第7講 噬菌體載體與柯斯載體 吳乃虎 基因工程原理講義.doc

第七講 噬菌體載體與柯斯載體吳 乃 虎中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所2005年8月目 錄一、噬菌體的一般問題1何謂噬菌體2噬菌體效價測定與雙層平板法3噬菌體的生命周期4噬菌體的溶源生命周期5超感染免疫6溶源性的誘發(fā)7Campbell模型二、l噬菌體載體1l噬菌體的生物學概述2l噬菌體載體的構(gòu)建(1) l噬菌體載體構(gòu)建的基本原理(2) 插入型載體(3) 替換型載體3l噬菌體載體的改良(1) Spi-正選擇的l噬菌體載體(2) 具有內(nèi)刪除特性的l噬菌體載體4l重組體DNA分子的體外包裝(1) l重組體DNA的轉(zhuǎn)染作用(2) l噬菌體的體外包裝5l噬菌體DNA的包裝限制問題(1) 包裝限制的概念(2) 包裝限制與l噬菌體的克隆能力(3) 包裝限制的生物學意義6l重組體分子的選擇方法(1) cI基因功能選擇法(2) lacZ基因功能選擇法(3) Spi-選擇法三、柯斯質(zhì)粒載體1柯斯質(zhì)粒的定義及其構(gòu)建(1) l噬菌體的克隆能力(2) 柯斯質(zhì)粒載體定義(3) 柯斯質(zhì)粒pHC79的構(gòu)建(4) 柯斯質(zhì)粒克隆能力及其組成2柯斯質(zhì)粒載體的特點3柯斯質(zhì)粒載體的改良4柯斯克隆(1) 定義(2) 理論依據(jù)(3) 柯斯質(zhì)粒包裝條件(4) 柯斯克隆程序(5) 柯斯克隆的優(yōu)點5柯斯克隆的改良(1) 柯斯克隆的局限性及其克服辦法(2) Ish-Horowicz-Burke克隆方案(3) Bates-Swift克隆方案噬菌體載體與柯斯質(zhì)粒載體一、噬菌體的一般問題1何謂噬菌體？(1)定義噬菌體英文名為Bacteriophage，簡稱phage，來源于希臘文“phages”，系指吞食之意，乃是一類細菌病毒的總稱需要指出的是，“phage”這個英文單詞既是單數(shù)又是復數(shù)形式。作單數(shù)使用時是指一個噬菌體，如試管中含1個T4 phage；而用作復數(shù)使用時，則是指同一種噬菌體的眾多顆粒，如試管中含有上百個的T4 phage。“phages”是噬菌體的復數(shù)詞，是指多種不同的噬菌體。例如：試管中含有T4和T7等多種phages。(2)噬菌體的核酸類型及結(jié)構(gòu)*1.與質(zhì)粒相比，噬菌體的結(jié)構(gòu)顯然要復雜得多，但與細菌或真核細胞相比，則顯得十分簡單。它的DNA分子中除了復制起點之外，還編碼著外殼蛋白質(zhì)的基因。噬菌體的核酸最常見的是雙鏈線性DNA、雙鏈環(huán)形DNA、單鏈環(huán)形DNA、單鏈線性DNA及單鏈RNA等多種形式。*2.不同的噬菌體顆粒結(jié)構(gòu)相差甚大，可歸結(jié)為如下三種基本類型：a. 無尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型；b. 具尾部結(jié)構(gòu)的二十面體型；c. 線狀體型。圖7-1 T2噬菌體顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖迄今已知的大多數(shù)噬菌體都是屬于第二種結(jié)構(gòu)類型(圖7-1)，在其二十面體型的頭部下端，連接著一條尾部結(jié)構(gòu)，恰似一種小型的皮下注射器。2噬菌體效價測定與雙層平板法(1)效價定義效價(titer)又叫滴度，系指單位體積的噬菌體制劑中所含有的具感染能力的噬菌體顆粒的數(shù)目。它以每毫升噬菌體制劑中的噬菌斑形成單位pfu/ml表示。(2)效介的測定(titering)10倍稀釋法與雙層平板法(3)噬菌斑形態(tài)混濁型與清晰型3噬菌體的生命周期(1)噬菌體的生命周期包括*1.溶菌生命周期產(chǎn)生子代噬菌體*2.