（微生物學專業(yè)論文）豆乳凝固酶產(chǎn)生菌的篩選、發(fā)酵條件及酶學性質的研究.pdf

1 4 大豆異黃酮及其生理功能 3 9 1 5 大豆皂苷及其生理功能 4 0 1 6 胰蛋白酶抑制劑及其生理功能 4 1 2 大豆蛋白質的構造 1 2 2 1 大豆蛋白質的分類 4 2 2 2 大豆蛋白的氨基酸組成 4 3 2 3 大豆蛋白的二級結構 4 j 2 4 大豆蛋白質的高級結構 4 6 3 大豆蛋白質的特性 q 7 3 1 大豆蛋白質的溶解性 4 7 3 2 大豆蛋白質的凝膠化與組織質地 4 8 3 3 大豆多肽的功能特性 j o 3 4 大豆蛋白的膠凝特性 j 2 3 5 溫度對大豆蛋白凝膠性的影響 j 4 4 大豆凝乳酶的研究概況 j 5 4 1 大豆凝乳酶的來源 j 5 4 2 大豆凝乳酶的酶學特性 j 6 4 3 大豆凝乳酶的作用機制 5 7 5 前景展望 6 0 參考文獻 6 l 聲明 6 j 表格目錄 表1 部分初篩菌株在篩選培養(yǎng)基中凝固豆乳情況 1 5 表2 部分菌株水解酪蛋白的情況 l 6 表3 大豆蛋白質的組成 4 2 表4 大豆球蛋白的分類與組成 4 3 表5 大豆球蛋白成分蛋白質氨基酸組成 4 4 表6 1 l s 大豆球蛋白 蛋白質的二級結構 4 j 表7 7 s b 一濃縮球蛋白 的二級結構 表8 有凝乳作用的商業(yè)蛋白酶 表9 商業(yè)蛋白酶處理豆乳的效果 圖形目錄 圖1 h s d 菌落形態(tài)和孢子形態(tài)照片 1 7 圖2 溫度對酶活力的影響 1 7 圖3 酶的熱穩(wěn)定性 1 8 圖4 p h 對豆乳酶活力的影響 1 9 圖5 酶的p h 穩(wěn)定性 1 9 圖6 c a 2 m 9 2 對酶活力的影響 2 0 圖7 t r y 的標準曲線 2 0 圖8 不同碳源對豆乳凝固酶相對產(chǎn)量的影響 2 j 圖9 不同濃度的玉米粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 2 圖l o 不同氮源對豆乳凝固酶相對產(chǎn)量的影響 2 7 圖1 1 不同濃度的黃豆粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 3 圖1 2 發(fā)酵溫度對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 3 圖1 3 發(fā)酵時問對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 4 圖1 4 接種量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 4 圖1 5 培養(yǎng)基起始p h 對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 5 圖1 6 培養(yǎng)基裝瓶量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 5 圖1 7 不同處理時間的凝乳效果 2 7 圖1 8 不同凝固因的凝乳效果 2 7 圖1 9 蛋白質含量的標準曲線 2 8 明 心川人學碩l 學位論文 豆乳凝固酶產(chǎn)生菌的篩選 發(fā)酵條件及酶學性質的 研究 微生物學專業(yè) 研究生段洪武指導教師王忠彥 摘要 豆乳凝固酶是指能夠使豆乳中蛋白質產(chǎn)生凝膠化的酶的總稱 主要應用在 豆腐坯的制作中 從濃香型大曲酒的黃水中 通過菌株的分離 試管培養(yǎng)法初 篩和三角瓶發(fā)酵復篩 得到一株霉菌 該菌的發(fā)酵液具有較高的豆乳凝乳作用 經(jīng)1 0 0 c 處理后發(fā)酵液失活 初步確定是發(fā)酵液中的酶產(chǎn)生了凝乳作用 將該 菌株命名為h s d 1 1 通過形態(tài)觀察初步鑒定該菌株為毛霉 通過碳源 氮源 培養(yǎng)溫度 n h 等單因素和正交實驗 進一步探索浚菌 株產(chǎn)豆乳凝固酶的最適發(fā)酵條件 結果發(fā)現(xiàn)以2 的玉米粉為碳源 3 的黃豆 粉為氮源 在加入0 0 5 的n a c i o 0 2 的m g s 0 4 和0 1 的k 2 h p 0 4 等無機 物 培養(yǎng)基起始p h 為5 5 6 0 2 5 0 m l 三角瓶裝量為5 0 m l 接種量為5 先在3 0 1 5 0 r p m 