（食品科學(xué)專業(yè)論文）山核桃青衣多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)和活性研究.pdf

浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 山核桃青衣多糖的提取分離、結(jié)構(gòu)和活性研究 摘要 浙江山核桃( c a r y ac a t h a y e n s i ss a r g ) 乃浙江省重要經(jīng)濟(jì)植物，營 養(yǎng)美味深受消費(fèi)者喜愛；而山核桃果實(shí)外青衣通常被當(dāng)作廢物丟棄， 既污染環(huán)境，又浪費(fèi)了有用的資源，應(yīng)對其進(jìn)行研究開發(fā)，并加以利 用。現(xiàn)有的糖生物學(xué)研究成果表明，植物多糖具有抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、 抗氧化等多種功效，且毒副作用較小，受到廣大專家學(xué)者的關(guān)注。因 此，開發(fā)利用山核桃青衣多糖具有理論和實(shí)際意義。 本文以山核桃青衣為原料進(jìn)行了山核桃青衣多糖的提取、分離研 究，并分析了從山核桃青衣多糖粗品中純化所得的單一糖組分的結(jié)構(gòu) 和活性。 通過正交試驗(yàn)對山核桃青衣多糖的提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，最佳提 取條件為：料液比1 ：1 5 ，浸提溫度7 0 。c ，浸提時(shí)間1 5 0 m i n 。經(jīng)苯酚 硫酸法測定最佳提取條件下的多糖得率為o 9 2 7 ，該條件下所得多 糖粗品命名為p s w 。 在分離純化研究中，比較了三氯乙酸法和s e v a g 法等脫蛋白工藝 的優(yōu)劣，綜合考慮試劑消耗、多糖結(jié)構(gòu)和活性的保存等因素，選擇 s e v a g 試劑反復(fù)脫蛋白7 次的工藝流程。并進(jìn)一步研究了脫色、透析、 s e p h a r o s e4 b 凝膠柱層析和d e a es e p h a r o s ef f 離子交換柱層析等純 化手段在分離純化p s w 中的應(yīng)用，最終確定將p s w 溶液用1 0 的 活性炭在6 0 下脫色2 h ，過濾去除活性炭，并用1 40 0 0 分子量的透 析袋對水透析，最后用d e a es e p h a r o s ef f 離子交換柱( 2 0 2 0 c m ) 和s e p h a r o s e4 b 凝膠柱( 2 0 4 0 c m ) 進(jìn)一步純化，精制得到的糖組分命 名為p s w - 1 。經(jīng)高效凝膠色譜和醋酸纖維電泳分析確定p s w - 1 為單 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 一組分，純度達(dá)9 5 以上。 采用紅外光譜分析p s w - 1 的官能團(tuán)特征，結(jié)果表明p s w - 1 有羧 基的特征吸收峰，說明其為含糖醛酸的酸性多糖；硫酸咔唑法測得其 糖醛酸含量為6 1 9 ，硫酸咔唑法和地衣酚法分析其c o 比值接近1 ， 據(jù)此判斷p s w - 1 是含有葡萄糖醛酸的雜多糖。氣相色譜分析結(jié)果顯 示p s w - 1 是含有鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖四種中性單糖的 雜多糖，各中性單糖的摩爾百分比為：1 2 6 ：2 0 1 ：2 3 0 ：4 4 4 。高 效凝膠色譜( h pg p c ) 法測得p s w - 1 的分子量為1 3 30 2 1 d 。已有的多 糖研究經(jīng)驗(yàn)表明，酸性雜多糖一般都具有較強(qiáng)的生物活性，且活性最 強(qiáng)的多糖的相對分子量都集中于1 0 00 0 0 - 2 0 00 0 0d 之間。因此，根 據(jù)以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測p s w - 1 是一種高活性的多糖化合物。 抗氧化實(shí)驗(yàn)表明，p s w - 1 具有一定的抗氧化能力，當(dāng)樣品濃度達(dá) 到l m g m l 。時(shí)，對d p p h 清除率達(dá)5 4 4 ，作為一種植物來源的抗 氧化物質(zhì)，它可能具有性質(zhì)溫和，毒副作用較小的特點(diǎn)，有一定的利 用價(jià)值。 體外免疫實(shí)驗(yàn)中，p s w 在1 0 0 0 0 9 9 m l 。的濃度下顯示出免疫增強(qiáng) 作用；而p s w l 在1 0 0 0 l a g m l 1 和1 0 0 0 0 l a g m l j 濃度下均具有免疫增強(qiáng) 作用，說明經(jīng)純化了的p s w - 1 的免疫調(diào)節(jié)作用優(yōu)于p s w ；而在c o n a 和l p s 的誘導(dǎo)作用下，o 0 l ，0 1 0 ，1 0 0 ，1 0 o o 年i l o o 0 0 9 9 m l 1 的p s w 和p s w - 1 均能極顯著地促進(jìn)脾細(xì)胞增殖，其中，由c o n a 誘導(dǎo)的脾細(xì) 胞經(jīng)p s w - 1 刺激后的增殖作用更明顯，說明p s w - 1 能更有效地刺激t 淋巴細(xì)胞增殖。 體內(nèi)免疫實(shí)驗(yàn)表明8 0 m g k g l d a y 。的p s w - 1 能夠極顯著地增強(qiáng)小 鼠的遲發(fā)型超敏反應(yīng)。說明p s w - 1 能在體內(nèi)有效刺激t 細(xì)胞增殖， 增強(qiáng)免疫力。 