溶源生命周期不產(chǎn)生子代噬菌體(2)烈性噬菌體和溫和噬菌體：*1.烈性噬菌體只具有溶菌周期的噬菌體(phage)*2.溫和噬菌體具有溶源周期的噬菌體(3)烈性噬菌 溶菌生長周期：吸附注入轉(zhuǎn)變合成組裝釋放4噬菌體的溶源生命周期(1)若干基本概念*1.溫和噬菌體(temperate phage)既能進入溶菌生命周期又能進入溶源生命周期的噬菌體，叫做溫和噬菌體。*2.溶源性細菌(lysogen)在染色體基因組上具有一套完整的噬菌體基因組的細菌叫溶源性細菌。如果某些噬菌體基因缺失了，那么這樣的噬菌體就不能夠完成其溶菌周期，故含有這樣噬菌體的細菌，叫做缺陷性的溶源性細菌。*3.溶源化(lysogenization)用溫和的噬菌體感染細菌培養(yǎng)物，使寄主細菌轉(zhuǎn)變?yōu)槿茉葱约毦倪^程，叫做溶源化。溶源化的分子本質(zhì)是噬菌體的DNA整合到寄主細菌染色體基因組DNA之中，成為它的組成部分。*4.整合(integration)噬菌體DNA組入寄主細胞染色體DNA的過程，稱為噬菌體DNA的整合或插入(insertion)。整合的準確定義是：小分子量的DNA分子插入到大分子量的DNA分子中的重組過程。參入(incorporation )*5.原噬菌體(prophage)在溶源性細菌中存在的處于抑制狀態(tài)的整合的或非整合的噬菌體DNA叫做原噬菌體5超感染免疫(再感染免疫)(1)超感染免疫定義溶源性細菌不能夠被頭一次感染并使之溶源化的同種噬菌體再感染。溶源性細菌具有的這種抗御同種噬菌體再感染的特性叫做超感染免疫。(2)超感染免疫理論解釋*1.阻遏基因cI：編碼阻遏蛋白質(zhì)分別同啟動基因PL和PR相鄰的操縱單元(operator)oL及oR結(jié)合同啟動基因pL相鄰 同啟動基因pR相鄰*2.在溶源性細菌中，cI的產(chǎn)物阻遏蛋白是超量的，致使oL和oR處于被結(jié)合的狀態(tài)，于是RNA聚合酶無法啟動pL和pR進行轉(zhuǎn)錄，因此處于溶源狀態(tài)。*3.溶源性細菌(對l phage而言的)發(fā)生l phage超感染時，當l phage DNA進入細菌之后，超量的cI阻遏物立即同其空閉的oL和oR結(jié)合，從而阻止其進入溶菌狀態(tài)。這種被阻遏物分子結(jié)合著的操縱單元，阻止l phage發(fā)育成溶菌狀態(tài)，我們稱這種抑制作用為對同源免疫超感染的抗性。*4.超感染的l phage DNA將會發(fā)生什么變化？超盤旋l phage DNA復制困難，而細菌細胞卻能正常復制，結(jié)果l DNA被“稀釋”。6溶源性噬菌體的誘發(fā)(1)定義溶源性細菌經(jīng)過許多世代之后，便能夠開始進入溶菌周期，這個過程叫做溶源性細菌的誘發(fā)。(2)原理溶源性細菌的誘發(fā)，同樣也是依賴于阻遏基因和操縱單元的相互作用。溶源性細菌中的阻遏物失活l phage操縱單元oL和oR處于自由狀態(tài)轉(zhuǎn)錄作用正常發(fā)生結(jié)果phage在刪除酶的作用下被誘發(fā)游離的l phage DNA再環(huán)化。7Cacmpbell模型(1)概念*1.l的附著位點attlDNA是整合在大腸桿菌染色體上位于gal操縱子和bio操縱子之間的一個特定位點，這個位點叫做att。*2.int基因l phage編碼的一種整合酶，能夠認別phage DNA和細菌DNA的附著位點。并催化這兩種DNA之間發(fā)生鏈的交換。(2)Campbell模型這是一種解釋l噬菌體DNA對E.coli染色體DNA整合作用的模型：lDNA環(huán)化成環(huán)形分子在細菌DNA附著位點BOB及噬菌體DNA附著位點POP，發(fā)生物理性破裂在這兩個附著位點之間進行準確的噬菌體DNA和寄主DNA的再接合完成整合作用圖7-2 Campbell模型二、l噬菌體載體1l噬菌體的生物學概述(1)基因組結(jié)構(gòu)*1.粘性末端l噬菌體的基因組是由雙鏈DNA組成，其線性分子的兩端各有一條由12個核苷酸組成的彼此互補的5單鏈突出序列，即通常所說的粘性末端。