條件下培養(yǎng)2 d 再于2 5 2 8 下靜置培養(yǎng)2 3 d 發(fā)酵產(chǎn) 物的豆乳凝固酶活力可達1 1 6 u m l 酪蛋白水解活力僅為0 3u m l 對該菌株的發(fā)酵液中的豆乳凝固酶的酶學性質進行研究 結果發(fā)現(xiàn)該酶的 最適反應溫度為6 5 酶對熱不穩(wěn)定 6 0 水浴處理2 0 m i n 發(fā)酵液中酶活力 降低了6 0 7 0 時水浴處理4 0 m i n 和8 0 水浴處理2 0 m i n 酶活幾乎全部喪 失 酶的最適p h 為5 9 酶在p h 5o 6 0 之間比較穩(wěn)定 c a 2 m 離子對 酶活力有很強的促進作用 同時對該酶的豆乳凝乳效果進行研究 結果發(fā)現(xiàn)在 6 5 時 0 5 m l 粗酶液1 0 m i n 內可使5 m l 豆乳凝固成型 隨著時間的推移 豆 乳上清液越來越澄清 2 0 m i n 時豆乳溶液中蛋白質的回收率可達到9 0 3 用 四川i 大學砸l j 學位論文 1 0 m m o l c a c l 2 p h 4 5 等電點沉淀和酶凝固的效果做比較 研究發(fā)現(xiàn) 1 0 m m o l c a c l 2 和等電點沉淀的顆粒沉降系數(shù)較大 上清夜和沉淀高度的l l 侈i j 約 為2 1 而酶凝固的顆粒沉降系數(shù)較小 比例約為l 1 鈣沉淀和等電點沉 淀沒有改變大豆蛋白的二級結構 因此沉淀的顆粒較大 沉降快 酶不儀破壞 了蛋白質的高級結構中的疏水作用力和二硫鍵 甚至作用于某些特定的肽鍵 使得大直蛋白沉降速度減慢 關鍵詞 豆乳凝同酶毛霉酶學性質凝乳效果 叫川大學碩十學位論文 s c r e e n i n go fs o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m e p r o d u c i n gs t r a i na n d s t u d yo i li t so p t i m i z a t i o no ff e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sa n d e n z y m o l o g yp r o p e r t i e s m a j o r m i c r o b i o l o g y p o s t g r a d u a t e d u a nh o n g w ud i r e c t o r w a n gz h o n g y a n a b s t r a c t s o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m ei sag e n e r a lt e r mr e f e r r i n gt ot h ee n z y m ew n c h c a nm a k ep r o t e i ni ns o y m i l kg e l m i o n i ti sm a i n l ya p p l i e dt ot h em a k i n go f t o f u a f t e r m a n ye x p e r i m e n t as t r a i nw a si s o l a t e df r o ms o y w h e y i t sp r o d u c to ff e r r n e n m f i o n h a sab e t t e rf u n c t i o no fs o y m i c o a g u l a t i n g p r o c e s s i n gi n 1 0 0 c 1 1 1 p r o d u c to f f e r m e n t a t i o nw i l ll o s ei t s s o y m i l kc o a g u l a t i n ga c t i v i t yw h i c hc a r lb er e g a r d e dt h e g e l a t i o np r o d u c e db ye n z y m e t h es t r a i ni sn a m e dh s d 1 1 w h i c hb yi t sf o r mi s i d e n t i f l e da sm u c o l s t u d y i n go nt h ee f