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 關(guān)鍵詞：山核桃青衣；植物多糖：提取分離；結(jié)構(gòu)分析；抗氧化活性； 免疫活性 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 s t u d yo nt h ee x t r a c t i o n ，i s o l a t i o n ， s t r u c t u r ea n db i o a c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e f r o m 例尺蹦例刪刪刪rg a bs t r a c t c a r y ac a t h a y e n s i ss n r g i s a n i m p o r t a n t e c o n o m i c a lp l a n ti n z h e ji a n gp r o v i n c e i ti sd e l i c i o u sa n dn u t r i t i o n a l b u ti t sh u s k i st h r o w n a w a ya sr u b b i s h ，w h i c hi sp o l l u t i o nt ot h ee n v i r o n m e n ta n dw a s t eo f u s e f u lr e s o u r c e s s oa ne f f i c i e n tm e t h o di sn e e d e dt oe x p l o r ea n du s et h e c a r y ah u s k w i t ht h ed e v e l o p m e n to fg l y c o l b i o l o g y , p o l y s a c c h a r i d e s i s o l a t e df r o mb o t a n i c a ls o u r c e sa r e s h o w i n g ab r o a d s p e c t r u m o f t h e r a p e u t i cp r o p e r t i e sa n dr e l a t i v e l yl o wt o x i c i t yt h u st h e yh a v ea t t r a c t e d ag r e a td e a lo fa t t e n t i o ni nt h eb i o m e d i c a la r e n a t h e r e f o r ed e v e l o p m e n t a n du t i l i z a t i o no fc a r y ap o l y s a c c h a r i d eh a st h e o r e t i c a la n dp r a c t i c a l s i g n i f i c a n c e p o l y s a c c h a r i d ew a se x t r a c t e da n di s o l a t e df r o mc a r y ac a t h a y e n s i s s c l r g ，i n t h i s p a p e r ，i t s s t r u c t u r a lp r o p e r t i e sa n db i o a c t i v i t i e sw e r e a n a l y z e df u r t h e r a c c o r d i n gt ot h eo r t h o g o n a le x p e r i m e n t ，t h eo p t i m a l e x t r a c t i o n p a r a m e t e r sw e r ee s t a b l i s h e d ，t h e ya r e ：r a t i oo f w a t e ra n dm a t e r i e l1 ：15 ， e x t r a c t i o nt e m p e r a t u r e7 0 。ca n de x t r a c t i o nt i m e15 0 m i n t h ee x t r a c t e d c r u d ep o l y s a c c h a r i d ew a sn a m e da sp s w i nt h ed e p r o t e i ns t u d y , t c am e t h o da n ds e v a gm e t h o dh a sb e e n c o m p a r e d ，i nc o n s i d e r a t i o no fr e a g e n tw a s t ea n dt h ee f f e c to ns t r u c t u r e a n db i o a c t i v i t yo fp o l y s a c c h a r i d e ，i ti sd e t e r m i n e dt ot r e a tt h es u g a r s o l u t i o nw i t hs e v a gs o l u t i o n7t i m e sa st h eo p t i m a ld e p r o t e i nm e t h o d i v 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 t h ef u r t h e rp u r i f ym e t h o d ss u c ha sd e c o l o r i z a t i o n ，d i a l y s i sa n dc o l u m n c h r o m a t o g r a p h ys e p a r a t i o nw a se x p l o r e di nt h i sp a p e r d e p r o t e i n e d s o l u t i o no fs u g a ri sd e c o l o r e dw i t h10 a c t i v ec a r b o na t6 0 cf o r2 h ， d i a l y s i sw i t hd i a l y s i sb a go f14 0 0 0m o l e c u l a rw e i g h t ，a n dt h e np u r i f i e d w i t hd e a es e p h a r o s ef fi o n e x c h a n g ec o l u m n ( 2 0 2 0 c m ) a n d s e p h a r o s e4 bg e lc o l u n m ( 2 0x4 0 c m ) t h ep u r i f i e dp o l y s a c c h a r i d ew a s