*2.cos位點注入感染寄主細胞內(nèi)的lDNA線性分子，會迅速環(huán)化形成雙鏈DNA分子。這種由粘性結(jié)合形成的特定的雙鏈區(qū)段稱為cos位點cos=cohesive-end site，即粘性末端位點*3.分子長度l噬菌體DNA分子長度為48502bp。*4.結(jié)構(gòu)為敘述的方便，l噬菌體基因組被人為地區(qū)分為三個區(qū)域：a. 左側(cè)區(qū)自基因A到基因J，包括參與噬菌體頭部蛋白和尾部蛋白合成所需的全部基因；b. 中間區(qū)介于基因J與基因N之間，又稱為非必要區(qū)。該區(qū)的編碼基因與噬菌斑形成無關(guān)，但包括重組相關(guān)基因(redA和redB)；整合基因(int)，及刪除基因(xis)；c. 右側(cè)區(qū)位于N基因的右側(cè)，包括全部的調(diào)控基因，如復制基因(O)和溶菌基因(S及R)。(2) l噬菌體DNA的復制*1.在感染的早期：環(huán)形的lDNA分子按q形式從雙向進行復制，其復制起點位于c基因和O基因之間，并且需要O和P蛋白質(zhì)的參與；*2.到了感染的晚期：控制滾環(huán)復制機理的開關(guān)被啟動，合成出由一系列線性排列的lDNA組成的多連體分子。但這種多連體分子須經(jīng)過核酸酶從cos位點處切割之后，形成單體的lDNA之后，才能被包裝起來；*3. lDNA復制所必須的條件a. cos末端(cos ends)12bp的粘性末端在體內(nèi)可以彼此配對而使線性的lDNA重新環(huán)化起來。這種12bp的延伸末端是由于cos位點切割形成的，它是在包裝期間發(fā)生的。b. O和P蛋白質(zhì)O蛋白質(zhì)同DNA結(jié)合，而P蛋白則是同寄主編碼的dnaB蛋白質(zhì)相互作用。c. GAM蛋白質(zhì)抑制大腸桿菌核酸外切酶(recBC核酸酶)，從而保護滾環(huán)復制產(chǎn)生的多連體DNA分子免受核酸外切酶的破壞。N抗終止因子(N antitermination factor)引起DNA聚合酶通讀早期的終止區(qū)(terminator)，表達Q蛋白質(zhì)以及復制蛋白質(zhì)。Q抗終止因子(Q antitermination factor)引發(fā)RNA聚合酶通讀tR65，表達頭部以尾部組裝蛋白質(zhì)以及寄主細胞溶菌蛋白質(zhì)。復制蛋白質(zhì)(replication proteins)噬菌體O和P蛋白質(zhì)同寄主蛋白質(zhì)一道工作，使DNA進行復制。包裝及溶菌蛋白質(zhì)(Packaging and lysis proteins)為噬菌體生長所必不可少的其它蛋白質(zhì)。2l噬菌體載體的構(gòu)建1l噬菌體載體構(gòu)建的基本原理多余位點的刪除野生型的l phage，對大多數(shù)限制酶都具有過多的識別位點，例如EcoRI有5個位點，Hind有7個位點。按照上述原理構(gòu)成的l phage載體有兩種類型：*1.插入型載體(insertion vectors)只具有一個可供外源DNA插入的克隆位點。這樣的派生載體叫插入型載體。*2.替換型載體(replaument vectors)在兩個限制位點之間的l DNA片段可以被插入的外源DNA片段所取代，這樣的l派生載體叫替換型載體。(2)插入型載體*1.插入失活效應因外源DNA片段的插入而導致噬菌體某種功能的失效，此即所謂的插入失活效應。*2.免疫功能失活的插入型載體(inactivation of immunity function)在其基因組中有一段免疫區(qū)，其中帶有一兩種核酸內(nèi)切限制酶的單切點，外源DNA片段在此克隆會導致載體失去合成活性阻遏物的功能，而不能進入溶源周期。免疫功能失活的插入型載體的辨別標記：帶有外源DNA插入片段的載體感染之后，只能形成清晰的噬菌斑。沒有外源DNA插入片段的載體感染之后則形成混濁的噬菌斑。