（有機(jī)化學(xué)專(zhuān)業(yè)論文）甜味蛋白thaumatin晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制備方法研究.pdf

中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制備方法研究 專(zhuān)業(yè)：有機(jī)化學(xué) 碩士生：莫凌霄 指導(dǎo)老師：蔡繼文教授 摘要 本實(shí)驗(yàn)以一種提取自植物果實(shí)的甜味蛋白質(zhì)t h a u m a t i n 作為研究對(duì)象，對(duì)其 進(jìn)行基礎(chǔ)的晶體學(xué)研究。同時(shí)在前人對(duì)甜味蛋白機(jī)理的研究成果上，希望通過(guò)共 結(jié)晶法制備對(duì)t h a u m a t i n 甜味有影響的幾種鹽和蛋白質(zhì)的共結(jié)晶物，以研究甜味 蛋白的致甜機(jī)理。 研究重點(diǎn)集中在蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)影響因素和晶體重原子衍生物的制備上。尋 找蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的優(yōu)化條件一直是晶體生長(zhǎng)工作者的目標(biāo)，雖然不同的蛋白質(zhì) 有著不同的生長(zhǎng)條件，很難提出一個(gè)適合所有蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的條件，但是我們 可以通過(guò)研究一些常見(jiàn)因素對(duì)某種蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的影響來(lái)為其他蛋白質(zhì)晶體 生長(zhǎng)的研究提供一些經(jīng)驗(yàn)指導(dǎo)。對(duì)于t h a u m a t i n 晶體重原子衍生物的研究并不多， 在已有研究中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)有關(guān)金屬離子在t h a u m a t i n 蛋白晶體中結(jié)合位點(diǎn)的報(bào)道。 制備重原子衍生物一方面可以研究重原子與蛋白質(zhì)的結(jié)合位點(diǎn)，另一方面常被用 來(lái)解析未知蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。 在對(duì)晶體生長(zhǎng)影響因素的研究中，我們用懸滴法通過(guò)觀察、對(duì)比不同條件下 晶體的生長(zhǎng)情況，得到主要的影響因素以及每種因素對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響規(guī)律。主 要考察因素為溫度( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白質(zhì)溶液濃度( 4 0 m g m l 和2 0 m g m l ) ， 沉淀劑濃度( 包括酒石酸鈉鉀鹽和乙二醇) 、懸滴中蛋白質(zhì)溶液和池液比例 ( 3 p l ：2 t t l 和2 l ：2 此) 。研究手段為顯微鏡法觀察懸滴中溶液狀態(tài)及晶體生長(zhǎng) 情況，用x 射線(xiàn)衍射實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)對(duì)晶體進(jìn)行表征。 在重原子衍生物制備研究中，我們采用浸泡法來(lái)制備衍生物。同時(shí)由于s a d 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制備方法研究 結(jié)構(gòu)解析法的種種優(yōu)點(diǎn)，我們也嘗試用新報(bào)道過(guò)的碘擴(kuò)散法來(lái)制備可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并嘗試了用于s a d 法數(shù)據(jù)收集方法。 最終我們?cè)谒芯康? 種影響因素中找到了主要影響因素及其影響規(guī)律。得 到了高質(zhì)量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 單晶，并且在可重復(fù)制備蛋白質(zhì)晶體的 基礎(chǔ)上用碘擴(kuò)散法得到了晶體的碘原子衍生物。 關(guān)鍵詞：甜味蛋白，晶體結(jié)構(gòu)，s a d 法，碘原子衍生物 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 s t u d i e so nt h ec r y s t a l g r o w t ho ft h es w e e tp r o t e i n t h a u m a t i na n dt h ep r e p a r a t i o nm e t h o d so ft h eh e a v y a t o md e r i v a t i v e s m a j o r ：o r g a n i cc h e m i s t r y n a m e ：l i n g x i a om o s u p e r v i s o r ：p r o f j i w e nc a i a b s t r a c t w et a r g e to nt h es w e e tp r o t e i nt h a u m a t i nw h i c hi se x t r a c t e df r o mt h ef r u i to fo n e a f r i c a np l a n t7 ，婦“肋c c l 齬d a n i e l l i it os t u d yo nt h ef u n d a m e n t a lc r y s t a l l o g r a p h y m e t h o d s t og e tab e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h es w e e tm e c h a n i s m , w ea l s o 廿i e dt o o b t a i nt h e 眥r y s t a l so f s w e e tp r o t e i na n dt h ec o m p o u n d sw h i c h 撒r e p o r t e dt oa f f e c t t h es w e e td e n s i t yo f t h a u m a t i n o u rs t u d yf o c u s e do nt h ef a c t o r sa f f e c t i n gt h eg r o w t ho fp r o t e i nc r y s t a l s ，a sw e l la s t h e p r e p a r a t i o nm e t h o d so fh e a v ya t o md e r i v a t i v e s a sw e a i l k n o w , t h e c r y s t a l l o g r o p h i e ra l w a y sw a n t e dt of i n do u tt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rp r o t e i n c r y s t a lg r o w t h d i f f e r e n tp r