d e t e r m i n e dt ob eap u r eo n ea c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i sr e s u l to fh pg p c a n dc a m e ，i t sn a m e da sp s w - 1 i rs p e c t r u mi n d i c a t e st h a tp s w - 1i sa na c i d i cp o l y s a c c h a r i d ew i t h u r o n i ca c i d t h ep h y s i c o c h e m i c a la n a l y s i sr e s u l ts h o w st h a tp s w - 1 c o n t a i n s61 9 u r o n i ca c i d ，a n di t sc ov a l u ei sn e a r1 ，w h i c hm e a n s p s w - 1m a yb eah e t e r o p o l y s a c c h a r i d ec o n t a i n sg l y c u r o n i ca c i d t h e n e u t r a lm o n o s a c c h a r i d ec o m p o s i t i o no fp s w - 1i s2 3 o g l u c o s e ，4 4 4 m a n n o s e ，2 0 o g a l a c t o s ea n d12 6 r h a m n o s ei nt e r m so ft h em o l a r p r o p o r t i o n sa c c o r d i n gt ot h eg cd a t a h pg p ca n a l y s i ss h o w st h a tt h e m o l e c u l a rw e i g h to fp s w - 1i s13 30 21d t h ep r e v i o u sp o l y s a c c h a r i d e r e s e a r c hs h o w e dt h a tm o s to ft h e h e t e r o - p o l y s a c c h a r i d eh a ss t r o n g b i o a c t i v i t yw h i l et h ep o l y s a c c h a r i d ew i t hm o l e c u l a rw e i g h tb e t w e e n10 0 0 0 0 ，、2 0 00 0 0dh a st h e s t r o n g e s ta c t i v i t y , s ob a s e d o nt h ea b o v e e x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，p s w - 1 c a nb e s p e c u l a t e d w i t h p o t e n t i a lh i g h b i o a c t i v i t y i nt h ea n t i o x i d a n tt e s tp s w - is h o w e da n t i o x i d a n tc a p a b i l i t yb y s c a v e n g i n g5 4 4 d p p hf r e er a d i c a l a tlm g 。m l 一，i tm a yh a st h e a d v a n t a g eo fm i l d n e s sa n dn o n t o x i c i t ya sab o t a n i cs o u r c ew h i c hc a nb e u s e d p s w - 1s h o w e ds t r o n g e ri m m u n o - m o d u la t i o ne f f e c tt h a np s wi nt h e i m m u n et e s ti nv i t r o ，i tc a np r o d u c es t a t i s t i c a l l ys i g n i f i c a n tp r o l i f e r a t i o n o fm u r i n es p l e e nl y m p h o c y t ea tb o t h10 0 0 p g m l 。1a n d10 0 0 0 p g 。m l 1 v 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 w h i l ep s wo n l ya t10 0 0 0 t g 。m l b o t hp s w - 1a n dp s wc a n s i g n i f i c a n t l ys t i m u l a t et h eg r o w t ho fm u r i n es p l e e nl y m p h o c y t ei n d u c e d b yc o n ao rl p sa t0 0 1 ，o 1 0 ，1 0 0 ，1 0 0 0a n d1 0 0 o o p g m l ，a n dt h e c o n a - i n d u c e dl y m p h o c y t es h o w e dm o r es i g n i f i c a n tp r o l i f e r a t i o na f t e r t r e a t e dw i t hp s w 1 ，w h i c hm e a n sp s w 一1a i m sm o r ea ttc e l l i nd e l a y e dt y p eh y p e r s e n s i t i v i t y ( d t h ) r e s p o n s e sa n a l y s i s ，p s w - 1 s t i m u l a t e sd t hr e s p o n s ei nm i c ea tad o s eo f8 0 m g 。