f e c t so fc a r b o ns o u r c e sa n do t h e ri n f l u e n c ef a c t o r s o p t i m i z e d t h ef e r m e n t a t i o nc o n d r i o nf o rt h es t r a i n t h e o p t i m a l m e d i u m c o m p o s i t i o nf o rt 1 1 es t r a i ng r o w t hi sc o r nf l o u r2 s o y b e a np o w e r3 n a c l o 0 5 m g s 0 4 0 0 2 k 2 冊0 4 0 1 丁h eo p t i m a l f e r m e n t a t i o nc o n d i t i o n sf o r s o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m ep r o d u c i n ga r ei n i t i a lp h5 5 6 0 c u l t u r em e d i u mv o l u m e s f o r5 0m li n2 5 0 m lf l a s k i n o c u l a t i o nf o r5 c u l t i v a t e da t3 0 v i t la na e r a t i o n r a t eo f1 5 0 r p mf o r4 8 h t h e nc u l t i v a t e da t2 8 u n d e ru n t o u c hf o r7 2 h a tl a s ta m a x i m u my i e l do fl 16u m lw a so b t a i n e d t h er e s e a r c ho nt h ee n z y m a t i cc h a r a c t e r i s t i c si nt h es u p e r n a t a n ts o l u t i o no f t h ec u l t l l r ef l u i d si n d i c a t e st h a tt h eo p t i m a lt e m p e r a t u r ei s 6 5 2 t h ee n z y m ei s 3 四川大學碩士學位論文 u n s t a b l ei nd i l y e r e n tt e m p e r a t a r e s i tw o u l dl o s ei t sa c t i v i t yw h e ni ti si n7 0 cf o r4 0 m i n u t e s t h eo p t i m a lp hi s5 9 i ti ss t a b l ei nt h ep h r a n g e5 0 6 0 i na d d i t i o n t h e a d d i t i o no fc a m 9 2 c a nb e s tp r o m o t et h ea c t i v i t yo fs o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m e m e a n w h i l et h er e s e a r c ho nt h ee f f e c to ft h ee n z y m ei ns o y m i l ks h o w st h a t0 5 m l s u p e m a t a n ts o l u t i o no f t h ec u l t u r ef l u i d si n1 0 m i nu n d e r6 5 c c a nm a k e5 m l s o y m i l k s o l i d d u r i n gt h ee x p e r i m e n tt h es u p e m a t a n to fs o y m i l kw i l lb e c o m ec l e a r e ra n dt h e p e r c e n t a g eo fp r o t e i nr e c y c l i n gi ns o y m i l kc a nr e a c ht o9 0 3 c o m p a