o t e i n sm a yh a v ed i f f e r e n tg r o w t hc o n d i t i o n s ，a n di t s i m p o s s i b l et of i n do u tag e n e r a lc r y s t a l l i z i n gc o n d i t i o ns u i t e df o ra l lp r o t e i n s o u r s t u d yo nt h e f a c t o r sa f f e c t i n gac e r t a i np r o t e i nm a ys o m e h o wo f f e ru ss o m e e x p e r i e n c e so no t h e rp r o t e i n s c r y s t a lg r o w t h b yn o w , t h e r ei sl i t t l es t u d yn e i t h e ro n t h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e s , n o r0 1 1t h em e t a lb i n d i n gs i t ei nt h ec r y s t a l so f t h a u m a t i n s ot h es t u d yo nt h ep r e p a r a t i o no f h e a v ya t o md e r i v a t i v e sw h i c hc o u l ds h o wt h ed e t a i l i n f o r m a t i o no nt h ec o r r e s p o n d i n gb i n d i n gs i t e so ft h ep r o t e i nm i g h th e l pu sf i g u r eo u t t h es w e e tm e c h a n i s m 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制備方法研究 b ys t u d y i n gt h ea f f e c t e df a c t o r si nt h ep r o t e i nc r y s m lg r o w t h ，w ec o m p a r e dt h e p h e n o m e n o ni np r o t e i nd r o p su n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n su s i n gt h eh a n g i n gd r o p d i f f u s i n gm e t h o dt of i n do u tt h ek e yf a c t o r sa n dt h er u l e sb yw h i c ht h e ya f f e c t e dt h e c r y s t a lg r o w t h f o u rf a c t o r sw e r ei n v e s t i g a t e da t2 7 7 ka n d2 9 3 k ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r o t e i ns o l u t i o n f o r4 0 m g m la n d2 0 m g m l ，t h ec o n c e n t r a t i o no f p r e c i p i t a t e s i n c l u d i n gs o d i u mp o t a s s i u mt a r t r a t ea n dg l y c o l ，a n dt h ep r o p o r t i o no fp r o t e i ns o l u t i o n a n dw e l ls o l u t i o n t h em i c r o s c o p ew a su s e dt ow a t c ht h ep h e n o m e n o ni nt h e d r o pa n d t h ec r y s t a lg r o w i n gs i t u a t i o n ，a n dt h ec r y s t a l sw e r ec h a r a c t e r i z e db yt h ex r a y d i f f r a c t i o na n a l y s i s 。 i nt h es t u d yo ft h eh e a v ya t o md e r i v a t i v e sp r e p a r a t i o n ，s o a k i n gm e t h o dw a su s e dt o p r e p a r et h ed e r i v a t i v e s w ea l s ot r i e dt h en o v e lm e t h o dc a l l e dv a p o ri o d i n el a b e l m e t h o dt oo b t a i nt h ei o d i n ed e r i v a t i v e s ，b e c a u s et h i sk i n do fd e r i v a t i v e sc a nh e a p p l i e di ns i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o nt os o l v et h ep h a s ep r o b l e m f i n a l l y , w ef o u n do u tt h ek e yf a c t o r so ft h ef o u ri n v e s t i g a t e do n e sa n dt h ep a t t e r n s t h e ya f f e c t e d f o l l o w i n gt h ep a r e m s ，w eo b t a i n e dh i g hq u a l i t yc r y s t a l sw h i c h d i f f r a c t e dw e l li nx r a yd i f f r a c t i o ne x p e r i m e n t s b e s i d e s ，t h ei o d i n ed e r i v a t i v e sw e r e p r e p a r e ds u c c e s s f u l l yb yt h ev a p o ri o d i n el a b e lm e t h o d k e y w o r d s ：s w e e tp r o t e i nt h a u m a t i n ，c r y s t a ls t r u c t u r e ，s i n g l ea n o m a l o u sd i f f r a c t i o n ( s a d ) m e t h o d , i o d i n ed e r i v a t i v e s 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 第1 章緒論 1 1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究背景 1 1 1蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)研究及其研究方法的發(fā)展 了解蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)及其與功能的關(guān)系現(xiàn)在已經(jīng)成為科學(xué)研究的前沿。