k g - i d a y ，w h i c h m e a n sp s w 一1c a ne f f i c i e n t l yp r o d u c et c e l lp r o l i f e r a t i o n k e y w o r d s ：h u s ko fc a r y ac a t h a y e n s i ss a r g ；e x t r a c t i o na n di s o l a t i o n ； s t u r c t u r a la n a l y s i s ；a n t i o x i d a n ta c t i v i t y ；i m m u n o - a c t i v i t y v l 浙江工商大學(xué)碩上學(xué)位論文 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工 作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地 方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含 本人為獲得浙江工商大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的 材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作 了明確的說明并表示謝意。 讎：嶧日期：瑚年；月f 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的說明 本學(xué)位論文作者完全了解浙江工商大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文 的規(guī)定：浙江工商大學(xué)有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的 復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部 分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制 手段保存、匯編學(xué)位論文，并且本人電子文檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi) 容相一致。 保密的學(xué)位論文在解密后也遵守此規(guī)定。 簽名：年 導(dǎo)師簽名： 日期：m s 年歲月f e l m 啊 # 學(xué)1 4 論z 11 山核桃青衣的研究現(xiàn)狀 111 引言 第1 章緒論 i ；i i-i“堂桃alyafg u r eiit h ef r u i l o f c a l y ac 跚a t h a y 蝶e n s 4 i s1 s a , 7 胡桃科1 1 山核桃屬( ( o r wn u t t ) 植物 約冉1 7 種，t 產(chǎn)北美東部和q 嘲1 東南部 溫t 制也k ，我閘產(chǎn)4 種，引入1 種。其 中浙江核桃f ( - q c a t h a y e n s i s s a t t ) 和州八的莢同】 l 核桃( c a r y af f t i n o e n s 括 ( w a n g e n hj 置k o c h ) 為優(yōu)良的木本油料 成川材樹種，也是著名的f 果樹種。湖 南l l 】恢桃( ( 知) 目h u n r m e m “( 抽e n ge lr 兒c h a n g “( h a n ge tl u ) 作為汕料樹 種，有定的栽培l(xiāng) l l 私l ，“南】| l 核桃尚 j 禹野生 = | ! 【物資源，且柏較高的開發(fā)利用 價(jià)值。 小研究的原材料浙口山核桃，土美分布十浙江、安徽的i l f 麓疏林或腐殖 質(zhì)f 富的符中，為落葉喬木葉為羽狀復(fù)葉。果為堅(jiān)果，藏】硬皮內(nèi)，硬應(yīng)開 裂為4 瓣如圖1 1 所示。 山核桃的糶仁風(fēng)咪獨(dú)特，h 具有秕商的背莽價(jià)值，其租l 蛋 1 的、r 均含量為 l l3 m gg “l(fā) “，氨基酸總量甲均含量為1 1 71 4 m gg i i3 l , 【氨牲酸種類齊全，舍1 7 種氫基酸，其巾包括7 種人體必需氨篳酸，必需氧基酸占鈕犟酸總鞋的卣分比高 達(dá)3 30 7 ，是理想的高級蛋白質(zhì)果品，受消費(fèi)青的炊迎?！痉獯?，i i l 核桃已成 為浙江省重要的繹濟(jì)植物， 浙江工商大學(xué)碩上學(xué)位論文 1 1 2 山核桃青衣的藥用價(jià)值 山核桃未成熟時(shí)核外部有一層厚厚的綠色果皮，隨著核桃逐漸成熟該果皮逐 漸變黑，我國傳統(tǒng)中藥稱其為青衣，并有記載將其用于治療胃痛、胃潰瘍、皮膚 病、子宮脫落等【4 】。現(xiàn)代的研究成果也證實(shí)山核桃青衣具有多種藥用價(jià)值。 1 1 2 1 鎮(zhèn)痛作用 山核桃青衣對熱傳導(dǎo)及化學(xué)刺激引起的擬痛反應(yīng)有明顯鎮(zhèn)痛作用，我國傳統(tǒng) 中醫(yī)常將其用于胃痛、腹痛等病的治療【5 】。其鎮(zhèn)痛機(jī)理主要是青衣中所含無機(jī)鹽 造成腦內(nèi)低鈣高鉀條件，從而使得痛閾明顯提高【6 ，7 1 。 1 1 2 2 抗菌、消炎作用 山核桃青衣對巴豆油所致的小鼠耳殼腫脹、大鼠角叉菜膠性足腫脹，醋酸引 起的小鼠腹腔毛細(xì)血管通透性增高均有明顯的抑制作用。體外細(xì)菌培養(yǎng)試驗(yàn)表 明，山核桃青衣能抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草桿菌等。q a d a nf 等人 利用這點(diǎn)將其用于青春痘治療，試驗(yàn)結(jié)果表明對炎癥病例療效比較明顯i 引。 1 1 2 3 抗腫瘤作用 m t t 法和s r b 法的體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果顯示，山核桃青衣的氯仿粗提部分和 醋酸乙酯粗提部分對人白血病細(xì)胞株h l 6 0 、人胃癌細(xì)胞株b g c 8 2 3 及人宮頸癌 細(xì)胞株h e l a 有明顯的細(xì)胞毒性作用，在1 0 0 9 9 m l 1 時(shí)其抑制率基本達(dá)到5 0 以 上【9 1 。