根據(jù)噬菌斑形態(tài)學特征，選擇體外重組噬菌體和親本噬菌體。*3.b-半乳糖苷酶失活的插入型載體(inactivation of E.coli b-galactosidase)在其基因組中含有一段E.coli的lac5區(qū)段，其中編碼著b-半乳糖苷酶基因lacZ (lacZ基因)感染lac-大腸桿菌菌株(指示菌)IPTG和Xgal的作用形成藍色的噬菌斑選擇標記：具外源DNA片段的l phage形成白色噬菌斑不具外源DNA片段的形成藍色噬菌斑(3)替換型載體l噬菌體載體克隆外源DNA的能力有一定的限制，因此改良l phage載體的一個重要目標是提高載體容納外源DNA片段的能力，以期發(fā)展出可以接受任何一種的限制片段的載體系列。從目前情況看替換型載體有可能滿足這樣的要求。*1.根噬菌斑形態(tài)選擇的替換型載體例如M. Thomas等人(1974)發(fā)展的替換型載體lgtlc，即是屬于根據(jù)噬菌斑形態(tài)選擇的替換型載體的一例。該載體的可替換片段C含有att、int、xis 3個基因選擇表型：沒有外源DNA取代時，可處于溶源狀態(tài)，形成混濁噬菌斑非重組體有外源DNA取代時，att、int、xis 3個基因被取代，而不能處于溶源狀態(tài)。因此形成清晰的噬菌斑重組體*2.根據(jù)噬菌斑顯色反應選擇的替換型載體N. E. Murrag等人(1977)發(fā)展的替換型載體lNM781，即屬于根據(jù)噬菌斑顯色選擇的替換型載體的一例。該載體的可替換片段EcoRI片段含有supE基因由于這種噬菌體lNM781的感染，寄主細胞lacZ基因的琥珀突變更被抑制了。因此可以在乳糖麥康基氏(MacConkey)瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出紅色的噬菌斑，或是在Xgal瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生出藍色的噬菌斑。選擇沒有外源DNA取代時，在乳糖麥康基氏瓊脂培養(yǎng)基上產(chǎn)生紅色噬菌斑，或是在Xgal培養(yǎng)基上產(chǎn)生藍色噬菌斑非重組體當EcoRI片段(含supE基因)被外源DNA片段取代時，形成無色噬菌斑重組體3l噬菌體載體的改良l噬菌體載體改良的目的有四：a. 增加克隆外源DNA的能力；b. 提高對重組體正選擇的特性；c. 可通過轉(zhuǎn)錄作用制備外源DNA插入序列之RNA探針；d. 可使插入的真核cDNA與b-半乳糖苷酸形成融合蛋白質(zhì)；(1)Spi-正選擇的l噬菌體載體*1.Spi-正選擇的原理：野生型的l噬菌體不能夠在P2噬菌體溶源性的細菌中生長，其表型為Spi+，即對P2噬菌體的抑制作用呈敏感性(sensitive to P2 inhibition)。實驗證明，這種生長抑制作用是受l噬菌體red和gam這兩個基因編碼產(chǎn)物控制的。如果噬菌體喪失了這兩個基因，(例如被外源插入DNA所取代)，這樣的噬菌體突變體便獲得了Spi-表型，能夠在噬菌體P2溶源性的大腸桿菌細胞中生長并形成噬菌斑。因此，具有red和gam基因的替換型載體(即red和gam基因可被外源插入DNA片段所替代)作克隆實驗，可以按照Spi特性來選擇重組體。因此，Spi-表型為我們提供了一種正選擇標記。*2.選擇標記Spi+表型：不能在P2噬菌體溶源性的E.coli中生長，為非重組體Spi-表型：能夠在P2噬菌體溶源性的E.coli中生長，red和gam基因被外源DNA取代，為重組體失去red和gam這兩個基因的l噬菌體載體，其表型由Spi+Spi-(2)具有體內(nèi)刪除特性的l噬菌體載體(i) lZAP載體的結(jié)構(gòu)*1.內(nèi)刪除載體定義lZAP載體是一種典型的具有內(nèi)刪除特性的l噬菌體載體，應用這種載體可在體內(nèi)將插入的DNA片段直接從l載體轉(zhuǎn)移到質(zhì)粒載體上，而無須經(jīng)過亞克隆的步驟。