這 是由于生物大分子( 蛋白質(zhì)、多肽、核酸等) 以及其復(fù)合物參與了生物體內(nèi)幾乎 所有的生命活動(dòng)，是生物體內(nèi)各種生物功能的主要執(zhí)行者，而生物大分子三維結(jié) 構(gòu)的解析可以為認(rèn)識(shí)這些生命活動(dòng)提供更加全面的信息，可以幫助解釋很多生物 方面的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，同時(shí)精確的三維結(jié)構(gòu)信息讓定點(diǎn)突變和基于結(jié)構(gòu)的藥物分子設(shè) 計(jì)成為可能。所以蛋白質(zhì)以及其復(fù)合物的三維結(jié)構(gòu)的測(cè)定是解釋生命活動(dòng)機(jī)理， 研究生物體中分子結(jié)構(gòu)和功能關(guān)系，揭示生命現(xiàn)象本質(zhì)的研究基礎(chǔ)。目前為止已 經(jīng)解析出了很多生物大分子的三維結(jié)構(gòu)，其中對(duì)這些三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行的深入研究使 得我們了解到了很多生物大分子結(jié)構(gòu)和活性之間相互關(guān)系。 研究蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)主要有三種方法，分別為x 射線(xiàn)蛋白質(zhì)單晶衍射、核 磁共振( n m r ) 和三維電鏡的方法。其中，n m r 法只能測(cè)定生物大分子在溶液 中的結(jié)構(gòu)，所以其一般被用于研究分子在溶液中的動(dòng)力學(xué)特性。其缺點(diǎn)是只能解 析相對(duì)小分子量的蛋白質(zhì)( 約小于3 0 k d ) f i 】，而且分辨率不是很高。三維電鏡 適用于研究大的生物大分子復(fù)合物體系、膜蛋白以及全病毒的結(jié)構(gòu)。除此以外， 還有如中子衍射、熒光、電子衍射之類(lèi)的光譜技術(shù)和顯微技術(shù)以及計(jì)算機(jī)模擬的 方法也對(duì)生物大分子的結(jié)構(gòu)研究有一定的輔助作用。x 射線(xiàn)單晶衍射技術(shù)則適用 于研究各種大小的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以測(cè)定分子量達(dá)l o7 d 的全病毒以及2 5 x1 0 6 d 級(jí)別的核糖體1 2 3 1 ，同時(shí)其可在原子水平上對(duì)蛋白質(zhì)等的精細(xì)三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究。 這些優(yōu)點(diǎn)使得其在結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究中一直占據(jù)著不可替代的位置。 1 9 1 2 年l a u e 發(fā)現(xiàn)晶體對(duì)x 射線(xiàn)衍射，這就預(yù)示了x 射線(xiàn)晶體學(xué)的時(shí)代的 到來(lái) 4 1 ；隨著b r a g g 點(diǎn)陣?yán)碚摰陌l(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)小分子晶體結(jié)構(gòu)的測(cè)定，直到早期 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制備方法研究 d h o d g k i n 教授應(yīng)用這個(gè)方法得到了膽固醇、維生素d 、青霉素和維生素b 1 2 的 結(jié)構(gòu)，至今的1 0 0 年間x 射線(xiàn)晶體學(xué)技術(shù)一直飛快的發(fā)展著。蛋白質(zhì)等生物大 分子的結(jié)晶學(xué)可以追溯到十八世紀(jì)三十年代，此后人類(lèi)基因組的發(fā)現(xiàn)和后基因組 時(shí)代的到來(lái)讓蛋白質(zhì)晶體學(xué)的三維結(jié)構(gòu)解析成為揭示很多生物生理活動(dòng)以及相 關(guān)疾病的重要部分。 伴隨著新的生物技術(shù)，如自動(dòng)化篩選技術(shù)、重組d n a 技術(shù)等的不斷發(fā)展， x 射線(xiàn)衍射大分子結(jié)晶法已經(jīng)成為最重要的測(cè)得大分子結(jié)構(gòu)的方法之一。而近年 來(lái)結(jié)構(gòu)測(cè)定方法和所用儀器的快速發(fā)展及改進(jìn)更加鞏固了x 射線(xiàn)單晶衍射技術(shù) 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定中的主要地位。可變波長(zhǎng)的同步輻射加速器的使用和多波長(zhǎng)反 常散射方法的發(fā)展讓我們更容易獲得高分辨率和高質(zhì)量的衍射數(shù)據(jù)：冷凍技術(shù)的 應(yīng)用使得能在低溫收集數(shù)據(jù)，降低了對(duì)晶體的輻射損害和對(duì)晶體的質(zhì)量要求：各 種面探測(cè)器和c c d 的出現(xiàn)很大程度上提高了數(shù)據(jù)的收集速度；而計(jì)算機(jī)技術(shù)的 日益更新更加為晶體學(xué)的發(fā)展提供了強(qiáng)有力的計(jì)算工具。截至到2 0 0 7 年4 月1 2 日，在發(fā)表的4 2 7 5 2 個(gè)生物大分子結(jié)構(gòu)中，有3 6 3 2 6 個(gè)結(jié)構(gòu)都是用x 射線(xiàn)單晶 衍射技術(shù)得到的( 統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來(lái)自p r o t e i n d a t a b a n k 官方網(wǎng)站) 。蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu) 這種常用的技術(shù)方法可以為我們提供豐富的信息，比如特定原子的位置及其間的 作用關(guān)系、溶劑的親合力、分子內(nèi)的彈性區(qū)域等等，一般3 a 以上分辨率的結(jié)構(gòu) 就可以得到這些基本信息了。 1 1 2蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的應(yīng)用 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的貢獻(xiàn)之一就是蛋白質(zhì)3 d 結(jié)構(gòu)信息在生物化學(xué)和生物研究中的 顯著作用。如果我們想要明白生物作用過(guò)程和機(jī)理，就要研究生物體內(nèi)細(xì)胞中的 動(dòng)態(tài)過(guò)程，對(duì)這種動(dòng)態(tài)過(guò)程的應(yīng)答機(jī)制，外界化學(xué)和物理作用力怎么對(duì)大分子作 用以及這種作用是怎么被調(diào)節(jié)的，怎么被傳遞的；那么首先我們就要知道大分子 或是它們的復(fù)合物的結(jié)構(gòu)。這樣以精確的三維結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)可以并且已經(jīng)揭示了很 多重要生命過(guò)程。