（動(dòng)物學(xué)專業(yè)論文）原羚屬及羚羊亞科屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究.pdf

浙江大學(xué)碩上學(xué)位論文 a n t i l o p i n a e e x c e p tf o r t h e4 以，f ，。p 8a n dt h e g a 三p ? 拙，t h e c o m p o n e m ( 萋出垂馨鷲寫妾 鬻i l ! 重堇科強(qiáng)垂霄”葷耄l 緩尹毒羹蓼垂譽(yù)! 蠹；l 享i 融瑩差耕墅姜擎薹差孽i i ；盞j 謄薹苧蠶墓訇薹| 冀1 耋爿；l 黼重i 試l 毒 q ；吾壁謄；n 主；謄a ：| 羈| 善j 量囊i 蕾至瑩主h 髫童鶩川j “l(fā) 寫 2 0 循環(huán) f i g 2l d p c r o fl i v e rc d n a m 1 ：九一h i n d i 工王m a r k e r ；m 2 ：d l 2 0 0 0m a r k e r ；l a n e 1 ：2 2 c y c l e s ；l a n e 2 ：2 0c y c i e s x 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 第一部分前言 1 原羚屬物種的生物學(xué)研究概況 原羚屬( p m c 印r d ) 動(dòng)物包括普氏原羚( 尸p r ，口b 脅) 、黃羊( p g “艦加s 口) 和減原羚( p p i c ，托四“砌蜘。分布于中國(guó)、蒙古、錫金和俄羅斯，其中普氏原羚為 我國(guó)特有種，目前僅棲息于青海湖地區(qū)( 蔣志剛等，2 0 0 3 ) 。原羚屬隸屬于?？?羚羊亞科，其地理分布呈現(xiàn)明顯的系統(tǒng)替代現(xiàn)象( 王宗煒等，1 9 6 3 ) 。黃羊是東 蒙草原的典型代表；普氏原羚是荒漠與高原過渡地帶種類；而藏原羚則生活于青 藏高原的草甸。 1 1 生態(tài)學(xué)研究 對(duì)黃羊的生態(tài)學(xué)研究已有較多報(bào)道。張自學(xué)等( 1 9 9 5 ) 和金昆等( 1 9 9 7 ) 報(bào) 道了黃羊在中國(guó)和世界分布?xì)v史的變遷及其種群數(shù)量變化。孫靜萍等( 1 9 9 6 ) 、 高中信等( 1 9 9 6 a ，1 9 9 6 b ) 和關(guān)中明等( 1 9 9 9 ) 詳細(xì)報(bào)道了黃羊的集群行為、 社群行為、遷徙行為和黃羊?qū)⑸车倪x擇。高中信等( 1 9 9 5 ) 對(duì)黃羊的食性 作了研究。李俊生等( 2 0 0 0 a ) 評(píng)價(jià)了黃羊的主要飼料植物和食物營(yíng)養(yǎng)質(zhì)量，并 就呼倫貝爾草原地區(qū)黃羊腎臟重量和腎臟中心脂肪指數(shù)的變化進(jìn)行了研究，初 步評(píng)價(jià)了不同年齡、不同性別組以及不同季節(jié)黃羊體況的差異( 李俊生等， 2 0 0 1 a ) 。趙肯堂( 1 9 8 2 ) 根據(jù)黃羊角年環(huán)外形特征、牙齡生長(zhǎng)狀況和磨損程度， 報(bào)道了黃羊年齡的鑒定方法。姜兆文等( 1 9 9 5 ) 利用最微鑒定的方法，對(duì)趙肯堂 ( 1 9 8 2 ) 的黃羊年齡鑒定方法作了校正。肖前柱等( 1 9 8 2 ) 和姜兆文等( 1 9 9 3 ) 根據(jù)兩種不同的年齡鑒定方法，分別對(duì)黃羊種群結(jié)構(gòu)、種群年齡結(jié)構(gòu)、性比及種 群動(dòng)態(tài)趨勢(shì)作了預(yù)測(cè)，并編制了黃羊的靜態(tài)生命表。 從1 9 9 4 年開始。蔣志剛等利用航片、g m 衛(wèi)星照片、g i s 模型、生境適宜度模 型、種群生存力模型等系統(tǒng)地監(jiān)測(cè)了青海湖地區(qū)普氏原羚種群動(dòng)態(tài)。并就人類活 動(dòng)、土地覆蓋變化以及草地初級(jí)生產(chǎn)對(duì)普氏原羚種群生存力的影響：普氏原羚棲 息地選擇、生境適宜度和活動(dòng)規(guī)律；普氏原羚生境中的食物網(wǎng)；普氏原羚采食對(duì) 策及其與綿羊的食物競(jìng)爭(zhēng)問題；狼捕食對(duì)普氏原羚生存的影響；草原圍欄與普氏 原羚保護(hù)、草原生物多樣性保護(hù)及普氏原羚社群行為和群體結(jié)構(gòu)的時(shí)空動(dòng)態(tài)等 等，進(jìn)行了系統(tǒng)研究( 蔣志剛等，2 0 0 3 ) 。 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 迄今，有關(guān)藏原羚的生態(tài)學(xué)研究報(bào)道較少，魯慶彬( 2 0 0 3 ) 作了一簡(jiǎn)要的形 態(tài)特征和數(shù)量分布描述，張洪茂等( 2 0 0 2 ) 利用數(shù)量化理論作過川西北藏原羚夏 季生境選擇的研究，認(rèn)為藏原羚的最適攝食生境為隱蔽條件較好，離水源較近的 草甸草原。 1 2 生理生化及分子生物學(xué)研究 東北林業(yè)大學(xué)的學(xué)者對(duì)黃羊的胃腸消化道器官作了較為詳盡的報(bào)道。李俊生 等( 2 0 0 1 b ) 研究了黃羊消化道內(nèi)7 個(gè)部位f 瘤胃、網(wǎng)胃、瓣胃、皺胃、小腸、盲 l 腸和直腸) 食物粒徑分布規(guī)律。馬建章等( 2 0 0 1 ) 從5 l 副黃羊消化道形態(tài)結(jié)構(gòu)特 征得出黃羊?qū)儆诨祜曊?。鄒琦等( 1 9 9 9 ) 通過石蠟切片法對(duì)成年健康黃羊胃腸進(jìn) 行了組織形態(tài)學(xué)觀察。李俊生等( 2 0 0 0 b ) 對(duì)5 1 頭黃羊胃形態(tài)結(jié)構(gòu)特征作了系統(tǒng) 研究。沈明華( 2 0 0 2 ) 對(duì)普氏原羚的1 0 項(xiàng)血液生理生化指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，發(fā)現(xiàn)普 氏原羚紅細(xì)胞、紅細(xì)胞壓積、血紅蛋白顯著地高于低海拔地區(qū)的綿羊和山羊；但 其它大部分指標(biāo)同黑羚羊、綿羊和山羊基本相近。 在基因水平上，此屬物種的研究較少。