試驗(yàn)測(cè)定。 化學(xué)增活性：指細(xì)胞因子增強(qiáng)細(xì)胞隨機(jī)運(yùn)動(dòng)的能力，采用瓊脂糖小 滴化學(xué)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)測(cè)定。,吉普塞舞神,第十六章 細(xì)胞因子與細(xì)胞黏附因子的測(cè)定,免疫測(cè)定方法 1、elisa法：測(cè)定細(xì)胞因子和可溶性黏附分子。 2、流式細(xì)胞分析：主要檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子和細(xì)胞表面黏附分子。 3、酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（elispot）： 用于類風(fēng)濕因子、ifn-等細(xì)胞因子分泌細(xì)胞的定量測(cè)定。,吉普塞舞神,第十七章 流式細(xì)胞儀分析技術(shù)及應(yīng)用,fcm常用染料有： 異硫氰酸熒光素（fitc）、藻紅蛋白類（pe）、羅丹明 aid檢測(cè)中的應(yīng)用 t淋巴細(xì)胞總數(shù)減少、t細(xì)胞亞群cd4th/cd8tc比例倒置，th/tc1， th細(xì)胞數(shù)量顯著下降，tc細(xì)胞正常，nk細(xì)胞減少或活力下降，b淋巴細(xì)胞處于正常范圍。 自身免疫性疾病相關(guān)hla抗原分析 強(qiáng)直性脊柱炎：外周血hla-b27的表達(dá)及表達(dá)程度與疾病發(fā)生有很 高的相關(guān)性。,吉普塞舞神,第十八章 體液免疫球蛋白測(cè)定,一、血清igg、iga、igm測(cè)定 igg：血清中含量最高的免疫球蛋白，其中igg1最多、igg4最少。 是血液和細(xì)胞外液中的主要抗體，也是機(jī)體再次免疫應(yīng)答的 主要抗體，大多數(shù)抗感染抗體與自身抗體都是igg。 iga：血清型主要以單體形式存在； 分泌型由j鏈連接的二聚體和分泌成分組成。 是參與黏膜局部免疫的主要抗體，分布于胃腸道和支氣管分 泌液、初乳、唾液和淚液中。 igm：五聚體、分子量最大，又稱巨球蛋白，主要存在于血液中。 是個(gè)體發(fā)育中最早合成和分泌的抗體，也是抗原誘導(dǎo)的體 液免疫中最早出現(xiàn)的抗體。 測(cè)定方法：?jiǎn)蜗颦h(huán)狀免疫擴(kuò)散法、免疫比濁法。 臨床意義： 1、igg分子量小、可透過(guò)胎盤，故新生兒血液中igg含量接近成人。 2、3中ig均升高：見于慢性肝臟疾病。 3、igg升高：見于慢性細(xì)菌性感染，如慢性支氣管炎、肺結(jié)核。 4、igm升高：宮內(nèi)感染、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎。 5、sle（系統(tǒng)性紅斑狼瘡）：igg、iga升高。,吉普塞舞神,一、血清igg、iga、igm測(cè)定 單一免疫球蛋白升高： 指患者血清中某一類免疫球蛋白顯著增多，大多在30g/l以上，稱為單克隆蛋白（mp），也叫m蛋白。此類異常增多的免疫球蛋白多無(wú)免疫活性，又稱副蛋白。 見于免疫增殖病，如多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、惡性淋巴瘤、 重鏈病、輕鏈病等。 免疫球蛋白降低： 先天性：見于體液免疫缺陷病和聯(lián)合免疫缺陷病。 獲得性：iga缺乏，易發(fā)生反復(fù)呼吸道感染； igg缺乏，易發(fā)生化膿性感染； igm缺乏，易發(fā)生革蘭氏陰性菌敗血癥。,第十八章 體液免疫球蛋白測(cè)定,吉普塞舞神,第十八章 體液免疫球蛋白測(cè)定,二、血清igd和ige測(cè)定 igd：膜結(jié)合型igd（migd）構(gòu)成b細(xì)胞bcr，是b細(xì)胞成熟的標(biāo)志。 未成熟b細(xì)胞僅表達(dá)migm，成熟b細(xì)胞同時(shí)表達(dá)兩種。 活化的b細(xì)胞或記憶b細(xì)胞migd逐漸消失。 ige：含量最少，主要由黏膜下淋巴組織中的漿細(xì)胞分泌。 