具有這種特性的載體叫做內(nèi)刪除載體。圖7-3 lZAP載體的結(jié)構(gòu)及其體內(nèi)刪除作用*2.lZAP載體的結(jié)構(gòu)：a. 含有一個可以在體內(nèi)發(fā)生刪除作用的pBluescript噬菌粒的DNA片段；b. 在pBluescript DNA兩側(cè)含有f1起始子(I)和f1終止子(T)；c. 在pBluescript噬菌粒內(nèi)部有一段其兩端分別為T3和T7噬菌體啟動子的多克隆位點MCS區(qū)；*3.pBluescript噬菌粒內(nèi)刪除原理：體外重組：lZAP載體+外源DNA片段(形成重組載體)感染：重組載體感染F E.coli菌株，之后再用M13和f1輔助噬菌體超感染反式蛋白質(zhì)切割作用：在寄主細胞內(nèi)由輔助噬菌體M13或f1基因II編碼的反式作用蛋白質(zhì)，識別位于lZAP載體臂上的f1起始子和終止子，最終導致含有克隆DNA插入序列的pBluescript噬菌粒從lZAP載體上刪除下來包裝作用與釋放： 刪除下來的lZAP被MB蛋白質(zhì)包裝成單鏈DNA噬菌體顆粒，并被擠壓出寄主細胞。(ii) lZAP載體的主要特點a. 具有多種不同的核酸內(nèi)切限制酶的單識別位點，可以克隆10Kb大小的外源DNA片段；b. 在插入的外源DNA序列取向及讀碼結(jié)構(gòu)均保持正確時，就能從lacZ啟動子表達雜種或融合的蛋白質(zhì)，并可用抗體篩選；c. 在lacZ基因的NH2部位有6個單克隆位點，能發(fā)生b-半乳糖苷酶的插入失活效應，故可在Xgal顯色平板上篩選重組體分子；d. 利用T3或T7噬菌體的RNA聚合酶，lZAP能夠轉(zhuǎn)錄出任何一條鏈的mRNA分子，因此可方便地用來制備外源DNA插入序列的RNA轉(zhuǎn)錄本。(iii)RNA探針的制備由于MCS區(qū)的兩端有一對T3和T7噬菌體的RNA聚合酶啟動子，因此可以利用lZAP載體在體外制備插入的外源DNA序列之RNA拷貝。實驗操作步驟：選用適當限制酶進行切割使pBluescript DNA線性化T7 RNA聚合酶及4種(NTPs)核苷三磷酸mRNA分子*如果用的NTPs是帶有a-32P的核苷三磷酸，則可合成高比活性的標記的mRNA分子。4l重組體DNA分子的體外包裝(1)l重組體DNA的轉(zhuǎn)染作用*1.轉(zhuǎn)染(transfection)效率定義每微克lDNA轉(zhuǎn)染寄主細胞所產(chǎn)生的噬菌斑數(shù)目，叫做轉(zhuǎn)染效率；*2.l DNA的轉(zhuǎn)染是個低效過程未經(jīng)任何遺傳操作、新鮮制備的l DNA，其標準的轉(zhuǎn)染效率也只有105-106之間；而經(jīng)過基因操作的l DNA，如帶有插入片段等，其轉(zhuǎn)染效率則更低，一般只有103-104左右，無法滿足實驗要求。*3.l重組體DNA低效轉(zhuǎn)染原因分析：載體分子同外源DNA片段之間的結(jié)合完全是一種隨機的方式，形成的重組分子中有相當比例是沒有活性的，無法轉(zhuǎn)染寄主細胞。因此，l重組體DNA對寄主細胞的轉(zhuǎn)染是一種低效率的過程。(2)l噬菌體的體外包裝*1. l噬菌體DNA的包裝過程在正常的生長期間，寄主細胞內(nèi)l噬菌體要進行特殊的包裝反應，它涉及如下一系列的過程：滾環(huán)模型合成多連體形式(concatemeric form) DNA，在具備噬菌體頭部前體和A基因產(chǎn)物的條件下，會發(fā)生如下反應從COS位點處切割成l DNA單體分子這種線性的l單體DNA分子適于包裝，會很快被裝填到頭部外殼里邊由于具有12bp長的粘性末端，所以這種線性單體的l DNA分子又會重新再環(huán)化起來隨后基因D的產(chǎn)物便摻入到完整的頭部，接著通過基因W和FII產(chǎn)物的作用，把頭部和分別組裝的尾部結(jié)構(gòu)連成一體，最終形成成熟的噬菌體顆粒*2.