g a t e s y ( 1 9 9 7 ) 通過形態(tài)學(xué)和r d n a 數(shù)據(jù)藏原羚作了屬間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系探討，k u 紐d s o v a ( 2 0 0 2 ) 通過1 2 sr r n a 和 1 6 sd 礬a 數(shù)據(jù)對(duì)黃羊作過屬級(jí)間系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。g a t e s y 認(rèn)為原羚屬( 僅藏 原羚) 應(yīng)歸屬于羚羊亞科羚羊族( a n 廿1 0 p i n i ) 。而k u e n e t s o v a 的結(jié)果與經(jīng)典分類較 為相悖，認(rèn)為原羚屬( 僅黃羊) 與羚羊亞科島羚族( n ，e o t r a g i m ) 犬羚屬( 缸如q 凇) 親緣關(guān)系最近，它們聚為單系群。l e i 等( 2 0 0 3 a ) 通過1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 數(shù) 據(jù)得出普氏原羚不是藏原羚的一個(gè)亞種，普氏原羚與黃羊的分類親緣關(guān)系較與減 原羚的親緣關(guān)系近；黃羊不能成為獨(dú)立屬。另外，l e i 等( 2 0 0 3 b ) 分析了2 9 個(gè)采 自四個(gè)種群普氏原羚線粒體d n ad 1 0 0 p 控制區(qū)序列，測(cè)定了孤立普氏原羚種群間 遺傳差異，探討了醬氏原羚分子地理系統(tǒng)學(xué)，提出保護(hù)進(jìn)化顯著單元。 1 3 系統(tǒng)學(xué)研究 原羚屬屬級(jí)和屬內(nèi)各物種的分類進(jìn)化地位歷來爭(zhēng)論較多( g r o v e s ，1 9 6 7 ) 。 s o k o l o v ( 1 9 5 3 ) 根據(jù)眶下凹窩退化過渡特征認(rèn)為原羚屬( p 加c 印m ) 雖然與羚 羊?qū)? g 船p 拋) 有明顯差異，但只是亞屬差異，鵝喉羚( g j “6 刪”“陽鯽為二者的中 間類型，原羚屬應(yīng)為羚羊?qū)俚膩唽佟＝^大多數(shù)學(xué)者基于它們頭骨、角形、毛色和 7 浙江大學(xué)碗士學(xué)位論文 齒系特征，認(rèn)為原羚屬物種為非典型羚羊，它們應(yīng)作為獨(dú)立屬一原羚屬，并認(rèn)為 原羚屬包含三個(gè)種即減原羚、普氏原羚和黃羊( 劉明玉等，2 0 0 0 ；s i m 口s o n ，1 9 4 5 ； g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。但有人根據(jù)黃羊與普氏原羚及藏原羚之間的形 態(tài)差異較大，將黃羊列為黃羊?qū)?尸加如陀娜)，將普氏原羚和藏原羚列為原羚屬 ( p o c o c k ，1 9 1 8 ；劉明玉等，2 0 0 ! 蠹g e ? ；二t 鯉；i j 如掣勺晦暗罐凄舄強(qiáng)捌 滔澀懋蓮瀅噔壅 鯽酗? 董i i i 耋ji l l l ? ：螽l ! 二蠹篷相隼否醯| 霉一l i 塞i ! l l l 萎 上耋! ；主堂；i l | ll 孽一辱荊丑裂川型硼秫分拂序飄n 皺再蜂。姜 蕈i 翻l 垂| ；礦 藁荔川。t ：i l ；| 珥罐浸心瑤理增芝京警量螽明盼 ，鰓醴 批發(fā)商和零 售商也同樣在選擇制造商?！啊背菑S家真的信譽(yù)卓著、又能給中間商留出足夠的 利潤(rùn)空間，否則決不會(huì)期望到有良好資質(zhì)的中間商主動(dòng)上門要求代理其產(chǎn)品的。 所以，公司必須將服務(wù)和營(yíng)銷渠道功能分成一個(gè)個(gè)獨(dú)立的元素，從而為目標(biāo)顧客 提供正確的服務(wù)及營(yíng)銷渠道組合“”。廠商必須首先明白，且想辦法讓中間商明 白，雙方的合作是愉快的和互利的，讓即將成為渠道成員的中間商在加入之前就 知道“加入后到底可以獲得哪些益處? ”：讓已成為渠道成員的經(jīng)銷商切實(shí)感覺 到合作有利可圖，而且身心愉悅，才會(huì)奠定中間商的忠誠(chéng)。即： 提供品質(zhì)優(yōu)良、銷路旺盛、利潤(rùn)豐厚的豐富的產(chǎn)品線，并從經(jīng)銷商的利益 出發(fā)，使之充分認(rèn)識(shí)到經(jīng)銷公司產(chǎn)品的利益所在的重要性。 提供強(qiáng)有力的如廣利益出發(fā)，使之充分認(rèn)識(shí)到經(jīng)銷公司產(chǎn)品的利益所在的重要性。 提供強(qiáng)有力的如廣告津貼、購物指南宣傳資料、展示會(huì)等廣告促銷支持顯x 浙江大學(xué)碗士學(xué)位論文 齒系特征，認(rèn)為原羚屬物種為非典型羚羊，它們應(yīng)作為獨(dú)立屬一原羚屬，并認(rèn)為 原羚屬包含三個(gè)種即減原羚、普氏原羚和黃羊( 劉明玉等，2 0 0 0 ；s i m 口s o n ，1 9 4 5 ； g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。但有人根據(jù)黃羊與普氏原羚及藏原羚之間的形 態(tài)差異較大，將黃羊列為黃羊?qū)? 尸加如陀娜) ，將普氏原羚和藏原羚列為原羚屬 ( p o c o c k ，1 9 1 8 ；劉明玉等，2 0 0 0 ；g r o v e s ，2 0 0 0 ) ，且認(rèn)為黃羊?qū)偈墙橛谠?屬和羚羊?qū)俚闹虚g類型。a 1 1 e n ( 1 9 4 0 ) 、e 1 l e n n a l l 和m o r r i s o n s c o t t ( 1 9 5 1 ) 以 及k i e i s c h m i d t ( 1 9 6 1 ) 曾一度將普氏原羚劃為是藏原羚的一個(gè)亞種。p o u s a r g u e s ( 引 白g r o v e s ，1 9 6 7 ) 則認(rèn)為普氏原羚是藏原羚和鵝喉羚的雜交種。但g r o v e s ( 1 9 6 7 ) 對(duì)比研究了有關(guān)動(dòng)物標(biāo)本館館藏的普氏原羚標(biāo)本的形態(tài)特征，確定普氏原羚為一 個(gè)獨(dú)立的種。另外，根據(jù)普氏原羚與藏原羚在青藏高原同域分布，人們普遍認(rèn)為 普氏原羚與減原羚的分類親緣關(guān)系較普氏原羚與黃羊的親緣關(guān)系近( 蔣志剛等， 2 0 0 3 ) 。 2 研究的目的和意義 根據(jù)原羚屬屬內(nèi)各物種和羚羊亞科各屬間形態(tài)分類地位的混亂，分子數(shù)據(jù)在 屬級(jí)分類上的爭(zhēng)議和屬內(nèi)背景資料的缺乏之現(xiàn)狀。