ige為親細(xì)胞抗體，可誘發(fā)型超敏反應(yīng)，也和抗寄生蟲有關(guān)。 檢測(cè)方法：elisa 三、尿液及腦脊液ig測(cè)定 1、尿液中ig測(cè)定 正常人尿液中ig含量極微，腎小球?yàn)V過(guò)膜損傷輕微時(shí)，尿液中igg濾出增多；濾過(guò)膜損傷嚴(yán)重時(shí)，分子量較大的igm也開始濾出。 臨床常選用測(cè)定尿液和血液中轉(zhuǎn)鐵蛋白（trf）和igg含量，計(jì)算選擇性蛋白尿指數(shù)（spi），評(píng)估腎小球?yàn)V過(guò)膜的受損程度。 spi0.1：見于微小病變型腎病； spi0.2：見于膜性腎病、膜增殖性腎炎與腎病綜合征。,吉普塞舞神,第十八章 體液免疫球蛋白測(cè)定,三、尿液及腦脊液ig測(cè)定 2、腦脊液ig測(cè)定 臨床上通過(guò)測(cè)定白蛋白商值（qalb），即測(cè)定csf（腦脊液）中白蛋白和血清白蛋白比值來(lái)反應(yīng)血腦屏障受損程度。 商值9，血腦屏障無(wú)受損；915，輕度受損；1533，中度受損； 33100，重度受損；100，完全破裂。 qalb輕度升高，見于急慢性病毒感染； qalb中度升高，見于急性神經(jīng)疏螺旋體??； qalb重度升高，見于化膿性腦膜炎、結(jié)核性腦膜炎等細(xì)菌性感染。 腦脊液igg測(cè)定采用速率散射免疫比濁法，腦脊液采集后應(yīng)離心再 測(cè)定。 四、m蛋白測(cè)定及臨床意義 1、血清蛋白區(qū)帶電泳技術(shù)：篩選m蛋白的經(jīng)典方法。 2、血清免疫球蛋白定量測(cè)定：包括單向免疫擴(kuò)散和比濁法，是檢 測(cè)m蛋白的初篩試驗(yàn)。 3、免疫電泳：鑒定m蛋白的常規(guī)方法。 4、免疫固定電泳：臨床鑒定m蛋白最常用的方法。 利用區(qū)帶電泳和特異性抗血清的免疫沉淀反應(yīng)。,吉普塞舞神,第十八章 體液免疫球蛋白測(cè)定,五、輕鏈測(cè)定及其臨床意義 1、本-周蛋白測(cè)定 方法：化學(xué)法（加熱沉淀法）和免疫法 檢測(cè)本-周蛋白是對(duì)輕鏈病的診斷必不可少的項(xiàng)目。 輕鏈病患者尿中可測(cè)得本-周蛋白，血中反而陰性，因?yàn)榉肿恿啃。瑯O易從腎臟排出。 2、-ig和-ig定量測(cè)定 方法：?jiǎn)蜗蛎庖邤U(kuò)散法和免疫比濁法。 六、冷球蛋白的測(cè)定 冷球蛋白又稱冷免疫球蛋白，一般在-4發(fā)生沉淀，37復(fù)溶。 型：?jiǎn)慰寺±淝虻鞍祝Ｒ奿gg、igm、iga，多見于免疫增生 性疾病，如多發(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥。 型，單克隆混合型冷球蛋白，最常見的組合為igm-igg。多見 于自身免疫性疾病，如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。 型，多克隆混合型冷球蛋白，多見于傳染性單核細(xì)胞增多癥、 病毒性肝炎、鏈球菌感染等感染性疾病。 檢測(cè)冷球蛋白宜在體溫條件下采集和保存靜脈血。,吉普塞舞神,第十九章 補(bǔ)體檢測(cè)及應(yīng)用,補(bǔ)體總活性測(cè)定 以紅細(xì)胞的溶解為指示，以50%溶血為判斷終點(diǎn)，故稱ch50。 通常ch50指基于經(jīng)典途徑的cp-ch50。（classic pathway） 原理：補(bǔ)體最重要的活性是溶細(xì)胞作用，特異性抗體與紅細(xì)胞結(jié)合后可激活補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞表面形成跨膜小孔，使胞外水分滲入，引起紅細(xì)胞腫脹破裂。溶血反應(yīng)對(duì)補(bǔ)體的劑量依賴呈s型曲線，實(shí)驗(yàn)常以50%溶血為終點(diǎn)指標(biāo)，比100%溶血更為敏感，因此稱為補(bǔ)體50%溶血試驗(yàn)（ch50）。 該法主要檢測(cè)的是補(bǔ)體經(jīng)典途徑的溶血活性，所得結(jié)果反應(yīng)補(bǔ)體c1c9等9種成分的綜合水平。