r i s o no ft h e e f f e c tp r o d u c e db y10 m m o l c a c l z p h 4 5a n ds o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m ei n d i c a t e s t h a tt h e10 m m o l c a c l 2i nw h i c ht h e p r o p o r t i o n b e t w e e nh e i g h to fs u p e m a t a n t s o l u t i o na n dt h eh e i g h to f d e p o s i t i o ni sa r o u n d2 1 w h i l et h ep r o p o r t i o no f e f f e c to f s o y m i l kc o a g u l a t i n ge n z y m ei ss m a l l e ri nw h i c ht h ep r o p o r t i o ni sa r o u n d1 1 t h e e f f e c to f c a c l 2a n dp hd o e s n tc h a n g et h es e c o n d a r ys t r u c t u r eo f t h es o y b e a np r o t e i n s ot h a tt h eg r a n u l eo ft h es e d i m e n t a t i o ni sl a r g e ra n di t sr a t ei sf a s t e r t h ee f f e c to f e n z y m ed o e sn o to n l yd e s t r o yh y d r o p h o b i cb o l l da n dd i s u l f i d eb o n di nt h eh i g h e r s t r u c t u r ei nt h ep r o t e i nb u ta l s oa f f e c ts o m ec e r t a i nk i n do fp e p t i d eb o n dt h a tt h e s e d i m e n t a t i o nr a t eo ft h es o y b e a np r o t e i nr e d u c e k e yw o r d s o y m i l kc l o t t i n ge n z y m e m u c o r e n z y m o l o g yp r o p e r t i e s c u r d e de f f e c t 4 川人學碩i 學位論文 月j j 吾 大豆含豐富的營養(yǎng)成分 其中蛋白質含量高且質量好 含人體必需的8 種 氨基酸 尤其是賴氨酸 色氨酸含量大大高于其他作物 大豆脂肪中含大量不 飽和脂肪酸 且不含膽固醇 其中5 0 以上的亞油酸還能分解膽固醇 防止血管 硬化 我國的豆腐等豆制品的生產(chǎn)歷史悠久 南北各種類型不同花色的豆腐制 品 早已成為廣大消費者喜愛的極普通而寓含蛋白質的營養(yǎng)食品之一 隨著人 民生活水平的提高 對食品的營養(yǎng) 衛(wèi)生安全性和功能性的要求及通過科學的 飲食來維持自身健康思想意識也在增強 因此 大豆及其制品的豐富的蛋白質 營養(yǎng)與其它具保健作用的成分越來越受到人們的青睞 與此同時 對豆制品的 衛(wèi)生質量及安全性方面的要求也在不斷增強 豆腐的生產(chǎn)過程中 大豆原料的 選擇和前處理對豆腐的品質有影響外 凝固劑的選用也起著關鍵性作用 目前 豆腐生產(chǎn)中 采用的凝固劑主要有石膏 鹽鹵和葡萄糖酸內酯等n 鹽鹵和石 膏作為凝固劑 得到的成品質地粗糙 保水性差 而且還有一定的苦味 葡萄 糖酸內酯和動植物蛋白酶雖然是優(yōu)質的凝固劑 但其成本較高 7 0 年代人們發(fā) 現(xiàn)了微生物豆乳凝固酶起 許多研究人員在不斷的篩選高豆乳凝固酶活力的產(chǎn) 生菌以及進行相關的研究 近幾十年來 隨著大豆研究的發(fā)展 人們漸漸認識到食用大豆食品的各種 益處 使得大豆食品的生產(chǎn)和加工飛速發(fā)展 2 0 世紀7 0 年代 日本學者u t a k a 和f u k a