本文利用進(jìn)化速度較快、序列 長(zhǎng)度高度保守和易于同源比對(duì)的線粒體d n a ( m t d n a ) 細(xì)胞色素b ( c y t o c l l r o m e b ) 基因這一分子標(biāo)記( i n v i n ，1 9 9 1 ；h a s s a l l i n ，1 9 9 9 ) ，對(duì)原羚屬屬內(nèi)物種及羚 羊亞科各屬之間發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究。 期望通過本研究，闡明原羚屬及羚羊亞科各屬物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，這 對(duì)于日后羚羊亞科分類地位確定，重建?？屏缪騺喛葡到y(tǒng)發(fā)育樹具有重要的理論 意義。 8 浙江大學(xué)碩上學(xué)位論文 第二部分材料與方法 1 材料 1 1 樣品 自四川省和內(nèi)蒙古采集到藏原羚( 戶p f c 咖口姚f d ) 、斑羚( p m 口砌以p 如s c d “如f “s ) 、鬣羚( c ( p r f c d r ”括c r 如p “5 ) 和黃羊( p g “f m 加j d ) 樣品1 3 份，其中， 藏原羚3 份、斑羚2 份、鬣羚5 份、黃羊3 份。采集地點(diǎn)、時(shí)間和樣品類型見 表l 。 表l 樣品信息一覽 t 曲l el s u m m a r yi n 如m a t i o no nt h es a m p l e su s e dj nt h i ss t u d y 物種樣品數(shù)采樣地點(diǎn)樣品類型觀察資料采樣時(shí)間 s p e c i e sn o o f s a m 口l e ss a m p m 喂s i t e t i s s u es a m p l eo b s e r v a t j o n s s a m p l i n gy e a r 藏原羚3四川木里皮膚野生 1 9 9 9 鬣羚 l 四川青川皮膚野生 1 9 9 9 4 四川木里皮膚野生 1 9 9 9 斑羚l四川木里皮膚野生1 9 9 9 l四川稻城皮膚野生1 9 9 9 黃羊3內(nèi)蒙古滿洲里肌肉野生1 9 9 4 1 2 試劑 t 如d n a 聚合酶、e xt 細(xì)d n a 聚合酶、瓊脂糖凝膠d 1 q a 回收試劑盒、 p m d l 8 t 載體購自寶生物工程( 大連) 有限公司；其它常規(guī)試劑為進(jìn)口分析純， 購自上海生工生物工程公司：p c r 引物由上海生工生物工程公司合成；測(cè)序由 上海生工生物工程公司和上海博亞生物技術(shù)有限公司完成。 1 3 主要的儀器設(shè)備 p t c 一2 0 0p c r 擴(kuò)增儀( m jr e s e a r c h 公司) ；p e9 6 0 0p c r 擴(kuò)增儀( p e 公司) ； 5 4 1 7 r 高速冷凍離心機(jī)( e p p e n d o r f ) ；5 8 l o r 高速冷凍離心機(jī)( e p p e n d o r f ) ：g e i d o c 2 0 0 0 凝膠成像系統(tǒng)( b i o - r a d ) ；b s2 0 0 s 電子天平( s a n o r i u s ) ；p o w e r p ：a c3 0 0 電泳儀( b i o r a d ) ；u l t r af r e e z e 超低溫冰箱( h e t o ) ：s b d 5 0b i o 恒溫水浴搖床 ( h e t o ) ：n l e n l l o i l l i x e rc o m f o n5 3 5 5 ( e p p e n d o ：v e n t i c e l l “l(fā) r 烘箱( m m m ) ； i n c u c e l ll “r 培養(yǎng)箱( m m m ) ：3 3 1 0 p h m e t e r ( j e n w a y ) ；s s 3 2 5 滅菌柜( t 0 m y ) ； d n a m i n i 真空干燥系統(tǒng)( h e t o ) ：s m 眥s 口e c3 0 0 0 紫外分光光度計(jì)( b i o r a d ) 。 2 方法 9 浙江大學(xué)壩士學(xué)位論文 2 1 d n a 提取 2 1 1 肌肉樣品總d n a 的提取 ( 1 ) 取少量肌肉樣品，液氮下碾碎，然后加入3 7 0 u l 的t n e 緩沖液( 0 1 m n a c l ：1 0 m mt r i s h c l ，p h7 5 ；1 m me d t a p h8 o ) ，1 0 0 u l 的1 0 s d s ，1 0 l 的l o m g m l 蛋白酶k ，2 0 斗l 的1 m o l l 的d t t ，混勻后放入5 6 。c 下消化 至透明。 ( 2 ) 4 0 0 0 r p m m i n 離心5 分鐘，取上清。 e 3 ) 加入等體積的酚，在自動(dòng)混勻器上混勻l o 分鐘，i o o o o r p “m i n 離心1 0 分 鐘，取上清。 ( 4 ) 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，在自動(dòng)混勻器上混勻l o 分鐘，1 0 0 0 0 r p m h i n 離心1 0 分鐘，取上清。 ( 5 ) 重復(fù)以上步驟。 ( 6 ) 加入氯仿：異戊醇( 2 4 ：1 ) ，在自動(dòng)混勻器上混勻1 0 分鐘，1 0 0 0 0 r p 州m i n 離心l 0 分鐘，取上清。 ( 7 ) 在上清中加入1 1 0 體積的3 mn a a c 和2 倍體積的冰無水乙醇，混勻后放 入一2 0 0 c 沉淀3 0 分鐘。 ( 8 ) 1 20 0 0 r p i l l m i n 離心l o 分鐘，棄無水乙醇，再用冷的7 0 乙醇洗滌沉淀。 ( 9 ) 真空干燥，加入1 0 0l l lt e 溶解沉淀。 ( 1 0 ) 紫外分光光度計(jì)測(cè)定濃度和純度后，凍存于一2 0 0 c 備用。 2 1 2 皮膚樣品總d n a 的提取 ( 1 ) 用消毒后的鑷子和剪刀反復(fù)刮皮膚表面，然后剪一小塊放入1 5 m l 離心管 中，用t n e 緩沖液在振蕩器上高速?zèng)_洗2 到3 次。 ( 2 ) 加入s o o u l t n e 緩沖液浸泡2 4 小時(shí)。 ( 3 ) 用消毒后的剪刀剪碎。 ( 4 ) 其它步驟與上同。 2 2 p c r 擴(kuò)增 p c r 引物使用曹麗榮等( 2 0 0 3 ) 改進(jìn)后的?？莆锓Nc y t 山基因全序列特異 性引物，引物序列為：l 1 4 7 2 4 5 g a t a t g a a a a a c c a t c g t t g - 3 和h 1 5 9 1 5 5 c c t t c t c t g g t t t a c a a g a c 一3 1 0 浙江大學(xué)壩士學(xué)位論文 2 1 d n a 提取 2 1 1 肌肉樣品總d n a 的提取 ( 1 ) 取少量肌肉樣品，液氮下碾碎，然后加入3 7 0 u l 的t n e 緩沖液( 0 1 m n a c l ：1 0 m mt r i s h c l ，p h7 5 ；1 m me d t a p h8 o ) ，1 0 0 u l 的1 0 s d s ，1 0 l 的l o m g m l 蛋白酶k ，2 0 斗l 的1 m o l l 的d t t ，混勻后放入5 6 。c 下消化 至透明。 ( 2 ) 4 0 0 0 r p m m i n 離心5 分鐘，取上清。 e 3 ) 加入等體積的酚，在自動(dòng)混勻器上混勻l o 分鐘，i o o o o r p “m i n 離心1 0 分 鐘，取上清。 ( 4 ) 加入等體積的酚：氯仿：異戊醇( 2 5 ：2 4 ：1 ) ，在自動(dòng)混勻器上混勻l o 分鐘，1 0 0 0 0 r p m h i n 離心1 0 分鐘，取上清。 ( 5 ) 重復(fù)以上步驟。 ( 6 ) 加入氯仿：異戊醇( 2 4 ：1 ) ，在自動(dòng)混勻器上混勻1 0 分鐘，1 0 0 0 0 r p 州m i n 離心l 0 分鐘，取上清。 ( 7 ) 在上清中加入1 1 0 體積的3 mn a a c 和2 倍體積的冰無水乙醇，混勻后放 入一2 0 0 c 沉淀3 0 分鐘。 ( 8 ) 1 20 0 0 r p i l l m i n 離心l o 分鐘，棄無水乙醇，再用冷的7 0 乙醇洗滌沉淀。 ( 9 ) 真空干燥，加入1 0 0l l lt e 溶解沉淀。 ( 1 0 ) 紫外分光簍卜戮馴f a 到劁蟊戳i 韓囊謦；i i ；毳氆唾； i j 二j i 給更塹鬻曙謦妻囊至 限制渠道成員出售競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手的產(chǎn)品。 為渠道成員提供其目標(biāo)市場(chǎng)的市場(chǎng)調(diào)查。 培養(yǎng)客戶帶頭人使之成為渠道成員。 提供質(zhì)量好、有穩(wěn)定可觀利潤(rùn)的產(chǎn)品。 訪問顧客，反饋信息。 渠道建立之后，如何維護(hù)自己的渠道網(wǎng)絡(luò)體系，鞏固渠道關(guān)系，建設(shè)忠誠(chéng)于 自己的網(wǎng)絡(luò)體系成為企業(yè)渠道競(jìng)爭(zhēng)的重要內(nèi)容。然而，一個(gè)產(chǎn)品從面世到推出市 場(chǎng)的整個(gè)生命周期過程中，中間商的積極性也表現(xiàn)出不同的變化，要保持渠道的 穩(wěn)定和高效，就必須不斷激勵(lì)中間商。要成功的激勵(lì)渠道成員，就必須盡可能從 渠道關(guān)系中了解渠道成員的需求“，然而無論何種形式的激勵(lì)，核心都是解決 中間商的長(zhǎng)期及短期利益問題。這樣看來，如果能夠協(xié)助中間商盡快將產(chǎn)品送到 一 塑豎查鱟堡主蘭竺堡苧 2 3 4 轉(zhuǎn)化 a 分別取x g a l ( 5 0 m g m 1 ) 2 0 “i ，工p t g ( o 1 m ) 1 0 0 “i 涂布l b 平板( 含l o o 肚g n n l 氨芐青霉素) 。 b 在連接反應(yīng)管中加入l o o “1 感受態(tài)細(xì)胞，輕旋混勻，冰浴3 0 分鐘。 c 4 2 。c 熱激9 0 秒。 d 將管迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻2 分鐘。 e 每管加入4 0 0 肛ls o c 培養(yǎng)基，3 7 。c2 0 0 r p 州m i n 振蕩培養(yǎng)1 小時(shí)。 f 室溫4 0 0 0 r p i l l ，h i n 離心5 分鐘，吸棄4 0 0 u l 上清。 g 吸取余下的轉(zhuǎn)化物，涂布上述平板。 h 3 7 。c 正向放置培養(yǎng)1 小時(shí)。 i 3 7 。c 倒置培養(yǎng)過夜。 2 3 5 篩選 選擇白色菌落，挑至含a m p 的l b 液體培養(yǎng)基中，3 7 。c2 0 0 r p 耐誠(chéng)n 振蕩培 養(yǎng)4 小時(shí)。 2 3 6 鑒定 取上述菌液l 肚l 進(jìn)行p c r 檢測(cè)，反應(yīng)條件如前所述。 2 4 測(cè)序 取鑒定正確的菌液，加入l o m ll b 液體培養(yǎng)基中，3 7 0 c2 0 0 r p 叫m i n 振蕩培 養(yǎng)過夜。然后取1 m l 菌液，送交上海生工生物工程有限公司，用通用引物 ( m 1 3 十m 1 3 一) 進(jìn)行雙向測(cè)序。d n a 自動(dòng)測(cè)序儀型號(hào)為a b ip l u s m3 7 7 9 6 。 2 5d n a 序列數(shù)據(jù)處理分析 搜尋g e n e b a i l k 上所有羚羊亞科物種c ”b 基因全序列，結(jié)合本次羚羊亞科 原羚屬藏原羚和黃羊全部測(cè)序結(jié)果( 各3 個(gè)) ，對(duì)羚羊亞科原羚屬屬內(nèi)物種及羚 羊亞科各屬之間發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究分析。另取本次羊亞科斑羚( 研。砌卯d 協(xié) c 日“婦f “s ) 和鬣羚( c 印r f ，雕fc r 印w ) 測(cè)序結(jié)果( 各1 個(gè)) 及來自g c n e b a n k 的?？破渌鼇喛莆锓N作為外群對(duì)照。共使有3 3 個(gè)物種，4 1 個(gè)個(gè)體，分析物種出 處詳見表2 。同時(shí)根據(jù)牛亞科處于?？葡到y(tǒng)分類的基礎(chǔ)地位( g a t e s y ，1 9 9 7 ： m a t t h e e ，2 0 0 1 ；r e z a ，2 0 0 0 ) ，定義牛( 肋j 婦“阿) 夕 群為根( r o o t ) 。 