b s l b 法分析結(jié)果顯示，山核桃青衣醋酸乙酯提取物對b r i n es h r i m pe g g 的半數(shù)致死濃度為7 9 1 0 2 m g m l ，具有明顯的細(xì)胞毒性【1 0 1 。 此外，動(dòng)物體內(nèi)抗腫瘤實(shí)驗(yàn)也表明山核桃青衣具有抗癌作用，山核桃青衣 的冷醇、熱醇提取部位與生理鹽水相比能顯著降低小鼠的胸腺指數(shù)，升高荷瘤小 鼠的脾指數(shù)，延長h 2 2 小鼠的生命，降低癌細(xì)胞膜表面唾液酸含量的影響，具有 顯著的抑瘤作用。但值得注意的是，山核桃青衣的冷醇、熱醇提取部位可能具有 同環(huán)磷酰胺相同的副作用，抗腫瘤的同時(shí)使荷瘤小鼠體重減輕【1 。 山核桃青衣在臨床抗癌應(yīng)用研究中也有顯著效果。以山核桃青衣注射液( 每 支2 m l ，內(nèi)含相當(dāng)生藥4 9 的醇提物) 肌肉注射，每次2 4 m l ，每日1 2 次，能 改善癌癥癥狀，部分縮小腫塊，提高白血球與血小板的數(shù)量。在1 9 例食管癌及 賁門癌的治療中，療效令人滿意【坨】。 2 浙江工商大學(xué)碩上學(xué)位論文 1 1 3 山核桃青衣的除草作用和促進(jìn)作物生長作用 在山核桃的種植過程中發(fā)現(xiàn)，山核桃樹下其他植物如蘋果、松、雜草等都不 能生長，而其它樹下雜草叢生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山核桃青衣水提液和醇提液均含 有內(nèi)源抑制物質(zhì)，該物質(zhì)對其它植物種子的萌發(fā)和幼苗地上、地下部分生長有不 同程度的生化他感作用，主要表現(xiàn)為高濃度下抑制生長，低濃度下促進(jìn)生長。 用l g m l 以山核桃青衣的水提液和醇提液處理小麥、綠豆、蘿卜和黃瓜，結(jié) 果經(jīng)水提液處理的4 種作物種子的萌發(fā)率除小麥以外都小于1 0 ，而醇提液對蘿 卜和黃瓜的抑制率分別達(dá)到1 0 0 和8 7 5 。在l g m l 1 時(shí)兩種提取液對幼苗苗高 生長以及根的生長也有很強(qiáng)的抑制作用，且水提液抑制作用比醇提液的要強(qiáng)。山 核桃青衣的這一特性可被利用來生產(chǎn)生物除草劑，但是由于其對農(nóng)作物也有抑制 作用，還需進(jìn)一步研究其毒殺效應(yīng)，以得到對農(nóng)作物無毒而對雜草有毒殺作用的 有效成分1 1 3 j 。 實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，兩種提取液在低濃度下，可促進(jìn)部分種子萌發(fā)和幼苗生長，如 小麥，綠豆。但是更低濃度的提取液是否有促進(jìn)作用，其對不同作物的促進(jìn)的最 佳濃度還有待進(jìn)一步研究【l3 1 。 1 1 4 山核桃青衣的殺蟲作用 對山核桃青衣的殺蟲活性研究未見報(bào)導(dǎo)，但是有關(guān)胡桃科植物中核桃葉提取 物殺蟲活性的報(bào)道較多。翟梅枝等分別就核桃葉提取物對蚜蟲的觸殺作用、楊毒 蛾的生物活性以及粘蟲和小菜蛾的拒食活性進(jìn)行了研究。研究結(jié)果表明，核桃葉 提取物對蚜蟲具有較強(qiáng)的觸殺作用，擊倒作用隨濃度增大而增大。核桃葉提取物 對楊毒蛾具有較強(qiáng)的胃毒作用，但無拒食和觸殺作用。核桃葉9 5 乙醇冷提物 對小菜蛾有明顯的拒食作用；提取物的乙酸乙酯萃取部分對粘蟲有較明顯的拒食 作用【1 4 】。核桃葉的這種毒殺作用對山核桃青衣的研究有一定借鑒。 1 1 5 山核桃青衣的開發(fā)前景 山核桃具有極高的營養(yǎng)價(jià)值，其果殼外的青衣亦具有多種藥理活性。但山核 桃青衣中還含有內(nèi)源抑制物，這些物質(zhì)可通過生化他感作用抑制或毒殺其他生 物。山核桃生產(chǎn)加工后，其青衣如不加處理，任意堆放將使土壤中草木無法生長， 河水中生物死亡，這對生態(tài)環(huán)境是一種巨大的威脅。又由于近年來山核桃需求量 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 的增加，加工后山核桃青衣的丟棄量迅速擴(kuò)大，使得合理環(huán)保地處理青衣成為一 個(gè)棘手的問題，稍不注意就會造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。 根據(jù)已有知識，可以推測山核桃青衣中含有植物多糖，具有潛在的生物活性， 值得開發(fā)利用。到目前為止，國內(nèi)外對該青衣中多糖組分的結(jié)構(gòu)和活性的研究未 見報(bào)導(dǎo)。如能提取純化山核桃青衣多糖并研究其結(jié)構(gòu)和活性，將為有效利用山核 桃青衣多糖提供理論依據(jù)，從而能為山核桃生產(chǎn)中有毒廢棄物的處理問題提供一 條解決途徑。 1 2 植物多糖的研究現(xiàn)狀 1 2 1 引言 多糖( p o l y s a c c h a r i d e ) 及其綴合物是普遍存在于動(dòng)物細(xì)胞、植物細(xì)胞壁及細(xì)胞 中的一種成分，由于組成結(jié)構(gòu)不同，其理化特點(diǎn)及生物活性也各彳 相同。2 0 世 紀(jì)5 0 年代末真菌多糖抗癌效果的發(fā)現(xiàn)使人們開始了對多糖的深入研究。近年來， 植物多糖的研究口益受到重視，它們在抗腫瘤、抗病毒、抗輻射、抗?jié)?、降?糖及免疫調(diào)節(jié)等方面顯示出良好的應(yīng)用前景，而且?guī)缀鯖]有毒性，正愈來愈引起 國內(nèi)外藥理學(xué)家、生物學(xué)家和化學(xué)家們的興趣。如能從山核桃青衣中提取具有免 疫活性的多糖，即可以解決實(shí)際生產(chǎn)中產(chǎn)生的污染問題，又可以獲得一個(gè)寶貴的 功能因子，因此，對山核桃青衣中的多糖進(jìn)行研究是很有必要的。 1 2 2 植物多糖分離純化及結(jié)構(gòu)研究現(xiàn)狀。 1 2 2 1 多糖提取 植物體的組成成分極其復(fù)雜，在提取某種目標(biāo)產(chǎn)物時(shí)，勢必會有大量的雜質(zhì) 混入，為了能更專一地提取目標(biāo)產(chǎn)物，常常需要對樣品進(jìn)行一定的前處理。常用 的方法是用不同極性的溶劑脫去部分雜質(zhì)【1 5 ，16 ，1 刀。 多糖是一類含多羥基的極性大分子化合物，大多極易溶于水。在提取多糖時(shí) 一般先用丙酮、乙醇等將原材料先處理一次，脫除一些脂溶性物質(zhì)。