如ch50測(cè)定值過(guò)低或完全無(wú)活性，應(yīng)考慮補(bǔ)體缺陷，檢測(cè)補(bǔ)體單個(gè)成分。 臨床意義： 血清補(bǔ)體水平下降： 肝病或營(yíng)養(yǎng)不良引起的蛋白質(zhì)合成不足； sle、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、強(qiáng)直性脊柱炎等自身免疫病活動(dòng)期消耗補(bǔ)體。 細(xì)菌感染，旁路途徑活化消耗補(bǔ)體。 血清補(bǔ)體水平升高： 心肌梗死、甲狀腺炎、大葉性肺炎、糖尿病、妊娠等。,吉普塞舞神,第十九章 補(bǔ)體檢測(cè)及應(yīng)用,單個(gè)補(bǔ)體成分測(cè)定 檢測(cè)指標(biāo)：c3、c4、c1q、b因子、c1酯酶抑制物等 1、免疫溶血法 指示系統(tǒng)：抗原為srbc，抗體為抗srbc的抗體，即溶血素。 檢測(cè)補(bǔ)體的活性。 2、免疫化學(xué)法 待測(cè)血清中的c3、c4與相應(yīng)抗體結(jié)合，反應(yīng)介質(zhì)中的peg可使該復(fù)合物沉淀。 檢測(cè)補(bǔ)體的含量。,吉普塞舞神,第十九章 補(bǔ)體檢測(cè)及應(yīng)用,補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)（cft） 利用補(bǔ)體的溶細(xì)胞作用檢測(cè)各種物理狀態(tài)的抗原抗體測(cè)定。 實(shí)驗(yàn)原理：1、反應(yīng)系統(tǒng)：已知抗原（抗體）與待測(cè)抗體（抗原）； 2、補(bǔ)體系統(tǒng)：多采用豚鼠血清； 3、指示系統(tǒng)：致敏綿陽(yáng)紅細(xì)胞。 第一步：反應(yīng)系統(tǒng)與補(bǔ)體作用； 第二步：指示系統(tǒng)利用剩余補(bǔ)體作用。 結(jié)果：不溶血為補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性；溶血為實(shí)驗(yàn)陰性。 試驗(yàn)中以50%不溶血作為判斷終點(diǎn)。 補(bǔ)體測(cè)定的應(yīng)用 1、診斷梅毒螺旋體感染的華氏反應(yīng)； 2、hla分型的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒試驗(yàn)； 3、抗體形成細(xì)胞定量檢測(cè)的溶血空斑技術(shù)。,吉普塞舞神,第二十二章 感染性疾病與感染免疫檢測(cè),感染性疾病的早期診斷：病原體抗原和宿主抗血清。 igm抗體出現(xiàn)早，消失快，常作為感染的早期診斷指標(biāo)； igg類抗體出現(xiàn)晚，維持時(shí)間長(zhǎng)，是流行病學(xué)調(diào)查的重要依據(jù)。 一、細(xì)菌感染性疾病的免疫檢測(cè) 抗細(xì)胞內(nèi)感染：主要是細(xì)胞免疫； 抗細(xì)胞外細(xì)菌感染：主要是b細(xì)胞介導(dǎo)的體液免疫。 （一）鏈球菌感染 1、鏈球菌 最常用的免疫學(xué)檢查是抗鏈球菌溶血素“o”（aso）檢測(cè)。 aso增高常見于急性咽炎等上呼吸道感染、風(fēng)濕性心肌炎、心包炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和急性腎小球腎炎。 2、豬鏈球菌 實(shí)驗(yàn)室檢查有細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定和免疫學(xué)檢查。以及分子診斷技術(shù)。,吉普塞舞神,一、細(xì)菌感染性疾病的免疫檢測(cè) （二）傷寒沙門菌感染 沙門菌可致多種感染，輕者為自愈性腸胃炎，重者可引起致死性傷寒。 傷寒沙門菌的實(shí)驗(yàn)室診斷主要依賴于免疫學(xué)檢測(cè)方法。 1、肥達(dá)反應(yīng)：血清凝集試驗(yàn) 傷寒沙門菌有菌體o抗原、鞭毛h抗原和表面vi抗原，三者的抗體均為非保護(hù)性抗體。由于o抗原和h抗原的抗原性較強(qiáng)，常用作血清凝集試驗(yàn)。 2、eli