有名的例子之一就是細(xì)菌光合作用中心復(fù)合物以及細(xì)菌集光蛋 白復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的闡明，比較完整地揭示了細(xì)菌光合作用的運(yùn)行機(jī)理和光能高 效傳遞的時(shí)空關(guān)系和分子機(jī)制。 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 此外，3 d 結(jié)構(gòu)信息有助于在新藥的研制和發(fā)現(xiàn)中進(jìn)行合理藥物設(shè)計(jì)【5 ，6 l 。因 為一旦我們得到一個(gè)有活性位點(diǎn)的有效酶的結(jié)構(gòu)，就可以合理地設(shè)計(jì)可能的先導(dǎo) 化合物，通過(guò)看它們是否可以抑制或者影響酶的作用來(lái)進(jìn)行篩選：同時(shí)一些病毒 蛋白結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)也為病理學(xué)研究提供了重要依據(jù)，比如，h i v 蛋白酶以及與h i v 有強(qiáng)結(jié)合能力的糖蛋白c d 4 的三維結(jié)構(gòu)的報(bào)道，還有抗體抗原復(fù)合物結(jié)構(gòu)的測(cè) 定使我們對(duì)免疫反應(yīng)機(jī)制和規(guī)律有了深入了解。 另一個(gè)重要貢獻(xiàn)是其在蛋白質(zhì)基因工程中的應(yīng)用，也即有一種結(jié)構(gòu)指導(dǎo)使得 能有目的得，而不是盲目地對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行基因水平上改造。觀察到突變后的結(jié)構(gòu) 改變后，我們可以更有效的改變化學(xué)或是物理因素來(lái)進(jìn)行突變從而達(dá)到改造目的 川。 1 2 蛋白質(zhì)晶體特性及x 射線(xiàn)衍射法研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的過(guò)程 1 2 1 蛋白質(zhì)晶體與小分子晶體比較 作為結(jié)晶中的“大人物”，蛋白質(zhì)晶體的特性也很重要。了解蛋白質(zhì)晶體的 特性有助于我們?cè)诮Y(jié)晶實(shí)驗(yàn)中更好地對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)。 由于蛋白質(zhì)的特殊性質(zhì)，蛋白質(zhì)晶體同小分子晶體的差別是很大的。 首先，晶體中的溶劑含量不同。通常蛋白質(zhì)晶體中平均含有5 0 左右的溶 劑，雖然這個(gè)含量從2 0 到9 0 不等，但也遠(yuǎn)比小分子晶體中的含量要大。這 使得晶體中的溶劑與周?chē)芤汉苋菀捉粨Q，讓小分子自由擴(kuò)散進(jìn)出晶體，同時(shí)晶 體中蛋白質(zhì)問(wèn)有相對(duì)更大的空間可以容納相關(guān)小分子。一個(gè)實(shí)證就是酶結(jié)晶通常 表現(xiàn)出強(qiáng)的催化活性。 其次，蛋白質(zhì)晶體中分子間作用鍵( 鹽橋、氫鍵、疏水作用力等) 的數(shù)目與 分子質(zhì)量的比例比起通常的小分子要低很多，這導(dǎo)致了蛋白質(zhì)晶體中晶格作用力 很弱。 此外，溶劑通道和充滿(mǎn)溶劑的空穴造成了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和構(gòu)象動(dòng)力學(xué) 作用，并且由于分子間相對(duì)大的空間和晶體間弱的晶格力，使得晶體中的分子不 占據(jù)一定的位置和取向，所以即使在一個(gè)特定晶體中蛋白質(zhì)分子也可能在多肽鏈 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 或是側(cè)鏈基團(tuán)的相對(duì)位置上有微小的結(jié)構(gòu)變化，這種結(jié)構(gòu)易變性造成了衍射花樣 中有限的精確度，也使得蛋白質(zhì)晶體有形態(tài)多樣性( 如圖1 1 ) ；即使對(duì)于同一種 蛋白質(zhì)，在不同條件下結(jié)出的晶體也可能有完全不同的形態(tài)和外型，甚至是晶胞 參數(shù)等【8 】。 圖l l 幾種蛋白質(zhì)的晶體( a ) 促黃體生成激素的p 亞單位，( b ) 煙草花葉衛(wèi)星病毒 ( s a t e l l i t et o b a c c om o s a i cv i r u s ) ，( c ) c h 2 結(jié)構(gòu)域切除的人體抗體，( d ) 甜味蛋白 t h a u m a t i n ，( e ) 雀麥草( b r o m e ) 花葉病毒，( f ) 種子中的刀豆球蛋i ! t ( c a n a v a l i n ) 小分子晶體一般有強(qiáng)的晶格力，相對(duì)高度有序的。它們一般物理強(qiáng)度較大比 較硬，易破碎，在空氣中穩(wěn)定，所以容易操作：有很好的光學(xué)特性，適于x 射 線(xiàn)衍射。相比較起來(lái)，蛋白質(zhì)晶體衍射實(shí)驗(yàn)對(duì)蛋白質(zhì)晶體的體積要求就高一些， 而且蛋白質(zhì)晶體比較軟，暴露在空氣中容易失水、風(fēng)化成粉，對(duì)溫度和射線(xiàn)敏感， 故操作起來(lái)難度要高很多：此外它們的光學(xué)特性不如小分子晶體，在x 射線(xiàn)衍 射中表現(xiàn)也差一些。 除了上面提到的不同點(diǎn)外，蛋白質(zhì)晶體還有其他不同于普通小分子晶體的三 個(gè)特點(diǎn)：第一，大分子可能呈現(xiàn)不同的形態(tài)，比如沉淀，油狀物，凝膠或者晶體， 其中很多是在動(dòng)力學(xué)上有利的。第二，對(duì)大分子而言，要達(dá)到使其長(zhǎng)出晶核的超 4 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 飽和狀態(tài)比維持晶核生長(zhǎng)的狀態(tài)要高得多，通常高出兩到三個(gè)數(shù)量級(jí)。第三，由 于體積大，擴(kuò)散度低，相互作用弱并且不易從成核轉(zhuǎn)入生長(zhǎng)狀態(tài)，大分子晶體成 核和生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)比普通小分子慢很多。 蛋白質(zhì)晶體的這些性質(zhì)使得蛋白質(zhì)結(jié)晶比小分子結(jié)晶復(fù)雜很多，兩者的生長(zhǎng) 方法和解析過(guò)程都有很大的差異。在后面的實(shí)驗(yàn)中我們可以看到這種差異。 1 2 2x 射線(xiàn)衍射法研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的簡(jiǎn)要過(guò)程 第一步結(jié)晶：解析蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)的前提是制備均一的蛋白質(zhì)樣品并得到 其單晶。在多數(shù)情況下，這一步需要通過(guò)大量的條件篩選和優(yōu)化以使長(zhǎng)出的單晶 符合衍射實(shí)驗(yàn)的條件。 第二步數(shù)據(jù)收集：通常利用x 射線(xiàn)光束照射在一定角度范圍內(nèi)旋轉(zhuǎn)的蛋白 質(zhì)晶體，同時(shí)記錄晶體對(duì)x 光散射的強(qiáng)度。強(qiáng)度值被轉(zhuǎn)換為結(jié)構(gòu)測(cè)定中的結(jié)構(gòu) 因子振幅( 1 f i ) 。 