用m e g a l j 郢軟件( d n a s t a r i l l c ，】9 9 6 ) 對(duì)測(cè)定序列和從g e n e b a l l k 中下載的 2 一 塑豎查鱟堡主蘭竺堡苧 2 3 4 轉(zhuǎn)化 a 分別取x g a l ( 5 0 m g m 1 ) 2 0 “i ，工p t g ( o 1 m ) 1 0 0 “i 涂布l b 平板( 含l o o 肚g n n l 氨芐青霉素) 。 b 在連接反應(yīng)管中加入l o o “1 感受態(tài)細(xì)胞，輕旋混勻，冰浴3 0 分鐘。 c 4 2 。c 熱激9 0 秒。 d 將管迅速轉(zhuǎn)移到冰上冷卻2 分鐘。 e 每管加入4 0 0 肛ls o c 培養(yǎng)基，3 7 。c2 0 0 r p 州m i n 振蕩培養(yǎng)1 小時(shí)。 f 室溫4 0 0 0 r p i l l ，h i n 離心5 分鐘，吸棄4 0 0 u l 上清。 g 吸取余下的轉(zhuǎn)化物，涂布上述平板。 h 3 7 。c 正向放置培養(yǎng)1 小時(shí)。 i 3 7 。c 倒置培養(yǎng)過夜。 2 3 5 篩選 選擇白色菌落，挑至含a m p 的l b 液體培養(yǎng)基中，3 7 。c2 0 0 r p 耐誠(chéng)n 振蕩培 養(yǎng)4 小時(shí)。 2 3 6 鑒定 取上述菌液l 肚l 進(jìn)行p c r 檢測(cè)，反應(yīng)條件如前所述。 2 4 測(cè)序 取鑒定正確的菌液，加入l o m ll b 液體培養(yǎng)基中，3 7 0 c2 0 0 r p 叫m i n 振蕩培 養(yǎng)過夜。然后取1 m l 菌液，送交上海生工生物工程有限公司，用通用引物 ( m 1 3 十m 1 3 一) 進(jìn)行雙向測(cè)序。d n a 自動(dòng)測(cè)序儀型號(hào)為a b ip l u s m3 7 7 9 6 。 2 5d n a 序列數(shù)據(jù)處理分析 搜尋g e n e b a i l k 上所有羚羊亞科物種c ”b 基因全序列，結(jié)合本次羚羊亞科 原羚屬藏原羚和黃羊全部測(cè)序結(jié)果( 各3 個(gè)) ，對(duì)羚羊亞科原羚屬屬內(nèi)物種及羚 羊亞科各屬之間發(fā)育關(guān)系進(jìn)行研究分析。另取本次羊亞科斑羚( 研。砌卯d 協(xié) c 日“婦f “s ) 和鬣羚( c 印r f ，雕；i j 纛弦邑孫囂籀f 鬃 磊：筆名萎簦引i 譽(yù)涫溪 酗螄甜雛萬幽雛鞒劓醞娶蠢囂穩(wěn)輜。瑟疆簡(jiǎn)! l 乳相積! 喜；雅始“；稽并貅蘩誓 瞧裝坐剝a。蓍掣瓢鞋旨掣繭蘆剽舔諺灌哩嘎崞遵惰l墓薹ii委j!賽加羚 羊差異最小，差異值分別為1 2 3 4 和“7 5 ；黃羊、藏原羚分別與 島羚及山羚相距最遠(yuǎn)，差異值分別為1 5 | 2 9 和1 4 9 3 。作為外群的牛和內(nèi)群各 種之間序列差異值為1 5 6 4 1 9 6 5 ，平均1 7 3 9 ；與原羚屬平均差異值為1 6 5 。詳見表 3 。 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 同源序列進(jìn)行排序。用c l u s t a l x l 8 軟件( t h o m p s o n ，1 9 9 7 ) 進(jìn)行c y tb 基因全 序列的比對(duì)。用m e g a 2 1 ( k u m a r8 r 以，2 0 0 1 ) 軟件計(jì)算不同序列間的堿基替代 數(shù)、變異位點(diǎn)、簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)數(shù)、轉(zhuǎn)換顛換百分比、轉(zhuǎn)換顛換比率和k i m u r a ( 1 9 80 ) 兩參數(shù)( 2 口a r 鋤e t e r ) 距離。用d n a s t a r 軟件計(jì)算兩兩序列的遺傳相似度和序 列差異百分比?；蛲蛔兪欠耧柡筒捎棉D(zhuǎn)換顛換散點(diǎn)分析( b i m n g i ，2 0 0 1 ) 。使 用p a u p 4 o b 8 軟件( s w o f r o r d ，1 9 9 8 ) 構(gòu)建鄰近( n j ) 樹、開啟式功能搜尋最簡(jiǎn)約 ( m p ) 樹和t b r 法搜尋最大似然( m l ) 樹。依據(jù)所獲得轉(zhuǎn)換顛換平均比率， m p 和m l 樹采取加權(quán)( w e i 啦t i n g ) 系數(shù)( 呂寶忠等譯，2 0 0 2 ) 。系統(tǒng)簡(jiǎn)約信息 分析使用步長(zhǎng)( t r e ei e n 醇h ) ，一致性指數(shù)( c o n s i s t e n c yi n d e x ，c i ) 、保留指數(shù) ( r e t e n t i o ni n d e x r i ) 、同型指數(shù)( h o m o p l a s yi n d e x ，h i ) 和重復(fù)衡量一致性指數(shù) f r e s c a l e dc o n s i s t e n c yi n d e x ，r c i ) 評(píng)估。n j 和m p 系統(tǒng)樹各分枝的置信度由l o o o 次自舉( b o o t s t r a 口) 重復(fù)檢測(cè)：m l 系統(tǒng)樹分枝置信度由1 0 0 次自舉重復(fù)檢測(cè)。 依據(jù)分歧時(shí)間的計(jì)算公式d = 2 t ( l i 甜d ，1 9 8 1 ) ，以?？苿?dòng)物已校正的c y t6 分子鐘，細(xì)胞色素6 全序列平均進(jìn)化速度為2 唰百萬年( b i r u n g i ，2 0 0 1 ；硒k l ( a w a ， 1 9 9 7 ：m a n h e e 吖烈，1 9 9 9 ) 計(jì)算分歧時(shí)間。 浙江= 學(xué)碩士學(xué)位論文 第三部分結(jié)果和討論 得到?？? 個(gè)物種1 3 個(gè)個(gè)體細(xì)胞色素6 基因的全序列，c i u s t a l x l 8 軟件排 序比對(duì)具體分布位置見圖一。 1 細(xì)胞色素6 基因堿基序列組成、變異位點(diǎn)及序列差異 經(jīng)對(duì)位排列后，4 1 個(gè)個(gè)體c y t b 基因序列中，共有1 1 4 0 個(gè)堿基位點(diǎn)。