z a w a 在研究中發(fā)現(xiàn)無花果蛋白酶 f i c i n 有使火豆蛋白質膠凝的能力 1 1 9 8 0 年 目本學者f u k a 和m a t s u o k a 也報道菠蘿蛋白酶 b r o m e l a i n 可促使大豆 蛋白質凝固 1 9 8 7 年 k a t s u m i 首次報道了某些商品微生物蛋白酶制劑具有使 大豆蛋白質膠凝的功效 并采用評價凝固酶活力的方法比較了多種商品蛋 白酶制劑膠凝大豆蛋白質的能力 但實驗中大豆蛋白溶液是否膠凝是以肉眼觀 察為標準的 以定性為主 根據(jù)酶催化反應的一般原理 通過改變加酶量可以 對酶反應速度進行有效的調控 因此 若能篩選出具有較高的促進大豆蛋白質 膠凝活力的蛋白酶并能確定加速膠凝的酶用量 就有可能將其作為大豆蛋白質 的速凝凝固劑 為定量地比較蛋白酶使大豆蛋白質凝結作用的強弱 研究中通 四川大學碩士學位論文 過比較幾種酶制劑與大豆蛋白溶液共存靜置反應過程中體系流變性質的變化 尋找出能使大豆蛋白質膠凝的商品酶制劑 進而通過比較酶的熱及p h 穩(wěn)定性 確定用作速凝凝固劑的適合蛋白酶以及合適的酶添加量 目前所發(fā)現(xiàn)的微生物豆乳凝固酶都是蛋白酶 大多數(shù)具有較高的蛋白水解 活力 用來做豆乳凝固劑時 因大豆蛋白的水解 使得大豆蛋白的回收率一般 在8 0 左右 6 l 造成較大浪費 低蛋白水解活力的豆乳凝固酶目前尚沒有報道 四川大學碩士學位論義 i 材料與方法 1 實驗材料 1 1 樣品來源 黃水實驗室由濃香型大曲酒采得 1 2 主要試劑 大豆蛋白胨北京奧博星公司 脫脂奶粉完達山乳業(yè)股份有限公司 黃豆東北大豆 其余藥品與試劑為分析純或化學純 1 3 培養(yǎng)基 1 3 1 篩選培養(yǎng)基i 豆乳5 m l 葡萄糖0 2 蛋白胨0 2 酵母膏 o 2 k h 2 p 0 4 0 1 m g s 0 4 o 0 2 瓊脂 2 0 p h6 0 1 2 1 2 0 m i n 滅菌 1 3 2 篩選培養(yǎng)基1 1 豆乳 葡萄糖 蛋白胨 酵母膏 5 m l 0 2 0 2 0 2 1 一 四川 學碩士學位論義 k h 2 p 0 4 0 1 m g s 0 4 o 0 2 p h 6 01 2 1 c2 0 m i n 滅菌 3 3 酪蛋白培養(yǎng)基 脫脂奶粉 m g s 0 4 k z h p 0 4 n a c l p h 6 01 2 1 2 0 m i n 滅菌 3 4 斜面培養(yǎng)基f 察氏培養(yǎng)基 蔗糖 n a n 0 3 k 2 h p 0 4 k c l m g s 0 4 f es o d 瓊脂 2 o0 2 o 1 o 0 5 3 0 3 0 1 o 0 5 0 0 5 0 0 0 1 2 0 p h 6 0 1 2 1 2 0 m i n 滅菌 1 3 5p d a 培養(yǎng)基i 土豆浸出液 蔗糖 瓊脂 p h 6 01 2 1 2 0 m i n 滅菌 3 6p d a 培養(yǎng)基i i 土豆浸出液 1 0 0 m l 2 0 2 o 1 0 0 m l 8 四川人學倒 i 學位論文 蔗糖 2 0 k z h p 0 4 0 3 m g s 0 4 o 0 5 瓊脂 2 0 自然p h 1 2 1 2 0 m i n 滅菌 1 37 發(fā)酵培養(yǎng)基i 葡萄糖 蛋白胨 酵母膏 k 2 h p 0 4 m g s 0 4 n a c l p h 6 01 2 1 2 0 m i n 滅菌 1 3 8 發(fā)酵培養(yǎng)基i i 黃豆粉 玉米粉 n a c l m g s 0 4 k 2 h p 0 4 p h6 0 1 2 1 2 0 m i n 滅菌 1 39 固體發(fā)酵培養(yǎng)基 麥麩 黃豆粉 水 p h 6 01 2 1 3 0 m i n 滅菌 l0 05 05 01 00 2 o 0 5 3 0 2 0 0 0 5 o 0 2 0 1 1 0 0 9 1 5 9 6 0 m l t j q 川i 大學碩f 學位論文 1 4 乳酸石炭酸棉藍染液 石炭酸 1 0 9 乳酸 1 0m l 甘油 2 0m l 蒸餾水 1 0m l 棉藍 c o t t o nb l u e 0 0 2 9 將石炭酸加在蒸餾水中加熱溶解 然后加入乳酸和甘油 最后加入棉藍 使其 溶解即成 2 實驗方法 2 1 豆乳凝固酶產(chǎn)酶菌株的篩選 1 2 1 1 初篩 