體外包裝定義在體外試管中完成發(fā)生于寄主細胞內(nèi)的l DNA的全部包裝過程，叫做lDNA的體外包裝。*3.體外包裝原理l噬菌體的頭部和尾部是分開進行裝配的頭部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成尾部；尾部基因發(fā)生突變的噬菌體只能形成頭部。將從這兩種不同突變型噬菌體的提取物混合起來，便能夠在體外裝配成有生物活性的噬菌體顆粒。*4.互補突變體D基因突變的l phage 是一對互補的突變型phageE基因突變的l phageE基因發(fā)生琥珀突變(Eam)的l噬菌體不能形成頭部結(jié)構(gòu)，所以在其感染的寄主細胞中積累大量的尾部蛋白。D基因發(fā)生琥珀突變(Dam)的l噬菌體，lDNA不能進入頭部，成熟作用在頭部前體階段受阻。所以在其感染的寄主細胞中，累積大量的頭部蛋白。這兩種溶菌物彼此互補，所以lDNA單體能被包裝成為成熟的噬菌體顆粒。(3)內(nèi)源DNA包裝的克服：實驗制備的包裝蛋白質(zhì)提取物，既能包裝外源的DNA(重組體DNA分子)，也能包裝內(nèi)源的DNA。因此在l噬菌體DNA體外包裝中一個重要問題是，要克服內(nèi)源DNA被包裝的問題。因為正如上述所說，用于制備包裝蛋白的溶源性細菌，它們的原噬菌體被誘發(fā)產(chǎn)生的內(nèi)源DNA同樣也會被包裝起來。克服的辦法是： 通過b2區(qū)缺失，高效地刪去att位點，抑制在誘發(fā)過程中發(fā)生原噬菌體的刪除，從而避免了內(nèi)源DNA被包裝的問題。因此b2突變的原噬菌體之溶源性細菌提取物中，就不會出現(xiàn)內(nèi)源DNA的包裝問題。 避免內(nèi)源DNA包裝的噬菌體形成噬菌斑，這樣也可達到純化內(nèi)源本低的目的。例如Imm434溶源性細菌，由于imm434免疫性，就能阻止噬菌斑的形成。 選用重組缺陷(red-，rec-)的溶源性細菌，并用紫外線照射誘導法制備溶菌液。這樣便消除了內(nèi)源DNA的生物學活性，從而克服了令人困擾的內(nèi)外源DNA間的重組問題。(4)包裝及溶菌的條件*1.cos位點lDNA多連體分子在此處(cos位點)被切割，兩個cos位點之間的lDNA被包裝進噬菌體頭部*2.Nul及A蛋白質(zhì)這兩種蛋白是“終止酶”(末端酶)(terminase)的成分，該酶的生物學功能是從cos位點切割lDNA多連體分子。*3.B，C，D，E及Na3蛋白質(zhì)這些蛋白質(zhì)參予噬菌體頭部的構(gòu)成及組裝*4.G，H，I，J，K，L，M，T，U，V和Z蛋白質(zhì)這些蛋白質(zhì)參予尾部及尾纖維的構(gòu)成及組裝*5.R. S.和R2蛋白質(zhì)S蛋白破壞內(nèi)膜，R和R2蛋白質(zhì)協(xié)力降解細胞壁以使細胞裂解(lysis)5. l噬菌體DNA的包裝限制問題(1)包裝限制的概念l噬菌體頭部外殼蛋白質(zhì)容納DNA的能力是有一定限度的，上限不超過正常野生型DNA總長的5%，而下限又不得少于正常野生型lDNA總量的75%，也就是說l噬菌體的包裝能力控制在野生型lDNA長度的75-105%之間。在這個范圍之內(nèi)的lDNA可以被包裝成有活性的噬菌體顆粒，而超出這個范圍的就不能形成正常大小的噬菌斑。(2)包裝限制與l噬菌體的克隆能力包裝限制說明l噬菌體的克隆能力不是無限的，而是有一定的限制。按野生型lphage MW=48kb計算包裝上限=48105%=51kb而lDNA必要區(qū)=28kb 51-28=23kb*所以l噬菌體克隆外源DNA的理論極限值是23kb(3)包裝限制的生物學意義 包裝限制表明最好采用能增加基因組空間位置的缺失方法構(gòu)建l噬菌體克隆載體。 包裝限制保證正常的重組體方可形成正常的噬菌斑，因此實際上是一種正選擇。6l重組體分子的選擇方法由l噬菌體載體不具抗菌素抗性選擇記號，因此對l重組體分子的選擇除了Spi-正選擇法外，主要依據(jù)噬菌斑形態(tài)學特征，Xgal-IPTG顯色法進行的。