其中 有5 6 8 個(gè)核酸變異位點(diǎn)，4 3 5 個(gè)簡(jiǎn)約信息位點(diǎn)。a 、t 、c 、g 堿基平均含量為3 1 4 、2 6 6 、2 8 7 、1 3 3 ，密碼子第三位點(diǎn)g 堿基含量為6 1 ；原羚屬黃羊 和藏原羚6 條基因序列中，a 、t 、c 、g 堿基平均含量為3 1 ，5 、2 7 3 、2 8 o 、1 3 2 ，密碼子第三位點(diǎn)g 堿基含量為5 o 。原羚屬種內(nèi)和種間及相關(guān)物 種基因序列差異百分比顯示出：原羚屬種內(nèi)和種間均有較高的遺傳相似性，黃羊 種內(nèi)序列差異值為1 2 6 1 9 l ，平均為1 5 1 ；藏原羚種內(nèi)序列差異值為o 1 8 o 9 ，平均為o 6 ；屬內(nèi)二者種間序列差異平均值為3 7 8 。原羚屬種間 序列差異平均值( 3 7 8 ) 與犬羚屬種間序列差異平均值( 2 2 8 ) 較近；同比 而言，羚羊亞科羚羊?qū)?、小巖羚屬屬內(nèi)種間序列差異值較大分別為9 3 5 、8 8 4 。原羚屬與羚羊亞科其它屬級(jí)序列差異百分比顯示出：原羚屬與賽加羚羊?qū)佟?跳羚屬同源相似性較高，序列差異平均值分別為1 2 0 6 、1 3 1 4 ；與島羚屬同 源相似性最小，差異值為1 4 9 3 。羚羊亞科內(nèi)屬間相互比對(duì)差異平均值為1 1 0 9 1 7 3 8 ，印度羚屬與羚羊?qū)俨町愖钚? 1 0 9 ；犬羚屬與島羚屬差異最大 為1 7 3 8 。原羚屬黃羊和藏原羚與羚羊亞科其它屬物種對(duì)比發(fā)現(xiàn)：黃羊和減原 羚與賽加羚羊差異最小，差異值分別為1 2 3 4 和“7 5 ；黃羊、藏原羚分別與 島羚及山羚相距最遠(yuǎn)，差異值分別為1 5 | 2 9 和1 4 9 3 。作為外群的牛和內(nèi)群各 種之間序列差異值為1 5 6 4 1 9 6 5 ，平均1 7 3 9 ；與原羚屬平均差異值為1 6 5 。詳見表3 。 2 細(xì)胞色素6 基因序列核酸變異方式 4 1 個(gè)個(gè)體，3 3 個(gè)物種間核苷酸堿基的變異存在很大的差異：平均替換數(shù)為 1 5 1 個(gè)，在密碼子的第三位點(diǎn)中存在9 5 個(gè)變異，占總變異位點(diǎn)的6 2 9 1 ：t 一 一c 、a 一一g 的轉(zhuǎn)換數(shù)分別為8 7 個(gè)和3 0 個(gè)，a 一一c 、a 一一t 、t 一一g 和 1 4 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 c 一一g 的顛換數(shù)分別為2 0 、1 0 、2 和2 個(gè)。原羚屬黃羊和藏原羚平均替換數(shù)為 4 3 個(gè)，在密碼子的第三位點(diǎn)中存在2 9 個(gè)變異，占總變異位點(diǎn)的6 7 4 ；t 一一c 、 a 一一g 的轉(zhuǎn)換數(shù)分別為2 8 個(gè)和1 4 個(gè)，a 一一c 、a 一一t 、t 一一g 和c 一一 g 的顛換數(shù)分別為l 、0 、o 和0 個(gè)。黃羊和藏原羚種內(nèi)平均替換數(shù)分別為1 7 和 7 個(gè)，在密碼子的第三位點(diǎn)中存在1 5 和6 個(gè)，分別占總變異位點(diǎn)的8 8 2 和8 5 7 ，且均為轉(zhuǎn)換。表3 顯示出：黃羊和藏原羚種內(nèi)轉(zhuǎn)換與顛換比值( t s t v ) 近乎為 無窮大( 分別為1 7 o 和7 o ) ，二者種間t s t v 為4 3 ( 4 3 1 ) 。原羚屬與羚羊亞科 其它屬間轉(zhuǎn)換顛換比值( t s 廠r v ) 在2 ，7 6 1 1 3 7 ：l 之間( 1 0 6 1 4 lt s ，1 2 4 3 t v ) 。 羚羊亞科屬間轉(zhuǎn)換顛換比值在2 5 1 1 4 ：l 之間( 1 0 3 1 6 5t s ，1 2 5 3 t v ) 。原羚 屬物種與外群牛轉(zhuǎn)換顛換比值為2 ，9 2 ：1 ( 1 4 0 t s ，4 8 t v ) 。 3 細(xì)胞色素6 基因轉(zhuǎn)換顛換散點(diǎn)飽和性分析 取羚羊亞科及外群牛作散點(diǎn)飽和性分析，羚羊亞科屬內(nèi)、屬間，羚羊亞科與 外群的序列差異及轉(zhuǎn)換( t s ) 、顛換( t v ) 數(shù)散點(diǎn)飽和圖見圖2 ( a 、b 、c ) 。結(jié)果發(fā)現(xiàn)： 原羚屬及羚羊亞科屬內(nèi)、屬間隨著序列差異比提高，其堿基替換數(shù)均伴有線性提 高，但羚羊亞科各屬內(nèi)、屬間突變均未達(dá)到飽和。在羚羊亞科與外群的飽和分析 比較中，所有顛換位點(diǎn)和轉(zhuǎn)換位點(diǎn)中僅有第三轉(zhuǎn)換位點(diǎn)f t s 3 ) 存在有飽和現(xiàn)象， 但羚羊亞科與外群突變?nèi)晕赐耆_(dá)到飽和臨界。 4 細(xì)胞色素6 基因全序列分子系統(tǒng)樹構(gòu)建 基于4 1 條3 3 個(gè)?？莆锓N全序列( 5 6 8 個(gè)核酸變異位點(diǎn)，4 3 5 個(gè)簡(jiǎn)約信息位 點(diǎn)) 獲取最大簡(jiǎn)約m p 樹( 開啟搜尋) 和卜j 樹，4 倍加權(quán)的m p 樹和n j 樹( 根據(jù) t s t v 接近于4 ，采用4 倍加權(quán)，自舉引導(dǎo)值l o o o 次) ，最大似然( m l ) 樹( t b r ( t r e e _ b i s e c t i o n r e c o l l n e c t i o n ) 法搜尋，1 0 0 次自舉重復(fù)檢測(cè)) ：m p 樹和n j 樹基本 相似，發(fā)現(xiàn)3 棵m p 樹( 步長(zhǎng)( 1 c n g t h ) _ 2 5 0 7 ，c i = o 3 0 7 ，王u = o 4 9 9 ，h i = 0 6 9 3 ，r c i = o 1 5 3 ，樹略) 。4 倍加權(quán)m p 樹( 步長(zhǎng)= 9 3 5 0 ，c i - o 2 8 0 ，r j = o 4 2 9 ，h i = o 7 2 0 r c i = o 1 2 0 ) 和n j 樹見圖3 ，圖4 ：4 倍加權(quán)m l 樹見圖5 。除羚羊亞科藏羚屬系 統(tǒng)支持略有不同外，m l 樹相似于m p 和n j 樹。