第三步相角的測(cè)定：結(jié)構(gòu)因子振幅( i f i ) 及相角( c t h u ) 是物理上相對(duì)獨(dú) 立的量。由于結(jié)構(gòu)因子相角的全部信息在收集數(shù)據(jù)時(shí)丟失，因此必須通過(guò)其他途 徑來(lái)得到它們的信息。相角問(wèn)題是續(xù)晶體獲得之后的又一個(gè)難題。 第四步相角的改進(jìn)：電子密度圖的質(zhì)量及其后的可解釋性主要決定于相角 的準(zhǔn)確性。有的情況下采用晶胞不對(duì)稱(chēng)單元中等價(jià)部分的電子密度平均，有可能 大大改善誤差較大的初始相角，使其得到優(yōu)化。 第五步電子密度圖的計(jì)算：相位確定后可以開(kāi)始計(jì)算電子密度圖。對(duì)于高 分辨率的數(shù)據(jù)( 衍射數(shù)據(jù)至少達(dá)到3 5 a ) ，從電子密度圖就可以跟蹤出肽鏈走向、 二級(jí)結(jié)構(gòu)等，從而可能推出肽鏈的三維折疊方式等。再在一級(jí)結(jié)構(gòu)( 氨基酸序列) 的基礎(chǔ)上構(gòu)建出原子坐標(biāo)形式的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)模型。 第六步結(jié)構(gòu)精修：結(jié)構(gòu)的修正可以采用程序中的自動(dòng)修正，或者手工進(jìn)行。 精修可以鍵長(zhǎng)、鍵角，b f a c t o r 等的限制為依據(jù)來(lái)進(jìn)行。此外精修中需要加入位 于蛋白質(zhì)周?chē)⑼溆兄苯幼饔玫乃肿樱瑥亩奖憧疾闅滏I作用。精修這步一 般需要反復(fù)進(jìn)行，以取得更好的數(shù)據(jù)和更精確的結(jié)構(gòu)。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 1 3 甜味蛋白t h a u m a t i n 研究背景 1 3 1蛋白質(zhì)來(lái)源 t h a u m a t i n 是一類(lèi)存在于熱帶植物t h a u m a l o c o c c u $ d a n i e l l i ib e n t h 果實(shí)中的 甜蛋白。該蛋白具有組織表達(dá)特異性，僅發(fā)現(xiàn)于這種植物的肉質(zhì)假種皮中。1 9 7 2 年，荷蘭科學(xué)家v a n d e r w j l 首次將其從該植物漿果中提取出來(lái) 9 1 。天然提取出 來(lái)的t h a u m a t i n 結(jié)構(gòu)并不完全一樣，其由一個(gè)多基因的家族編碼，最少存在6 7 種相近的蛋白質(zhì)產(chǎn)物，其中最主要的兩種蛋白為t h a u m a t i ni 和i i ，其分子量分 別為2 2 ，2 0 9 d a 和2 2 ，2 9 3 d a t t o l 。這兩種蛋白由2 0 7 個(gè)氨基酸組成，只有5 個(gè)殘基 的不同。 目前t h a u m a t i n 的來(lái)源主要有兩個(gè)方面：一、天然植物提取 9 1 ：從果實(shí)原料 中一般采用提取單一的水抽提法，為了保持產(chǎn)品的天然特性，僅利用物理方法進(jìn) 行過(guò)濾和超濾，再通過(guò)凝膠過(guò)濾、離子交換色譜分別得到純的t h a u m a t i ni 和i i 。 據(jù)報(bào)道l k g 果實(shí)可提取出9 0 0 m g 的t h a u m a t i n ：二、利用基因工程：將重組的 t h a u m a t i n 基因在微生物或植物中進(jìn)行表達(dá)，再將其提取出來(lái)。此外改變基因序 列可以得到不同味道特性的蛋白【】。 1 3 2 t h a u m a t i n 的特性 研究發(fā)現(xiàn)這種甜味蛋白是一種堿性蛋白。極易溶于水，但是不易溶于有機(jī)溶 劑，其等電點(diǎn)約為1 2 0 ，并且其等電點(diǎn)和甜味活性按著c ，b ，孔i 和i i 的順序依次增 加【”j 。肽鏈中存在的1 6 個(gè)半胱氨酸可以形成8 個(gè)二硫鍵，二硫鍵被還原的 t h a u m a t i n 會(huì)有一種快速的自我水解作用，并且在合適底物存在的情況下，被還 原的t h a u m a t i n 會(huì)顯示出蛋白酶、酰胺酶及酯酶活性。有文獻(xiàn) t 3 l 通過(guò)研究 t h a u m a t i ni 和i i 的光譜學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)在溫度逐漸升高的情況下蛋白會(huì)發(fā)生可逆的 構(gòu)象改變，并且在固定溫度下改變p h 時(shí)，會(huì)發(fā)生不可逆熱變性。在p h i 5 0 時(shí)天 然構(gòu)象最穩(wěn)定，此時(shí)加熱至q 7 5 c ，構(gòu)象變化也是可逆的。還有研究發(fā)現(xiàn)在p h ，j , 于5 5 ，溫度高于1 0 0 c 時(shí)這種蛋白質(zhì)也不會(huì)失去甜味【1 4 1 。即使在巴氏殺菌法的條 6 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 件下蛋白質(zhì)也仍然是穩(wěn)定的，將t h a u m a t i ni x 一個(gè)小時(shí)后，一旦其冷卻下來(lái)它的 甜味就會(huì)恢復(fù)【1 5 l 。這種穩(wěn)定性可能跟其二硫鍵有判1 6 1 。還有研究報(bào)道1 1 7 1 3 1 對(duì)蛋 白質(zhì)中賴(lài)氨酸等殘基進(jìn)行突變可以影響其甜味，所以這些殘基可能在其引起甜味 的過(guò)程中起到重要作用。 t h a u m a t i n 的另一個(gè)特性就是可作為食品。這種蛋白可以引起甜味，并且它 的甜度是等質(zhì)量蔗糖的3 0 0 0 倍。它的甜味持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。對(duì)人體和動(dòng)物都無(wú)害，并 且不會(huì)引起牙病，可被糖尿病人食用【1 9 1 。早在1 9 7 9 年，t h a u m a t i n 就已經(jīng)在日本 市場(chǎng)上被作為甜味劑和調(diào)味劑商品來(lái)出售了，并被美國(guó)的f e m a 批準(zhǔn)用于口香糖 生產(chǎn)中剛。 1 3 3t h a u m a t i n 的主要研究方向 迄今為止關(guān)于t h a u m a t i n 的研究集中在3 個(gè)方面： 1 3 3 1 晶體學(xué)基礎(chǔ)研究 由于t h a u m a t i n 是最早通過(guò)x 射線(xiàn)單晶衍射法得到三維結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)之一，又 因?yàn)槠涮崛〖兓容^簡(jiǎn)單，蛋白質(zhì)容易得到，所以t h a u m a t i n 經(jīng)常被用于基礎(chǔ)的 晶體學(xué)研究中。 在一些基本的理論研究中，t h a u m a t i n 常被做為實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行研究來(lái)為蛋白 質(zhì)晶體學(xué)研究提供數(shù)據(jù)。比如在失重情況下生長(zhǎng)t h a u m a t i n 的晶體，通過(guò)對(duì)其結(jié) 晶的動(dòng)力學(xué)研究，來(lái)觀察失重情況對(duì)蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)影響 2 1 1 。