(1)cI基因功能選擇法這是一種根據(jù)噬菌斑形態(tài)學特征選擇l重組體分子的方法。其原理如下：a. cI基因編碼的阻遏蛋白質(zhì)，是促使l噬菌體感染的E.coli寄主細胞進入溶源化狀態(tài)的必要條件。b. cI基因失活或缺失的l噬菌體是無法使其寄主細胞發(fā)生溶源化效應，故形成的是清亮的噬菌斑，而不是混濁的噬菌斑。c. 如果在插入型的l噬菌體載體的克隆位點上、或是在替換型的l噬菌體載體的可取代區(qū)段中，存在一個cI基因。那么外源DNA的插入或取代，將會使cI基因失活或喪失。d. 因此，l重組體分子的表型將是cI-，形成清亮型的噬菌斑；非重組體的lDNA分子的表型將是cI+，形成混濁型的噬菌斑。(2)lacZ基因功能選擇法在插入型的l噬菌體載體的lacZ基因序列中，引入了若干常用的核酸內(nèi)切限制酶位點。當外源克隆的DNA片段插入到這些位點中，形成無功能的b-半乳糖苷酶，于是被感染的E.coli細胞在Xgal-IPTG平板上形成無色的噬菌斑重組體克隆。沒有插入外源DNA的非重組體的分子，形成有功能的b-半乳糖苷酶，結(jié)果被感染的E.coli細胞在Xgal-IPTG平板上形成藍色的噬菌斑非重組體克隆。(3)Spi-選擇法此法在有關(guān)章節(jié)已作介紹，不再重述。三、柯斯質(zhì)粒載體1柯斯質(zhì)粒的定義及其構(gòu)建(1) l噬菌體克隆能力 23Kb理論值15Kb實際的有效克隆范圍*1.這樣的克隆能力一般說來是可以容納一個基因包括其非編碼的側(cè)翼序列。但許多基因的分子量比較大，特別是真核生物的基因，有的竟達35-40Kb。*2. l噬菌體作載體往往不能夠同時克隆兩個連鎖基因由此可見，在實際工作中，尤其是關(guān)于真核基因結(jié)構(gòu)與功能的研究需要發(fā)展出具更大克隆能力的載體。(2)柯斯質(zhì)粒載體定義1978年，J. Collins和B. Hohn，發(fā)展出了柯斯質(zhì)粒載體(cosmid vectors)，在一定程度上滿足了真核生物基因克隆的要求。cosmid=cos site-carrying plasmid粘粒、柯斯體、粘合體中文譯法不好*定義：一類由人工構(gòu)建的帶有l(wèi)DNA的cos序列和大腸桿菌質(zhì)粒復制子的特殊類型的質(zhì)粒載體。(3)柯斯質(zhì)粒pHC79的構(gòu)建從pHC79這個名稱起頭字母P，也就說明了cosmid的中文名稱叫柯斯質(zhì)粒為好。lphage中的cos序列及其控制包裝作用的序列pHC79pBR322中的完整的復制子：oriTerr基因Ampr基因由此可見，pHC79柯斯質(zhì)粒兼具了l phage vector和pBR322 vector兩方面的優(yōu)點。(4)柯斯質(zhì)粒的克隆能力及其組成?？滤官|(zhì)粒的克隆能力可達45kb柯斯質(zhì)粒本身分子量較小，典型的是5kb-7kb的環(huán)形DNA分子，它由如下4部分組成： 一個質(zhì)粒的復制起點； 一個或數(shù)個選擇記號； 大量的限制酶單一識別位點(a number of unique restriction sites); 一個cos位點(此系包裝的必要條件)；2柯斯質(zhì)粒載體的特點(1)具有l(wèi)phage的特性：a.體外包裝后可以高效地轉(zhuǎn)導敏感的E.coli cell；b.導入Cell后的lDNA線性分子可重新環(huán)化起來；c.但無法進入溶菌周期，無法形成子代噬菌體。(2)具有質(zhì)粒載體的特點：a. 具有質(zhì)粒復制子，可在寄主細胞內(nèi)像質(zhì)粒DNA一樣進行復制；b. 可在氯霉素作用下擴增，有效提高克隆基因的產(chǎn)量；c. 具有抗菌素抗性基因，便于重組體分子的選擇。(3)具有高容量的克隆能力*1.上面已經(jīng)提到柯斯質(zhì)粒只有一個ori、一兩個選擇記號、大量的限制酶的單一識別位點和一個cos位點。