在超凈臺上將黃水梯度稀釋后涂布于篩選培養(yǎng)基i 3 0 c 培養(yǎng)3 d 將所分 離到的各種細菌及真菌分別接入篩選培養(yǎng)基i i 中 3 0 靜置培養(yǎng)2 d 觀察豆乳 凝固情況 同時將所篩得的各菌株梯度稀釋后涂布于酪蛋白培養(yǎng)基中 3 0 培 養(yǎng) 細菌2 4 h 霉菌3 d 觀察酪蛋白水解情況 2 1 2 復篩 將具有大豆蛋白凝固作用的菌株分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中 細菌接入發(fā)酵培 養(yǎng)基i 中 3 0 c 培養(yǎng) 細菌2 4 h 后離心 取發(fā)酵液測酶活 霉菌接入發(fā)酵培養(yǎng) 基i i 中 3 0 c 培養(yǎng)3 d 后 用濾紙過濾 取發(fā)酵液測酶活 2 1 3 菌株的鑒定 7 i 肉眼觀察菌落形態(tài) 菌苔厚度 顏色 挑取p d a 上培養(yǎng)6 天的菌絲 用 乳酸石炭酸棉藍染液涂片 在光學顯微鏡下觀察菌絲 孢子并且測量其大小 2 2 蛋白凝固酶活力的測定 2 2 1 豆乳的制備 叫川丈學碩士學位論文 稱取1 0 0 克東北大豆 8 i 漂洗干凈后用3 倍蒸餾水在2 5 c 浸泡1 2 h 加少 量蒸餾水打群成豆?jié){ 過濾 加蒸餾水定容至1 0 0 0 m l 加熱煮沸5 m i n 補足 蒸發(fā)失去的水分 過濾后冷卻備用 2 2 2 粗酶液的制取 挑取 定量新鮮菌絲體接入2 5 0 m l 三角瓶中 其發(fā)酵培養(yǎng)基裝量為5 0 m l 于1 5 0 r p m 3 0 c 搖床培養(yǎng)2 d 再于2 54 c 靜置培養(yǎng)3 d 將膠凝的培養(yǎng)基用玻棒 攪爛后 在4 0 水浴中保溫2 0 m i n 水化 用濾紙過濾 將所得粗酶液用p h 9 0 o 2 m o l 的磷酸緩沖液調節(jié)p h 到6 0 后保存?zhèn)溆?2 2 3 酶凝乳活力的測定 依據(jù)a r i m a 9 1 法 1 取一定量的豆乳液 用1 m o l 的磷酸緩沖液調節(jié)p h 到6 0 6 5 c 水浴保溫 5 m i n 2 取0 5 m l 粗酶溶液加入5 m l 豆乳液中 準確記錄從加入酶液到豆乳凝 固出現(xiàn)的時f n j 3 酶活計算方法 凝固酶活力 u l t n t 凝乳時間 n 粗酶液稀釋倍數(shù) 在上述條件下 每分鐘凝固1 0 m l 豆乳的酶量定義為一個酶活單位 u 2 3 蛋白酶水解活力的測定 2 3 1 試劑和溶液 1 福林酚試劑的制備 于2 0 0 0 m l 磨口回流裝置中加入鎢酸鈉 n a w o 2 h 0 1 0 0 9 鋁酸鈉 n a m 0 0 2 h o 2 5 9 水7 0 0 m l 8 5 磷酸5 0 m l 濃鹽酸1 0 0 1 l 小火沸騰 回流1 0 h 加入硫酸鋰 l i q 0 5 0 9 水5 0m l 混勻后取去冷凝器 加入幾 滴液體溴 再沸騰1 5 m i n 以驅除殘溴 溶液應呈黃色而非綠色 如果呈綠色 四川大學刪 學位論義 需再加幾滴液體溴 再煮沸 拎卻后 定容至1 0 0 0m l 混勻 過濾 儲存于 棕色瓶內 使用時 加2 倍蒸餾水稀釋 2 p h 6 0 磷酸緩沖液 a 液稱取磷酸二氫鈉3 1 2 9 加水溶解并定容至1 0 0 0m l b 液稱取磷酸氫二鈉7 1 6 3 9 加水溶解并定容至1 0 0 0m l 使用溶液取a 液1 2 3 m l b 液8 7 7 m l 混勻 得到p h 6 0 的緩沖液 2 3 2 測定方法 1 先將1 酪蛋白放入4 0 c i 百溫水浴中 預熱5 m i n 2 取適當稀釋的酶液1 0 m l 加預熱后的酪蛋白1 0 m l 搖勻 并在4 0 c 下 保溫1 0 m i n 3 加0 4 m o u l 三氯乙酸2 0 m l 搖勻 取出靜止1 0 m i n 過濾 4 取1 0m l 濾液 于4 0 c 下加o 4 m o l l 碳酸鈉溶液5 0 m i 接著加福林試 劑使用液1 0 m l 并保溫2 0 r a i n 5 在6 8 0 n m 波長下比色 測定吸光度 6 酶活計算方法 x a k 4 1 0 xn 2 5 a k xn 式中 x 樣品的酶活力 u m l k 吸光常數(shù) 由標準曲線得出 數(shù)值上等于a 為l 時所相當?shù)睦野彼?