PCR擴增與細胞內DNA半保留復制有何異同.doc

PCR擴增與細胞內DNA半保留復制有何異同有關PCRPCR是高溫解旋體內用的是DNA解旋酶 DNA復制是以自身為模板，邊解旋，邊復制，邊折疊的。自身DNA復制有一個變構問題。PCR是一個一個核苷酸或脫氧核苷酸用酶接上去，再洗脫再接下一個的。形成的是單鏈，而且沒有包裹的蛋白。 PCR 是一個體外過程，他們的酶不同，反應條件也不同，復制產物可以是雙鏈，也可以是單鏈！ PCR是體外擴增DNA的過程所需溫度較高,分三個階段:高溫解鏈,低溫復性,中溫合成,都在50度到95度之間.所需的酶不一樣:PCR用耐熱的TAQ酶.PCR擴增的是特定的序列位于兩個引物之間的那一段DNA.另外,PCR可以復制DNApcr 全稱聚合酶鏈式反應。其基本原理和生物復制一樣，都要引物等。PCR技術的基本原理 類似于DNA的天然復制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補的寡核苷酸引物。PCR由變性-退火-延伸三個基本反應步驟構成：模板DNA的變性：模板DNA經加熱至93左右一定時間后，使模板DNA雙鏈或經PCR擴增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至55左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；引物的延伸：DNA模板-引物結合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA 鏈互補的半保留復制鏈重復循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個循環(huán)需 24分鐘， 23小時就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍。 也可復制RNA呢 單的說,PCR是將少量DNA在細胞外(首先要將DNA從細胞中取出)快速擴增的方法,能在數小時內將DNA擴增百萬倍.樣品的量即使非常少,也能被放大很多倍.DNA復制是在細胞內進行的.像細菌數小時DNA復制幾次差不多了(復制時間同環(huán)境有關,比如有沒有足夠的養(yǎng)料).既然學的就是這個專業(yè),看看專業(yè)的涉及PCR的文章不就了解了,從概念上說PCR和生物自身的DNA復制的區(qū)別很簡單,具體的細節(jié)就復雜了,PCR也不止一種PCR技術 DNA生物復制環(huán)境 體外復制， 加熱，90攝氏度左右 體內，溫和的環(huán)境模板 DNA單鏈 DNA單鏈原料 4種脫氧核糖核苷酸 4種脫氧核糖核苷酸酶 主要是DNA聚合酶 DNA解旋酶，DNA聚合酶， DNA連接酶等各種酶 引物 需要人工合成的引物 自己合成引物成分步驟 變性-退火-延伸 解旋-起始-延伸-結束原則 堿基互補配對原則 堿基互補配對原則PCR是DNA的體外擴增技術. DNA復制是有生命力的細胞在體內 自我復制的過程 ,屬于體內擴增.PCR(聚合酶鏈式反應)原理 PCR是體外酶促合成特異DNA片段的方法，主要由高溫變性、低溫退火和適溫延伸三個步驟反復的熱循環(huán)構成： 即在高溫（95）下，待擴增的靶DNA雙鏈受熱變性成為兩條單鏈DNA模板；而后在低溫（3755）情況下，兩條人工合成的寡核苷酸引物與互補的單鏈DNA模板結合，形成部分雙鏈；在Taq酶的最適溫度（72）下，以引物3端為合成的起點，以單核苷酸為原料，沿模板以53方向延伸，合成DNA新鏈。這樣，每一雙鏈的DNA模板，經過一次解鏈、退火、延伸三個步驟的熱循環(huán)后就成了兩條雙鏈DNA分子。如此反復進行，每一次循環(huán)所產生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模板，每一次循環(huán)都使兩條人工合成的引物間的DNA特異區(qū)拷貝數擴增一倍，PCR產物得以2n的批數形式迅速擴增，經過2530個循環(huán)后，理論上可使基因擴增109倍以上，實際上一般可達106107倍。DNA復制過程:(一)復制的起始 1.螺旋的松弛與解鏈拓撲異構酶-能改變DNA空間構像的酶 作用：DNA復制時松弛超螺旋，以利復制叉的行進及DNA合成，合成后再引向超螺旋。功能：不清楚，可催化體外拓撲異構化反應，拓撲異構酶分兩型。 拓撲異構酶I （topoisomerase- I ）作用：松弛超螺旋，不需ATP, 作用機制：切開環(huán)狀一條鏈、打結與解結原核：拓撲異構酶I對負超螺旋作用正超螺旋 真核：拓撲異構酶I對正、負超螺旋均有作用。 拓撲異構酶-旋轉酶（gyrase）作用：松弛超螺旋，作用機制： 切開環(huán)狀兩條鏈、打結與解結、環(huán)連與解環(huán)連 解鏈酶 （helicase）-復制蛋白rep 作用：ATP供能時，解開DNA雙鏈。 原核：編碼解鏈酶的基因是dnaB。前導鏈結合rep蛋白，隨從鏈結合解鏈酶II、 單鏈結合蛋白（SSB）作用：SSB與解開DNA單鏈結合，保護穩(wěn)定DNA。與新復制DNA單鏈結合，以防其降解。 螺旋松弛與解鏈過程如圖所示 2.引發(fā) 引物酶（primase） 作用：以DNA為模板，自53合成RNA小片段約十幾到幾十個核苷酸， 3末端為-OH。 原核：dnaG基因編碼DnaG蛋白即引物酶。 引發(fā)前體（preprimosome） 由多種蛋白因子組成復合物。 作用：合成RNA引物，沿隨從鏈復制叉的行進方向移動，在不同部位，合成RNA引物。 小結：合成RNA引物，在引物3-OH末段進行DNA片段合成。 二 DNA鏈的延長 反應體系：DNA模板，DNA聚合酶，dNTP，引物，Mg2+ 反應式：DNA+dNTP（DNA）n+1+ppi 真核與原核中DNA聚合酶（DNA polymorase-DNApol）： 有幾種類型，作用方式相同，但各具特性及功能。 1.大腸桿菌DNA聚合酶（3種） pol I：催化53的聚合作用，合成20個核苷酸即離開模板，填充空隙。 35外切酶活性，去除錯誤堿基，有校對作用。 53外切酶活性，去除RNA引物及修正錯誤堿基。 pol II：催化53 DNA合成并具有35外切酶活性，體內功能不清楚。 pol : DNA鏈延長起主要作用，細菌中以1000dNTP/秒進行聚合反應。 35外切酶活性，校對作用，與pol I配合使錯誤率降至10-6。如圖所示 DNA復制的保真性：遵守嚴格的堿基配對規(guī)律。-聚合酶對堿基的選擇功能。聚合酶對錯誤堿基的校讀作用。以上三種作用確保了DNA復制的準確性。 2、真核生物DNA聚合酶 特性與大腸桿菌相似，共五種：、 pol：催化前導鏈及隨從鏈的合成，需增殖細胞核抗原蛋白PCNA的參與。 pol：與引發(fā)酶配合，參與隨從鏈的合成。 RFA（replication factor A）