然后采用熱 水、鹽、酸、堿或微波輔助等手段，于適宜的溫度下提取多糖。 由于多糖為極性化合物，在高濃度的有機(jī)溶劑中會析出形成絮狀沉淀，因此， 在提取得到的多糖水溶液中加丙酮、乙醇等可獲得多糖沉淀，經(jīng)離心或過濾后得 到多糖粗品。 4 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 2 2 2 脫蛋白 用水或稀堿在不同溫度下提取的多糖常含有蛋白質(zhì)，需要去除，常用的脫蛋 白方法有s e v a g 法、三氯乙酸法和三氟三氯乙烷法等。其中s e v a g 法采用的是 有機(jī)溶劑，條件較溫和，但是溶劑用量大且多糖損失也較大，而后兩種方法采用 的是強(qiáng)酸法，條件劇烈，但脫蛋白效率高。 1 2 2 3 脫色 從植物中提取的粗多糖中常含有較多的色素，可分為游離的和結(jié)合的，根據(jù) 其小同性質(zhì)可以采用不同的方法進(jìn)行脫色處理。常用的脫色方法有離子交換法、 氧化法、金屬絡(luò)合物法和物理吸附法【1 9 】。其中物理吸附法可供選擇的材料有活性 炭、硅藻土、纖維素等。 1 2 2 4 多糖分離 將所得的多糖分離、純化是多糖結(jié)構(gòu)和功能研究的基礎(chǔ)。多糖純化的方法有 很多，但只用某一種方法往往刁 能得到純的多糖，需結(jié)合兩種以上的方法才行。 常用的方法有以下幾種： ( 1 ) 有機(jī)溶劑分部沉淀法 性質(zhì)和種類不同的多糖在不同濃度的低級醇或酮溶液中的溶解度的性質(zhì)也 會有所差異，根據(jù)這種性質(zhì)，在多糖水溶液中逐次按比例由小至大加入醇或酮， 可逐級沉淀出多糖，這種方法即為有機(jī)溶劑分部沉淀法【2 0 1 。該方法適宜于分離各 種溶解度相差較大的多糖。 ( 2 ) 鹽析法 根據(jù)各種多糖存不同濃度鹽溶液中具有不同溶解度的性質(zhì)，加入小同鹽析劑 使之逐步析出的方i ! 去【2 1 ，2 2 1 。常用的鹽析劑由氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等。這種 方法實(shí)際上也是分部沉淀法的一種。 ( 3 ) 季胺鹽沉淀法 根據(jù)長鏈季胺鹽能與酸性多糖成鹽形成不溶性多糖化合物的特性，以分離酸 性多糖及中性多糖。常用的季胺鹽是十六烷基三甲基溴化銨( c t a b ) 和氯化十六 烷基吡啶( c p c ) 。實(shí)驗(yàn)時(shí)必須嚴(yán)格控制多糖混合物的p h 小于9 及無硼砂存在， 否則中性多糖也會沉淀出來 2 3 l 。通常c t a b 或c p c 水溶液的濃度為1 1 0 ( w v ) ，在攪拌下滴加于o 1 1 0 ( w v ) 的多糖溶液中，這時(shí)酸性多糖即能從中 性多糖中沉淀出來【2 引。一般的說，酸性強(qiáng)或分子量大的酸性多糖首先沉淀出來， 氣 浙江工商人學(xué)碩士學(xué)位論文 所以控制季胺鹽的濃度，也能分離各種不同的酸性多糖。根據(jù)形成的沉淀能溶于 不同的鹽溶液、酸溶液和有機(jī)溶劑的性質(zhì)，使多糖游離出來。 “) 陰離子交換柱層析 陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性多糖和中性多糖，在p h 7 時(shí)，酸性 多糖能吸附于交換劑上，中性多糖不吸附。用p h 相同，強(qiáng)度不同的緩沖液可將 酸性強(qiáng)弱不同的酸性多糖分別洗脫出來【2 5 2 引。 ( 5 ) 凝膠柱層析 凝膠柱層析也是多糖分離中常用的一種方法，它是根據(jù)多糖分子的大小和形 狀不同而達(dá)到分離目的【2 7 2 引。常用的凝膠有葡聚糖凝膠( s e p h a d e x ) 及瓊脂糖凝膠 ( s e p h a r o s e ) 系列。 ( 6 ) 制備性區(qū)域電泳 不同的多糖在電場的作用下按其分子大小、形狀及其所負(fù)電荷的不同而達(dá) 到分離【2 9 1 。這種方法分離效果較好，但只適宜于實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模應(yīng)用。 c 7 ) 超濾法 不同的超濾膜具有允許不同分子量和形狀的物質(zhì)通過的性質(zhì)，因此多糖溶液 通過各種已知的超濾膜就能達(dá)到分離【3 0 1 。 雖然現(xiàn)在已有比較通用的分離手段和技術(shù)，但由于糖鏈自身在組成、連接、 衍生化、微觀不均一性等方面的高度復(fù)雜性及其檢測上的困難，使得分離收集得 到的多糖純品成為一項(xiàng)摸索性很強(qiáng)的工作，每一種糖復(fù)合物而言，都意味著一個(gè) 新問題。 1 2 2 5 多糖純度鑒定 復(fù)合多糖是大分子化合物，它的純度標(biāo)準(zhǔn)不能用通常的小分子的純度標(biāo)準(zhǔn)來 衡量。因?yàn)榧词故嵌嗵羌兤罚湮⒂^也是小完全一致的。它的純度只代表某一多 糖的相似鏈的平均分布，我們通常所說的多糖純品實(shí)質(zhì)上是一定分子量范圍的組 分3 1 1 。純度鑒定通常有四種方法：比旋度法、超離心法、高壓電泳法及高效凝膠 滲透法。以上四種方法中前三種方法誤差較大，必須要結(jié)合兩種以上方法才能確 定其純度，目前最常用的且較可靠的方法是高效凝膠滲透法。 1 2 2 6 多糖相對分子量的測定 多糖經(jīng)鑒定其純度后，可以進(jìn)行后續(xù)的結(jié)構(gòu)和功能研究。分子量測定是其中 項(xiàng)重要指標(biāo)，因?yàn)榉肿恿看笮〔煌?，多糖的性質(zhì)也會不同，在應(yīng)用方面也有很 6 浙江工商大學(xué)碩上學(xué)位論文 大的差異?？捎糜诙嗵欠肿恿繙y定的方法有：滲透壓法【31 】、蒸汽法、端基法、光 散射法1 3 2 1 、粘度法【3 3 】和高效液相色譜法【3 4 ，3 5 1 等。 1 2 2 7 多糖結(jié)構(gòu)測定 按照蛋白質(zhì)和核酸的分析方法，多糖的結(jié)構(gòu)可分為：一級、二級、三級和四 級結(jié)構(gòu)。單糖為多糖的基本組成單元，單糖之間脫水形成糖苷鍵，并以糖苷鍵連 接形成多糖的二級結(jié)構(gòu)，有序的二級結(jié)構(gòu)在羥基、羧基、氨基以及硫酸基之間的 非共價(jià)相互作用下形成有規(guī)則的三級結(jié)構(gòu)，三級結(jié)構(gòu)的多聚鏈間經(jīng)非共價(jià)結(jié)合形 成的聚合體即為多糖的四級結(jié)構(gòu)。