為了考察一些物 理化學(xué)因素對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)晶的貢獻(xiàn)，有人通過(guò)動(dòng)態(tài)光散射方法對(duì)t h a u m a t i n 的結(jié)晶 體系進(jìn)行研究 2 2 1 ；在a f m 法 2 3 1 研究大分子結(jié)晶中的表面形態(tài)學(xué)、生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)、 結(jié)構(gòu)缺陷等方面和考察壓力和凝膠( 如甘油) 對(duì)蛋白質(zhì)晶體質(zhì)量和生長(zhǎng)影響 2 4 2 s ! 時(shí)，t h a u m a t i n 也被作為主要研究對(duì)象之一。此外在晶體性質(zhì)研究中，t h a u m a t i n 被用作標(biāo)準(zhǔn)蛋白，通過(guò)凝膠穿刺技術(shù)探討毛細(xì)管中晶體生產(chǎn)速率而用來(lái)模擬生長(zhǎng) 細(xì)胞中晶體的生成情況瞄】。 1 3 3 2 甜味機(jī)理的研究 雖然甜味劑使用時(shí)間已經(jīng)長(zhǎng)達(dá)一個(gè)世紀(jì)了，但是甜味劑，包括甜昧蛋白和小 分子甜味劑的致甜機(jī)理都還一直沒(méi)有弄清楚。而t h a u m a t i n 作為一種典型的甜味 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 蛋白自然是一直以來(lái)的研究對(duì)象。對(duì)t h a u m a t i n 的甜味機(jī)理研究一般從兩個(gè)方面 入手：一方面在t h a u m a t i n 本身構(gòu)效關(guān)系研究中，通過(guò)其晶體結(jié)構(gòu)及衍射結(jié)構(gòu)數(shù) 據(jù)，再結(jié)合味覺(jué)實(shí)驗(yàn)等手段，了解其結(jié)構(gòu)與甜味產(chǎn)生間的關(guān)系。比如，知道側(cè)鏈 氨基酸的排列方向，可以確定哪個(gè)側(cè)鏈與受體分子相互作用，或者同另一側(cè)鏈的 疏水或氫鍵作用。通過(guò)加強(qiáng)或減小這些內(nèi)部作用可能產(chǎn)生的味覺(jué)效果。再比如， 知道了甜味產(chǎn)生的活性位點(diǎn)，就可以設(shè)計(jì)出與其相似的蛋白質(zhì)或者肽鏈，生產(chǎn)出 更好口感的甜味劑。另一方面在味覺(jué)研究中，因其于甜味受體的強(qiáng)結(jié)合作用，用 作探針來(lái)研究甜味產(chǎn)生機(jī)理，以便更好地了解其與受體相互作用以及甜味產(chǎn)生機(jī) 理。 1 3 3 3 轉(zhuǎn)基因研究 在工業(yè)生產(chǎn)中，人們將基因工程等應(yīng)用于其生產(chǎn)研究中，以生成出低成本高 產(chǎn)量的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物，或者研究開(kāi)發(fā)出更好的新型品種。 由于t h a u m a t i n 來(lái)源植物對(duì)生活環(huán)境有嚴(yán)格要求，在很多地方引種都不能成 功，不能滿(mǎn)足人們對(duì)這種甜味蛋白的大量需求。為了得到大量的t h a u m a t i n ，科 學(xué)家們?cè)群髮⑵淇寺〉酱竽c桿菌、酵母中，但因缺乏相應(yīng)的蛋白質(zhì)加工系統(tǒng)， 其在基因轉(zhuǎn)錄后難以形成正確的高級(jí)結(jié)構(gòu)，所以得不到所需的蛋白質(zhì)產(chǎn)物。于是 發(fā)展了其植物基因工程。1 9 9 0 年，w i t t y 等總結(jié)前人經(jīng)驗(yàn)，利用毛根轉(zhuǎn)化技術(shù)成 功地將t h a u m a t i n 基因在馬鈴薯中進(jìn)行了表達(dá)，使得t h a u m a t i n 成為第一個(gè)在轉(zhuǎn)基 因植物中被表達(dá)的甜味蛋白【硎。 1 4 選題意義及課題進(jìn)展 1 4 1 選題意義 盡管有著種種的優(yōu)點(diǎn)，x 射線(xiàn)衍射技術(shù)最大的缺點(diǎn)就是不容易獲得蛋白質(zhì)單 晶或者得到的單晶質(zhì)量太差。由于蛋白質(zhì)以及其晶體的種種特性，使得其不像小 分子那樣容易結(jié)晶，要獲得好的衍射數(shù)據(jù)的高質(zhì)量、大體積蛋白質(zhì)晶體更加不容 易；很多時(shí)候即使能長(zhǎng)出微晶體，也不一定能長(zhǎng)出足夠尺寸的晶體。蛋白質(zhì)晶體 的獲得可以說(shuō)是x 射線(xiàn)衍射法獲得蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的“瓶頸”。 8 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 所以從出現(xiàn)x 射線(xiàn)單晶衍射技術(shù)開(kāi)始，蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)就被廣泛并且深入 地研究。從蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)過(guò)程到其生長(zhǎng)機(jī)理研究中，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多有 利于或者不利于蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的因素，也對(duì)蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)方式、缺陷種類(lèi) 等進(jìn)行了定義和總結(jié)。盡管對(duì)于蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)有著很長(zhǎng)的研究歷史，但是目前 為止，多數(shù)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)時(shí)，仍然需要采用嘗試的方法。因?yàn)榫w 生長(zhǎng)的影響因素太多了，而且很難得到某一個(gè)一定的有指導(dǎo)意義的晶體生長(zhǎng)條件 或方法，尤其是對(duì)于一個(gè)新的蛋白質(zhì)。但是盡管如此，對(duì)生物體細(xì)胞內(nèi)大分子( 包 括蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)和多聚糖) 結(jié)構(gòu)及其相互作用等信息的迫切需要讓科學(xué)家 們不辭艱辛要去獲得完美的大分子晶體。對(duì)于很多化學(xué)家和生物學(xué)家，尤其是結(jié) 構(gòu)生物學(xué)家，x 射線(xiàn)衍射法得到晶體結(jié)構(gòu)作為唯一可以得到原子水平上結(jié)構(gòu)信息 的一種方法做出了很多的貢獻(xiàn)。 