結(jié)果顯示：原羚屬屬內(nèi)黃羊和 藏原羚及犬羚屬內(nèi)物種單系發(fā)生( m o l o p h y l y ) ：原羚屬與賽加羚羊?qū)?、犬羚屬?跳羚屬等并系發(fā)生( p a r a p h y l y ) ，原羚屬隸屬于羚羊亞科；在3 種樹羚羊亞科組 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 成屬間基本上沒有單系起源，而多為并系起源。 5 討論 5 1 黃羊與藏原羚系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 隨著分歧時(shí)間增加，其物種親緣關(guān)系變遠(yuǎn)，同源基因序列差異值會(huì)增加，顛 換變化也隨之增加( i r 晰n ，1 9 9 1 ) 。黃羊與藏原羚細(xì)胞色素b 基因序列遺傳差異值 3 7 8 ，顛換數(shù)目近乎為0 ，充分顯示黃羊和藏原羚有著較之其他?？莆锓N更近 的親緣關(guān)系。根據(jù)?？漆鐏喛平邱R屬( c d ”n o 出口8 飽s ) ( m 甜h e e ，1 9 9 9 ) 、小葦 羚亞科水羚屬( 勛6 “5 ) ( b i n m g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚屬屬內(nèi)物種遺傳差異較小時(shí)，與 同亞科屬外物種的遺傳差異就較大的現(xiàn)象( 屬內(nèi)遺傳差異值為2 0 5 、o 3 、 2 2 8 ；屬外物種遺傳差異值分別為1 1 5 3 1 9 2 l 、7 7 1 4 7 、1 2 3 1 7 8 9 ) 。利用黃羊和藏原羚與同亞科其它物種序列遺傳差異值( 屬內(nèi)3 7 8 遺傳 差異值，屬外物種遺傳差異值1 2 0 6 1 4 9 3 ) 現(xiàn)象及結(jié)合分子系統(tǒng)樹高舉信支 持黃羊和藏原羚同系發(fā)生，原羚屬與羚羊亞科其它相近屬并系發(fā)生( 圖3 、圖4 和圖5 ) 現(xiàn)象。我們贊成把黃羊和藏原羚列為同一屬不同種，此屬為獨(dú)立屬( 原 羚屬p 陽c 印r 口) 觀點(diǎn)( s i m p s o n ，1 9 4 5 ；( r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。 所有?？? 1 個(gè)個(gè)體不同的物種間轉(zhuǎn)換的差異與顛換差異呈現(xiàn)正相關(guān)，種間 轉(zhuǎn)換顛換比值最低為2 4 ，所有數(shù)值均大于轉(zhuǎn)換顛換比的臨界值2 o ( k n i g h t ，1 9 9 3 ) ，表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏奇( b i a s ) ，這與?？?、馬羚亞科小羚羊 ( b e t t i n e ，2 0 0 1 ) 和食肉耳犬科( m a s u d a e ta 1 ，1 9 9 4 ) 的研究結(jié)果基本一致。隨著 進(jìn)化時(shí)問的增加，顛換的積累，哺乳動(dòng)物的m t d n a 轉(zhuǎn)換偏奇會(huì)下降，轉(zhuǎn)換顛換 比值( t s t v ) 趨向于穩(wěn)定臨界，飽和性會(huì)增加( h e d g e s ，1 9 9 1 ；z h 趴g ，1 9 9 3 ) 。通過本 研究中黃羊與藏原羚的轉(zhuǎn)換顛換比值( 4 3 1 ) 。羚羊亞科屬閩種間轉(zhuǎn)換與顛換比 值( t s t v ) 在2 5 1 1 4 ，羚羊亞科與外群轉(zhuǎn)換顛換值( 2 4 3 5 ) 及飽和散點(diǎn)圖線 性化( 圖2a 、b 、c ) 。說明牛科各物種間c y t b 基因序列的突變未達(dá)到飽和狀態(tài)， 尤其是黃羊與藏原羚之間c y t b 基因序列的突變遠(yuǎn)未飽和，隨著進(jìn)化時(shí)間推移， 它們的遺傳差異的增加，轉(zhuǎn)換可能趨向于飽和。根據(jù)黃羊和藏原羚轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)未飽和 現(xiàn)象，我們選擇?？苿?dòng)物已校正的細(xì)胞色素b 基因全序列每百萬年2 的進(jìn)化分 子鐘( b i r u n 西，2 0 0 1 ) ，推測(cè)黃羊和藏原羚的分歧時(shí)間大約在1 2 百萬年。 5 2 原羚屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 1 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 成屬間基本上沒有單系起源，而多為并系起源。 5 討論 5 1 黃羊與藏原羚系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 隨著分歧時(shí)間增加，其物種親緣關(guān)系變遠(yuǎn)，同源基因序列差異值會(huì)增加，顛 換變化也隨之增加( i r 晰n ，1 9 9 1 ) 。黃羊與藏原羚細(xì)胞色素b 基因序列遺傳差異值 3 7 8 ，顛換數(shù)目近乎為0 ，充分顯示黃羊和藏原羚有著較之其他?？莆锓N更近 的親緣關(guān)系。根據(jù)?？漆鐏喛平邱R屬( c d ”n o 出口8 飽s ) ( m 甜h e e ，1 9 9 9 ) 、小葦 羚亞科水羚屬( 勛6 “5 ) ( b i n m g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚屬屬內(nèi)物種遺傳差異較小時(shí)，與 同亞科屬外物種的遺傳差異就較大的現(xiàn)象( 屬耋州駙媯至砷 i | ! 。；囊i l ；蕈 1 。i l 囊；拍被酥磁稱翰瓣笛委驤并不蔓? d i 荔j ；菱：鎣。! ? 摹一；j ：；矍，| 萋：p | ! i ! 。蓉垴黔蔥建 。，使多數(shù)消費(fèi)者 進(jìn)入了一個(gè)持幣觀望的狀態(tài)，有效的遏制了長(zhǎng)虹掀起價(jià)格戰(zhàn)策略的實(shí)現(xiàn)。 選擇產(chǎn)品的認(rèn)知質(zhì)量組合模式，提高客戶可認(rèn)知的價(jià)值。 對(duì)于市場(chǎng)領(lǐng)導(dǎo)者，開辟新的渠道推出阻擊品牌，保護(hù)主體市場(chǎng)( 康拜恩的 推出) 。 ( 3 ) 渠道亂價(jià)行為的解決 建立規(guī)范的價(jià)格體系。