完整的多糖結(jié)構(gòu)分析包括對多糖的一級結(jié)構(gòu)和 高級結(jié)構(gòu)的分析。 ( 1 ) 多糖一級結(jié)構(gòu)分析 目前能有效分析多糖一級結(jié)構(gòu)的方法有化學(xué)方法、儀器分析方法和生物方 法。在多糖一級結(jié)構(gòu)的分析中大多采用化學(xué)方法與物理方法相結(jié)合，可基本闡明 某一多糖的一級結(jié)構(gòu)的大致特征。 1 ) 化學(xué)方法分析 化學(xué)方法主要包括水解法【3 6 ，3 7 1 、甲基化分析2 8 ，3 8 1 、s m i t h 降解2 8 ，3 們、高碘 酸氧化、二氧化鉻氧化法等，是多糖結(jié)構(gòu)分析中使用最古老且經(jīng)典的方法，可以 用來確定多糖的組成及糖鏈的連接方式，而且提供大量的其他結(jié)構(gòu)信息。 水解法是分析多糖鏈的單糖組成的主要手段。即將多糖在高溫下( 8 0 - - 1 2 0 。c ) 以強(qiáng)酸試劑作用一定時(shí)間( 2 1 0 h ) ，使多糖完全酸水解。水解的難易程度與組成 多糖的單糖性質(zhì)、單糖環(huán)的形狀和糖苷鍵的構(gòu)型有關(guān)。一般呋喃糖苷鍵較吡喃型 易水解，a 型較p 型易水解，含有糖醛酸或氨基糖的多不易水解。水解所得單糖 直接用液相色譜分析或經(jīng)衍生化后用氣相色譜分析，利用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定性和定 量。 高碘酸氧化反應(yīng)是一種選擇性的氧化降解反應(yīng)，能夠作用于糖分子連接二羥 基或三羥基處而生成相應(yīng)的醛或酸。該反應(yīng)是定量反應(yīng)，可從高碘酸的消耗以及 甲醛、甲酸的生成，判斷糖苷鍵的位置、直鏈多糖的聚合度、支鏈多糖的分支數(shù) 目等。高碘酸的氧化反應(yīng)必須控制條件進(jìn)行，避免副反應(yīng)的產(chǎn)生( 超氧化反應(yīng)) 。 一般使多糖與最小量的高碘酸反應(yīng)，溶液p h 值控制在3 - 一5 ，且應(yīng)避光、低溫， 同時(shí)需做空白試驗(yàn)。 甲基化反應(yīng)也是分析糖鏈結(jié)構(gòu)的有效途徑。它是用甲基化試劑將糖中羥基轉(zhuǎn) 7 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 化成甲醚，然后水解成部分或完全甲基化的單糖，鑒定這些甲基化的單糖產(chǎn)物就 可能推測出組成糖分子中單糖間連接位置及糖鏈的長度。近年來常用改良 h a k o m o r i 法在氮?dú)饬飨吕枚讈嗧亢蛷?qiáng)堿催化多糖快速過甲基化，產(chǎn)物單糖 揮發(fā)性變大，可用g c m s 分析，將所得信息與標(biāo)準(zhǔn)離子圖譜對照定性。 s m i t h 降解法是將高碘酸氧化產(chǎn)物進(jìn)行水解還原。多糖間以不同的位置縮合， 糖基中的連二或連三羥基被高碘酸修飾后，產(chǎn)生非環(huán)狀半縮醛，它較糖苷鍵易水 解，從水解產(chǎn)物的檢識來判定糖苷鍵的位置。 2 ) 儀器分析法 儀器分析法是糖鏈結(jié)構(gòu)分析不可缺少的手段。用于糖鏈結(jié)構(gòu)分析的方法主要 有紅外光譜法【3 9 ，4 0 1 、氣相色譜法【4 l 4 2 1 、質(zhì)譜【4 3 ，4 4 1 、核磁共振4 6 , 4 7 1 、快原子 轟擊質(zhì)譜【4 8 ，4 9 1 等。此外x 射線衍射分析法、激光拉曼( r a m a n ) 光譜法、熱譜法 等也可用來分析多糖鏈的結(jié)構(gòu)。 3 ) 生物學(xué)方法 主要利用特異性糖苷酶進(jìn)行酶法分析剛和免疫學(xué)法。酶法分析主要是利用各 種特異性糖苷酶水解多糖分子得到寡糖片段，再與其他定性，定量方法結(jié)合推測 多糖的結(jié)構(gòu)。由于酶解的高度專一性和放射性標(biāo)記方法的引入使得酶切方法十分 有效并廣為應(yīng)用。但這種方法最大的缺陷在于酶解結(jié)束后需要很多次分離才能確 定產(chǎn)物的流體動(dòng)力學(xué)體積。為了解決這個(gè)問題，試劑陣列分析方法孕育而生。免 疫學(xué)法是利用免疫方法分析糖鏈結(jié)構(gòu)的原理是利用多糖作為一種半抗原，抑制抗 體抗原的相互結(jié)合，不同的糖有不同的抑制常數(shù)，通過測定其抑制常數(shù)，再與 己知結(jié)構(gòu)的糖鏈相比較，有相似抑制常數(shù)的多糖，其結(jié)構(gòu)也相似。 ( 2 ) 多糖高級結(jié)構(gòu)的測定 迄今為止，己有幾百種多糖得到了分離純化，并確定了其一級結(jié)構(gòu)，同時(shí) 也發(fā)現(xiàn)多糖的一級結(jié)構(gòu)與其生物活性有密切關(guān)系，但越來越多的研究表明，多糖 的生物活性與其二級結(jié)構(gòu)乃至三級結(jié)構(gòu)的關(guān)系更為密切。因而研究多糖的高級結(jié) 構(gòu)更有助于闡明多糖的構(gòu)效關(guān)系。而目前用于多糖高級結(jié)構(gòu)分析的方法主要是物 理方法，諸如x - 射線纖維衍射、原子力光譜、核磁共振、理論算法、電子衍射 竹 乎。 原子力光譜1 5 1 1 ( a t o m i cf o r c em i c r o s c o p y , a f m ) 是在近幾年發(fā)展起來的，是研 究生物高分子構(gòu)象的有力工具。它首先把高分子溶液涂敷在云母片上，然后用連 8 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 接特殊原子探針的電子顯微鏡直接觀測生物高分子的形態(tài)和構(gòu)象。在多糖的構(gòu)象 研究方面，已成功地研究了線型剛性鏈的三螺旋1 3 一( 1 _ 3 ) 一d - 菌核葡聚糖經(jīng) 1 5 0 高溫處理后轉(zhuǎn)變?yōu)閺澢鷺?gòu)象；g e l l a n 在凝膠化過程中的構(gòu)象變化；果膠支 化情況和側(cè)鏈長度等。由于多糖類的生理功能主要是在人體的體液環(huán)境中才得以 實(shí)現(xiàn)。