正是在這樣的蛋白質(zhì)晶體研究背景下，為了給新建結(jié)構(gòu)生物學(xué)平臺(tái)的發(fā)展和 后續(xù)研究打下基礎(chǔ)，我們以甜味蛋白為例，在獲得高衍射質(zhì)量蛋白質(zhì)晶體和好的 結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，對(duì)蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的主要影響因素和晶體結(jié)構(gòu)的解析方法進(jìn) 行了研究。此外我們還嘗試了獲得甜味蛋白晶體的金屬共結(jié)晶物或衍生物，以及 用一種新的1 2 擴(kuò)散法得到甜味蛋白晶體的重原子衍生物。 在本課題中我們以甜味蛋白為主要研究對(duì)象，沿著其前2 個(gè)研究方向：一方 面從蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)因素和重原子衍生物來(lái)對(duì)其進(jìn)行晶體學(xué)基礎(chǔ)研究，另一方面 在前人研究的基礎(chǔ)上通過(guò)金屬鹽共結(jié)合物的制備對(duì)其甜味機(jī)理進(jìn)行探索。 1 4 2 課題進(jìn)展 我們的研究集中在蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)影響因素和晶體重原子衍生物的制備上。 在對(duì)晶體生長(zhǎng)影響因素的研究中，我們使用懸滴法對(duì)甜味蛋白t h a u m a t i n 進(jìn)行結(jié) 晶。通過(guò)觀察、對(duì)比不同條件下液滴及晶體的生長(zhǎng)情況，得到主要的影響因素以 1 一 及每種因素對(duì)晶體生長(zhǎng)的影響規(guī)律。我們考察的因素一共有4 種，分別為溫度 ( 2 7 7 k 和2 9 3 k ) 、蛋白質(zhì)溶液濃度( 4 0 m g , m l 和2 0 m g m l ) 、沉淀劑濃度( 包 括酒石酸鈉鉀鹽和乙二醇) 、懸滴中蛋白質(zhì)溶液和池液比例( 3 _ t l ：2 9 l 和 2 吐：2 此) 。研究手段為顯微鏡法觀察懸滴中溶液狀態(tài)及晶體生長(zhǎng)情況，用x 射 9 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 線(xiàn)衍射實(shí)驗(yàn)的方法來(lái)對(duì)晶體進(jìn)行表征。 在重原子衍生物制備研究中，我們采用浸泡法來(lái)制備衍生物。同時(shí)由于s a d 結(jié)構(gòu)解析法的種種優(yōu)點(diǎn)，我們也嘗試用新報(bào)道過(guò)的碘擴(kuò)散法來(lái)制備可以用于s a d 法的碘原子衍生物，并嘗試了用于s a d 法數(shù)據(jù)收集方法。 最終我們?cè)谒芯康? 種影響因素中找到了主要影響因素及其影響規(guī)律。得 到了高質(zhì)量，高衍射分辨率的t h a u m a t i n 單晶，并且在可重復(fù)制備蛋白質(zhì)晶體的 基礎(chǔ)上用碘擴(kuò)散法得到了晶體的碘原子衍生物。但是由于時(shí)間關(guān)系，我們沒(méi)有用 s a d 法解出晶體結(jié)構(gòu)，碘擴(kuò)散制備碘原子衍生物法的優(yōu)化也還有待繼續(xù)研究。 i o 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 第2 章蛋白質(zhì)晶體的培養(yǎng) 2 1 蛋白質(zhì)晶體的生長(zhǎng)階段、主要培養(yǎng)方法及影響因素 2 1 1 蛋白質(zhì)晶體的三個(gè)生長(zhǎng)階段 所有晶體的結(jié)晶過(guò)程都可以被分為三個(gè)階段：超飽和度的達(dá)到、成核階段和 生長(zhǎng)階段。 超飽和狀態(tài)是指在一定條件下，大分子濃度高于溶解度的一個(gè)非平衡態(tài)。高 濃度溶液中，大分子首先形成大小不等的非晶態(tài)沉淀，當(dāng)達(dá)到超飽和狀態(tài)并且能 量足夠低時(shí)溶劑分子就可以有足夠的時(shí)間和機(jī)會(huì)將自己排列到晶格中，有序地凝 聚，從而形成一定大小的晶核，繼而長(zhǎng)成完整的晶體。也就是一個(gè)晶核不斷形成， 同時(shí)不斷長(zhǎng)大的過(guò)程。因此超飽和度的適當(dāng)達(dá)到是很重要的，如果超飽和度太高， 晶核數(shù)量大，會(huì)導(dǎo)致晶體過(guò)快析出，容易形成微晶甚至是不定形物；如果超飽和 度太低，成晶速度會(huì)很慢，可能長(zhǎng)不出晶體或者晶體還沒(méi)有長(zhǎng)成就被破壞了。 超飽和度是結(jié)晶的必需條件之一。由于蛋白質(zhì)形狀、性質(zhì)上的復(fù)雜性，并且 蛋白質(zhì)受電解質(zhì)性質(zhì)、濃度、p h 、溫度以及各種其他因素的影響，在不同條件 下其有不同的溶解度最小值，甚至是由于母液性質(zhì)的稍稍改變就可能結(jié)出不同晶 型的晶體，比如溶菌酶、核糖核酸酣2 8 】等等。因此想要找到適合用于x - r a y 衍射 實(shí)驗(yàn)的晶體就要組合各種不同的實(shí)驗(yàn)條件，從中篩選出可以產(chǎn)生晶體的最小溶解 度的條件組合。有的文獻(xiàn)中建議在一系列不同的p h 下，就一個(gè)給定的沉淀劑來(lái) 測(cè)定蛋白質(zhì)的沉淀點(diǎn)，并且在不同溫度下重復(fù)。一般而言，我們可以通過(guò)一下幾 種途徑來(lái)達(dá)到適合的超飽和狀態(tài)【7 】：( a ) 改變蛋白質(zhì)本身來(lái)降低它的溶解度或者 是增加各個(gè)蛋白質(zhì)分子彼此間的吸引力，比如改變p h 使得表面氨基酸殘基的離 子化狀態(tài)發(fā)生改變；也可以應(yīng)用重組基因工程，通過(guò)改變活性位點(diǎn)的殘基或者加 入小分子結(jié)合物對(duì)蛋白質(zhì)從結(jié)構(gòu)上進(jìn)行修飾；( b ) 改變?nèi)芤盒再|(zhì)來(lái)降低它對(duì)蛋白 質(zhì)的溶解能力，比如減小其化學(xué)活性或者加入鹽：( c ) 改變蛋白質(zhì)分子和溶劑之 間的作用力，比如加入高聚物或者離子。具體各種不同的方法在很多文獻(xiàn)中已有 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 描述 2 9 - 3 2 1 。 第二個(gè)階段就是成核，成核是這3 個(gè)階段中最難解決的。對(duì)于成核機(jī)理的研 究在這里就不詳細(xì)論述了。我們關(guān)心的是如何讓蛋白質(zhì)進(jìn)入這個(gè)階段。影響成核 的因素包括超飽和度、分子尺寸和添加物的表面自由能。高的蛋白質(zhì)濃度可以加 快成核的速率，不過(guò)如果這個(gè)高濃度形成的太快就有可能長(zhǎng)出非晶態(tài)沉淀。最好 是使體系非常緩慢的趨向于溶解度最小，從而達(dá)到有限的過(guò)飽和度。 第三個(gè)階段晶體的生長(zhǎng)相對(duì)于成核就容易很多了，并且其機(jī)理已經(jīng)被完全研 究清楚了。 在這3 個(gè)階段中，超飽和狀態(tài)是最重要的階段，因?yàn)樗?qū)動(dòng)其他2 個(gè)階段的 形成并且決定它們的發(fā)生和進(jìn)行程度。在下面提到的一些影響因素和技術(shù)中很多 都是通過(guò)作用于超飽和度來(lái)影響結(jié)晶過(guò)程的。 2 1 2 晶體生長(zhǎng)的影響因素 蛋白質(zhì)結(jié)晶受很多因素影響( 見(jiàn)表2 - 1 ) 7 1 ，其中的很多因素都是相互影響 的，這使得整個(gè)影響關(guān)系變得很復(fù)雜。在所有這些因素中，最重要的因素有四個(gè)， 分別為溫度、p h 值、沉淀劑( 或鹽) 和蛋白質(zhì)純度。 