制定統(tǒng)一開單價(jià)、統(tǒng)一批發(fā)價(jià)、統(tǒng)一零售掛牌價(jià)并 嚴(yán)格執(zhí)行和監(jiān)督。安排導(dǎo)購員每天監(jiān)督監(jiān)控零售商的統(tǒng)一零售掛牌價(jià)的實(shí)施，業(yè) 務(wù)員監(jiān)督批發(fā)商批發(fā)價(jià)的執(zhí)行情況，一旦發(fā)現(xiàn)違反價(jià)格情況，立即糾正。 處理好客情關(guān)系。 維護(hù)渠道的價(jià)格梯度。 協(xié)調(diào)不同渠道的價(jià)格差異關(guān)系。 掌握各網(wǎng)點(diǎn)的經(jīng)營(yíng)動(dòng)態(tài)。 響應(yīng)廠家的價(jià)格調(diào)整政策。 科龍、華寶容聲、康拜恩分渠道、分品牌、分型號(hào)操作。 折扣、促銷、返利等激勵(lì)政策保持相對(duì)一致。 5 3 科龍電器渠道的溝通管理 在渠道中進(jìn)行溝通管理，有利于增強(qiáng)經(jīng)銷商對(duì)公司及其品牌的信心和忠誠(chéng) 度，達(dá)到增強(qiáng)網(wǎng)絡(luò)維護(hù)和渠道質(zhì)量的目的。首先要建立行之有效的溝通機(jī)制，公 司總部與 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 成屬間基本上沒有單系起源，而多為并系起源。 5 討論 5 1 黃羊與藏原羚系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 隨著分歧時(shí)間增加，其物種親緣關(guān)系變遠(yuǎn)，同源基因序列差異值會(huì)增加，顛 換變化也隨之增加( i r w i n ，1 9 9 1 ) 。黃羊與藏原羚細(xì)胞色素b 基因序列遺傳差異值 3 7 8 ，顛換數(shù)目近乎為0 ，充分顯示黃羊和藏原羚有著較之其他牛科物種更近 的親緣關(guān)系。根據(jù)?？漆鐏喛平邱R屬( c o n n o c h a e 飽s ) ( m a t t h e e ，1 9 9 9 ) 、小葦 羚亞科水羚屬( k o b u s ) ( b i r u n g i ，2 0 0 1 ) 和犬羚屬屬內(nèi)物種遺傳差異較小時(shí)，與 同亞科屬外物種的遺傳差異就較大的現(xiàn)象( 屬內(nèi)遺傳差異值為2 0 5 、o 3 、 2 2 8 ；屬外物種遺傳差異值分別為1 1 5 3 1 9 2 l 、7 7 1 4 7 、1 2 3 1 7 8 9 ) 。利用黃羊和藏原羚與同亞科其它物種序列遺傳差異值( 屬內(nèi)3 7 8 遺傳 差異值，屬外物種遺傳差異值1 2 0 6 - - 1 4 9 3 ) 現(xiàn)象及結(jié)合分子系統(tǒng)樹高舉信支 持黃羊和藏原羚同系發(fā)生，原羚屬與羚羊亞科其它相近屬并系發(fā)生( 圖3 、圖4 和圖5 ) 現(xiàn)象。我們贊成把黃羊和藏原羚列為同一屬不同種，此屬為獨(dú)立屬( 原 羚屬p r o c a p r a ) 觀點(diǎn)( s i m p s o n ，1 9 4 5 ；g r o v e s ，1 9 6 7 ；s o k o l o v ，1 9 7 9 ) 。 所有牛科4 1 個(gè)個(gè)體不同的物種間轉(zhuǎn)換的差異與顛換差異呈現(xiàn)正相關(guān)，種間 轉(zhuǎn)換顛換比值最低為2 4 ，所有數(shù)值均大于轉(zhuǎn)換顛換比的臨界值2 0 ( k n i g h t ，1 9 9 3 ) ，表現(xiàn)出高的轉(zhuǎn)換偏奇( b i a s ) ，這與?？?、馬羚亞科小羚羊 ( b e t t i n e ，2 0 0 1 ) 和食肉耳犬科( m a s u d ae ta 1 ，1 9 9 4 ) 的研究結(jié)果基本一致。隨著 進(jìn)化時(shí)問的增加，顛換的積累，哺乳動(dòng)物的m t d n a 轉(zhuǎn)換偏奇會(huì)下降，轉(zhuǎn)換顛換 比值( t s t v ) 趨向于穩(wěn)定臨界，飽和性會(huì)增力g ( h e d g e s ，1 9 9 1 ；z h a n g ，1 9 9 3 ) 。通過本 研究中黃羊與藏原羚的轉(zhuǎn)換顛換比值( 4 3 1 ) 。羚羊亞科屬閩種間轉(zhuǎn)換與顛換比 值( t s t v ) 在2 5 1 1 4 ，羚羊亞科與外群轉(zhuǎn)換顛換值( 2 4 3 5 ) 及飽和散點(diǎn)圖線 性化( 圖2a 、b 、c ) 。說明?？聘魑锓N間c y t b 基因序列的突變未達(dá)到飽和狀態(tài)， 尤其是黃羊與藏原羚之間c y t b 基因序列的突變遠(yuǎn)未飽和，隨著進(jìn)化時(shí)間推移， 它們的遺傳差異的增加，轉(zhuǎn)換可能趨向于飽和。根據(jù)黃羊和藏原羚轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)未飽和 現(xiàn)象，我們選擇?？苿?dòng)物已校正的細(xì)胞色素b 基因全序列每百萬年2 的進(jìn)化分 子鐘( b i r u n g i ，2 0 0 1 ) ，推測(cè)黃羊和藏原羚的分歧時(shí)間大約在1 2 百萬年。 5 2 原羚屬系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 1 6 浙江大學(xué)碩士學(xué)位論文 僅管同比原羚屬與羚羊亞科賽加羚羊?qū)?、犬羚屬及跳羚屬物種基因序列具有 較高的同源相似性，但它們的序列差異均大于1 2 ；此外進(jìn)化系統(tǒng)樹也不舉信 支持原羚屬與賽加羚羊?qū)佟⑷鐚倬蹫閱蜗怠Ｋ晕覀兊慕Y(jié)果既不支持 k u z n e t s o v a ( 2 0 0 2 ) 從1 2 sr r n a 和1 6 sr r n a 認(rèn)為原羚屬與犬羚屬具有單系姐 妹群關(guān)系的假設(shè)；也不支持原羚屬與羚羊?qū)儆H緣關(guān)系更近( t i k h o n o v ，1 9 9 5 ) ， 原羚屬與賽加羚羊?qū)儆H緣關(guān)系較近( g r o v e s ，2 0 0 0 ) 的觀點(diǎn)；而僅贊成原羚屬歸 屬于羚羊亞科( g a t e s y ，1 9 9 7 ) 的觀點(diǎn)。原羚屬與賽加羚羊?qū)?、犬羚屬及跳羚?等是并系發(fā)生，起源于共同祖先、互為羚羊亞