因此，如何通過實(shí)驗(yàn)方法了解多糖在浴液中的構(gòu)象顯得尤為重要。高分子 溶液研究的方法在這方面具有優(yōu)勢，即通過準(zhǔn)確測定多糖在溶液中的分子量、均 方根旋轉(zhuǎn)半徑和特性粘度【r l 】等數(shù)據(jù)，就可以按照溶液理論計(jì)算多糖在溶液中的 構(gòu)象。 1 2 3 植物多糖活性研究 多糖的保健功能是目前保健食品功能因子中研究焦點(diǎn)之一。而植物來源的多 糖與細(xì)菌來源的相比毒副作用小，是一種理想的藥物來源。近年來，有大量有關(guān) 植物多糖保健功能的研究報(bào)道，主要集中在以下幾個(gè)方面： 1 2 3 1 調(diào)節(jié)免疫功能 植物多糖最為突出而普遍的功能就是其對機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)5 2 ，5 3 1 ，主要 通過以下幾條途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用： ( 1 ) 巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞具有殺火多種病原微生物，吞噬凋亡損傷的細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞，促進(jìn) 和恢復(fù)免疫系統(tǒng)的功能。大量對植物多糖的研究結(jié)果f 5 4 5 5 , 5 7 1 發(fā)現(xiàn)，植物多糖具 有增加巨噬細(xì)胞數(shù)量、提高其吞噬能力和細(xì)胞毒活性的功能；此外植物多糖還可 改變巨噬細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子( 白細(xì)胞介素5 7 1 ，腫瘤壞死因子5 8 1 和i n o s t 5 9 ，6 0 】 等) 的能力。 ( 2 ) 淋巴細(xì)胞 黃耆根多糖1 6 1 1 、浮萍多糖1 6 2 1 、當(dāng)歸多糖1 6 3 1 等植物多糖能促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖， 誘導(dǎo)其分泌多種抗體( i g gi g e 等) 和細(xì)胞因子( 白細(xì)胞介素腳1 和腫瘤壞死因子6 5 】 等) ，加強(qiáng)機(jī)體的體液免疫功能【6 6 1 。 ( 3 ) 補(bǔ)體系統(tǒng) 植物多糖能通過不同途徑激活補(bǔ)體系統(tǒng)，有些多糖通過替代通路激活補(bǔ)體帆 6 引，有些則是通過經(jīng)典途徑【6 9 ，7 0 1 。 “) 植物多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)理 在發(fā)現(xiàn)植物多糖具有高效的免疫調(diào)節(jié)作用后，國內(nèi)外學(xué)者開始深入研究其作 q 浙江工商大學(xué)碩士學(xué)位論文 用機(jī)理，根據(jù)目前的研究結(jié)果顯示其基本機(jī)理為：植物多糖與免疫細(xì)胞表面受體 結(jié)合【5 8 ，7 u 或被內(nèi)吞進(jìn)入免疫細(xì)胞，隨后通過信號傳導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄，從 而調(diào)節(jié)細(xì)胞活性和細(xì)胞增殖或刺激其分泌一些細(xì)胞因子，提高細(xì)胞毒活性?，F(xiàn)已 發(fā)現(xiàn)的免疫細(xì)胞表面表達(dá)的活性多糖受體有p 一葡聚糖受體、甘露糖受體、半乳 糖受體、t o l l 樣受體1 7 2 1 ( t l r ) 、補(bǔ)體受體3 、c d l 4 ( c l u s t e ro f d i f f e r e n t i a t i o n1 4 ) 、 清除劑受體和d e c t i n - 1 受體家族【7 3 】等。植物活性多糖與這些受體結(jié)合后按照激活 細(xì)胞的不同傳到途徑可分為三種類型( 圖1 2 ) ： 第一種類型為：植物多糖與清除劑受體或補(bǔ)體受體3 結(jié)合，激活磷脂酶 c ( p l c ) ，磷脂酶c 進(jìn)一步激活蛋白激酶c ( p k c ) 和磷酸肌醇3 激酶( p 1 3 k ) ，這兩 種激酶具有三方面作用：第一它們可以增加細(xì)胞活性氧產(chǎn)生；第二它們可以激活 免疫細(xì)胞噬菌作用和內(nèi)吞作用；第三它們可進(jìn)一步激活致有絲分裂蛋白激酶 ( m a p k ) 、細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶( e r k ) 和n f k b 抑制因子的激酶( i k k ) ，其中 m a p k 和e r k 可直接激活核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄的信號因子或催化因子，i k k 可催化 n f k b 和n f k b 抑制因子( b o b ) 復(fù)合物中i l c b 的降解，從而釋放出n f k b 激活核 內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄。 第二種類型為：植物多糖與甘露糖受體或d e c t i n 1 受體結(jié)合，這種結(jié)合能直 接增加細(xì)胞活性氧產(chǎn)生，激活細(xì)胞噬菌作用和內(nèi)吞作用，或者通過i k k 釋放 n f k b 激活核內(nèi)基因轉(zhuǎn)錄。 第三種類型為：植物多糖與t o l l 樣受體4 或c d l 4 受體結(jié)合，在骨髓分化蛋 白8 8 ( m y d 8 8 ) 的介導(dǎo)下，這種結(jié)合能活化i l 1 聯(lián)合激酶( i r a k ) ，從而活化t n f 受體聯(lián)合因子6 ( t r a f 6 ) ，m a p 激酶( 如p 3 8 和j n k ) 以及n f r b 。 1 0 浙h 。i i 商太學(xué)碩l 學(xué)札論文 圈i - 2 午l _ 【物多櫧調(diào) 細(xì)胞發(fā)揮免疫活r l 的情日通道校剎i ”i p i g u r e1 2 s c h e m a t i cm o d e