因此它的分子比較小，只有5kb-7kb左右，所以它可以克隆大至45kb的外源DNA片段，其低限值為30kb。*2.Cosmid的克隆能力取決于：能包裝到lphage頭部的DNA分子量的大小載體本身分子量的大小lphage可包容高達52kb的DNA，Cosmid自身大小為5-7kb，故其克隆能為45kb-47kb。由于可包裝的lDNA最小為38kb左右，而Cosmid DNA大小一般為5-7kb，故其克隆的下限為30-33kb上下。(4)能夠與帶有同源序列的質(zhì)粒DNA發(fā)生重組作用*1.共合體的形成一旦柯斯質(zhì)粒與帶有同源序列的質(zhì)粒在同一個細胞中共存時，它們之間便可形成共合體(Cointegrant)。因此，若質(zhì)粒和Cosmid各帶有一個不同的抗藥性記號及相容的復制起點，在轉(zhuǎn)化至另一個菌株細胞之后，能夠很容易地選擇出含有兩個不同選擇記號的共同體。*2.共合體的概念由一種具有一個轉(zhuǎn)位子的復制子，同另一種不具轉(zhuǎn)位子復制子融合而成的結(jié)構(gòu)。在其兩個復制子結(jié)合部位，具有一對同向重復排列的轉(zhuǎn)位子拷貝。3柯斯質(zhì)粒載體的改良(1) 將兩個cos位點組入到同一個柯斯質(zhì)粒載體上，以簡化在cosmid上的定向克隆。(2)構(gòu)建與通用質(zhì)粒載體無同源性的柯斯質(zhì)粒載體在具重組能力的細胞中同時具有這種載體時，它們之間就不會發(fā)生重組，但如果它們各帶上同源的外源DNA時，兩者之間就會發(fā)生重組形成共合體。(3)使Cosmid帶上由噬菌體編碼的依賴于DNA的RNA聚合酶的啟動子，這些啟動子可在體外合成克隆的插入片段之任意一端的特異性RNA探針。(4)在Cosmid中加入選擇性記號，以簡化鑒定經(jīng)重組Cosmid轉(zhuǎn)染的真核細胞的步驟。(5)在Cosmid中加入真核基因復制起點，以使轉(zhuǎn)染的Cosmid能夠在哺乳動物細胞中自主復制。(6)在Cosmid中加入原核標記，以促進轉(zhuǎn)染到哺乳動物細胞內(nèi)的Cosmid序列在細菌中獲救。(7)用噬菌體復制起點代替質(zhì)粒復制起點，有證據(jù)表明如此可緩解由攜帶ColE1起點的重組Cosmid所造成的生長速度不同的問題。(From J. Sam brook et al. 1989) P.170(中譯本)4柯斯克隆(Cosmid cloning)(1)定義應用柯斯質(zhì)粒作載體，在大腸桿菌寄主細胞中克隆大片段的真核基因組DNA的技術(shù)，叫做柯斯克隆。這個定義的三個要點是：a.柯斯質(zhì)粒作載體；b.大腸桿菌為寄主;c.克隆大片段的真核基因組DNA。(2)理論依據(jù)a. 在lphage線性DNA分子的每一端都具有彼此互補的單鏈突出序列，即所謂的粘性末端(cos位點)b. lphage的多連體分子是由cos連接而成的。cos cos cos cos cos cosc.末端酶(treminase)或叫Ter體系即lphage具有一種位點特異的切割體系(site-specific cutting system).*此系統(tǒng)能識別兩個相距適宜的(38-54Kb)cos位點，并切割之。*根據(jù)上述分析可知lphage DNA包裝的兩個必要條件是： cos位點 Ter體系(3)柯斯質(zhì)粒包裝條件由于只有在被作用的lDNA分子具有兩個cos位點，而且它們之間距離保持在38-54Kb的條件下，Ter體系才能對它發(fā)生作用。據(jù)此推斷：柯斯質(zhì)粒是不能作為包裝體系的，因為它只有一個cos位點。因此：柯斯質(zhì)粒只有在同適當大小的外源DNA片段重組成具有兩個cos位點而且相距達38-54Kb之間時，才能被包裝。(4)柯斯克隆程序真核DNA+限制酶 局部消化與消化的柯斯質(zhì)粒連接 重組a. 其中有一部分是兩端具cos位點且相距適宜的重組體b. 沒有cos位點的真核DNA片段自身重組體c. 柯斯片段多聚體其