溫度變化是常用的誘導(dǎo)結(jié)晶的因素之一，一般蛋白質(zhì)的結(jié)晶溫度都在4 3 5 ：大多數(shù)情況下都是在一個(gè)固定溫度下改變其他條件進(jìn)行篩選的。 在其他條件不變的情況下，p h 通常會(huì)影響蛋白質(zhì)的溶解度。因?yàn)閜 h 可以 反映蛋白質(zhì)的氨基酸組成和其三維結(jié)構(gòu)。有研究表f 1 ) j 3 3 , 3 4 1 ，蛋白質(zhì)可以在等電點(diǎn) 達(dá)到其最小溶解度，等電點(diǎn)為不使蛋白質(zhì)在電場(chǎng)中發(fā)生遷移的p h 值。 要選擇一個(gè)合適的沉淀劑很關(guān)鍵，也相當(dāng)麻煩。沉淀劑可以分為兩類(lèi)：鹽和 有機(jī)溶劑。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的常用沉淀劑有硫酸鹽、乙酸鹽、乙醇、聚乙二醇、m p d 等等。需要強(qiáng)調(diào)的是，透析法中是不能使用p e g 作為沉淀劑的，這是由于p e g 分子不能穿過(guò)透析膜；所以p e g 一般用于批量結(jié)晶、汽相平衡等方法。此外也 可以使用二組分沉淀劑體系，就是說(shuō)體系中可以同時(shí)含有鹽和有機(jī)溶劑或者同時(shí) 含有兩種不同的鹽。其相關(guān)研究早在二十世紀(jì)六十、七十年代就有報(bào)道。各種沉 淀劑和它們的性質(zhì)也都被詳細(xì)地研究總結(jié)過(guò) 7 , 2 8 , 3 0 1 。 1 2 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 雖然在結(jié)晶之前所有的因素都要被考慮到，并且對(duì)于不同的蛋白質(zhì)樣品需要 考慮的側(cè)重點(diǎn)不同，但是樣品的純度是被最頻繁提到的；一般而言，越純的蛋白 質(zhì)越容易結(jié)晶，也越容易結(jié)出好的晶體。通常要求蛋白質(zhì)純度在9 0 以上就可 以用于結(jié)晶實(shí)驗(yàn)了。 表2 1 各種影響蛋白質(zhì)結(jié)晶的因素 2 1 3 蛋白質(zhì)晶體的主要培養(yǎng)方法 蛋白質(zhì)在不同條件下溶解度的不同導(dǎo)致了同一種蛋白質(zhì)的不同形態(tài)晶體的 形成，例如核糖核酸酶( r i b o n u c l e a s e ) 、酵母苯丙氨酸轉(zhuǎn)移核糖核酸( y e a s t p h e n y l a l a n i n e - t r n a ) 2 8 1 。這種現(xiàn)象的成因之一就是蛋白質(zhì)的結(jié)晶受p h 、溫度、 沉淀劑、重力、蛋白質(zhì)純度以及其他因素影響，所有這些因素都給合適的結(jié)晶條 件的獲得增加了難度。為了得到高質(zhì)量可用于x 射線(xiàn)衍射并且可產(chǎn)生完美衍射 數(shù)據(jù)的晶體，我們首先要找到可以產(chǎn)生晶體物質(zhì)的各種化學(xué)、物理和生化條件。 然后改善優(yōu)化這些條件從而得到想要的晶體。這兩個(gè)階段分別被稱(chēng)為篩選和優(yōu) 化，它們?cè)谒械牡鞍踪|(zhì)結(jié)晶中都是必需的過(guò)程。 甜味蛋白t h a u m a t i n 晶體生長(zhǎng)及重原子衍生物制各方法研究 三弛圭要縫菱直洼 應(yīng)用于篩選和優(yōu)化的方法有很多，像批量結(jié)晶、分批結(jié)晶、批量透析、微量 透析、液橋，自由擴(kuò)散等等，其細(xì)節(jié)在很多文獻(xiàn)中都有詳細(xì)描迸7 邡1 ，這里我們 只想重點(diǎn)提到三種最常用的方法：微批量結(jié)晶法( m i c r o b a t c h ) 、坐滴氣相擴(kuò)散法 f s i t t i n gd r o p ) 和懸滴氣相擴(kuò)散法( h a n g i n gd r o p ) ，后兩種均屬于汽相擴(kuò)散。在這三 種方法中都先將蛋白質(zhì)溶液和結(jié)晶溶液( 也就是母液) 混合( 見(jiàn)圖2 1 ) 。m i c r o b a t c h 中混合后的液滴直接放置在結(jié)晶專(zhuān)用的多孔平板的凹槽中，并將凹槽用涂有真空 油的透明塑料片封住以防止溶劑揮發(fā)；可以通過(guò)改變混合液滴達(dá)到優(yōu)化的目的。 圖2 - 1 從左到右分別s i t t i n g d r o p ，h a n g i n g d r o p ，m i c r o b a t c h 的結(jié)晶原理示意圖， 圖中的 p p t 代表試劑濃度 s i t t i n gd r o p 是在平板上進(jìn)行的汽相擴(kuò)散，混合液滴放置在多孔平板的凹槽 中，再將平板置于裝有結(jié)晶溶液的透明容器中( 母液不能沒(méi)過(guò)平板) ，最后將整 個(gè)裝置密封。這樣容器中的母液與凹槽中的混合液滴內(nèi)包含的鹽或者有機(jī)溶劑的 濃度通過(guò)其間的汽相擴(kuò)散達(dá)到平衡。和m i c r o b a t c h 相比，在混合液滴已經(jīng)配好的 情況下由于容器中母液濃度可以改變，因而改變條件的自由度較大?，F(xiàn)在也有很 多改進(jìn)的s i t t i n gd r o p 法，如直接在載玻片上滴混合液滴和母液，使其不相互接 觸來(lái)進(jìn)行擴(kuò)散，或者在兩種液體間加入液橋介質(zhì)。 h a n g i n gd r o p 是在懸滴中進(jìn)行的汽相擴(kuò)散，混合液滴懸在一塊蓋玻片下，然 后將其密封放在裝有母液的凹槽上方。這種方法最大的好處就是所需的液滴體積 小，適用于只有少量蛋白質(zhì)樣品又要進(jìn)行大量篩選的情況；但是由于液滴體積有 限并不適合大晶體的生長(zhǎng)。 在m i c r o b a t c h 中，密封油的氣透性可以被調(diào)節(jié)，使得液滴緩慢揮發(fā)，類(lèi)似于 通過(guò)調(diào)節(jié)濃度來(lái)影響結(jié)晶：在汽相擴(kuò)散法中液滴和母液間的濃度平衡則是通過(guò)汽 相擴(kuò)散來(lái)達(dá)到的。m i c r o b a t c h 適合在不同溫度，甚至是在梯度溫度下進(jìn)行篩選： 1 4 中山大學(xué)碩士學(xué)位論文 同時(shí)，不同于汽相擴(kuò)散法，m i c r o b a t c h 中不會(huì)出現(xiàn)液滴體積增大或是樣品稀釋p ，j 。 在特定蛋白的初始條件篩選中m i c r o b a t e h 和汽相擴(kuò)散法的比較在一些文獻(xiàn) f l s - j r l 中有過(guò)報(bào)道。關(guān)于上述三種方法的更多信息可以在文獻(xiàn) 3 5 1 中找到。當(dāng)母液 是非揮發(fā)性時(shí)，最好使用微量透析的方法。 除了上述三種方法外，還有很多改進(jìn)的方法，包括近年研究出的自動(dòng)操作系 統(tǒng)，它可以加快整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程并且節(jié)省樣品【3 5 1 ；對(duì)于膜蛋白結(jié)晶可以使用脂質(zhì)立 方相( 1 i p i d i cc u b i cp h a s e s ) 的方法【3 8 1 ；此外還可以使用相圖來(lái)預(yù)測(cè)結(jié)晶的合適條 件【3 9 】。 2 2 甜味蛋白晶體的培養(yǎng)及其生長(zhǎng)研究 2 2 1 實(shí)驗(yàn)材