的微克數(shù) a 樣品平行實驗的平均吸光度 1 3 稀釋倍數(shù) 說明 測定空白時 加酪蛋白與三氯乙酸的順序相反 酶活力單位定義為 每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生l u g 酪氨酸的酶量為一個酶活力 單位f u 24 h s d 11 產(chǎn)豆乳凝固酶的酶學性質的研究 2 4 1 溫度對酶活力的影響 叫川大學碩十學位論文 取處理好的粗酶液 分別在4 0 4 5 5 0 c 5 5 6 0 c 6 5 7 0 7 5 c 8 0 c 8 5 c 按酶活測定方法測定凝固酶活力 2 4 2 熱穩(wěn)定性 取處理好的粗酶液 在5 0 c 6 0 c 7 0 c 和8 0 c 水浴中分別保溫1 0 m i n 2 0 m i n 3 0 m i n 4 0 m i n 時間到后 按酶活測定方法測定凝固酶活力 2 4 3p h 對酶活力的影響 取處理好的粗酶液 分別調節(jié)豆乳的p h 為5 9 6 1 6 3 6 5 6 7 在 6 5 下測定各p h 值下的酶活力 2 4 4p h 穩(wěn)定性 取處理好的粗酶液 用o 1 m o g l 的h c i 或n a o h 分別調節(jié)其p h 為3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 常溫保存l h 再用o 1 m o g l 的n a o h 或h c i 調 節(jié)p h 到6 0 測定各組的酶活力 2 5 發(fā)酵條件的研究 測定不同的碳源 氮源 起始p h 搖平裝量 培養(yǎng)溫度 培養(yǎng)時間和接種 量的發(fā)酵液的酶活力 找出最佳培養(yǎng)條件 2 6 不同凝固因子凝固豆乳的研究 2 6 1 豆乳凝固酶凝乳效果 取豆乳原液在6 5 c 水浴保溫5 m i n d h x o 5 m l 酶液 分別保溫5 l o 1 5 2 0 m i n 后立即置入冰水浴中 用玻棒攪爛凝膠后再在振蕩器上振蕩均勻 3 0 0 0 轉離心1 0 m i n 測定沉淀物的高度 2 6 2 不同凝固劑凝同豆乳的效果 取豆乳原液在6 5 水浴保溫5 m i n 分別加入0 5 m l 粗酶液 1 0 m m o l l c a c l 2 保溫2 0 m i n 后立即置入冰水浴中 用玻棒攪爛凝膠后再在振 叫j i l 大學碩士學位論文 蕩器卜 振蕩均勻 3 0 0 0 轉離心l o m i n 測定沉淀物的高度 2 7 酶處理后大豆蛋白質回收率的測定 2 7 1 試劑和溶液 溶液ao 5 9c u s o 5 h 0 1 9n a 3 c d t q 5 1 1 0 加蒸餾水定容至1 0 0 丌 l 保存 備用 溶液b2 0 9n a 2 c 0 3 4 9n a o h 加蒸餾水定容至1 0 0 0 m l 保存?zhèn)溆?使用液ia 液和b 液按1 5 0 比例混勻后使用 使用液i i 福林酚試劑和蒸餾水按1 1 比例混勻后使用 2 7 2 測定方法 用蒸餾水稀釋樣品至要求倍數(shù)后 取0 5 m l 加入試管 2 加入2 5 m l 使用液 混勻后室溫靜置5 m i r a 3 加入o 2 5m l 使用液i i 混勻后室溫放置3 0 m i n 4 在分光光度計上測a s o 時的o d 值 2 7 3 回收率計算方法f i 先由標準曲線得出溶液中蛋白質含量的回歸方程 y a 十b x a 為回歸線的 截距參數(shù) b 為回歸線的斜率參數(shù) 再由回歸方程計算出用品中蛋白質的含量 叫川人學碩 學位論文 i i 結果與討論 1豆乳凝固酶的篩選 豆乳凝固酶是蛋白酶中的一類 主要破壞蛋白質的二硫鍵和疏水作用力 使蛋白質分子重新形成新的二硫鍵或者水解蛋白質為多肽 改變其電荷后使其 凝結 如果蛋白酶的水解活力較高 將使大豆蛋白的回收率降低 所以本實驗 以高豆乳凝固酶活力和低蛋白水解酶活力為出發(fā)點進行篩選 從通過篩選培養(yǎng) 基表i 培養(yǎng)出的株菌中篩選出1 2 株使豆乳產(chǎn)生沉淀的菌株進行初篩 表l 所 示為部分株菌在篩選培養(yǎng)基i i 中的培養(yǎng)2 d 后的特征 表示有一 表示無一 表示大量 表1 部分初篩菌株在篩選培養(yǎng)基中凝固豆乳情況 由于豆乳在p h 值低于5 8 時會發(fā)生等電點沉淀 出現(xiàn)上清液可能是蛋白水 川人學壩l 學位論文 解酶的作用 也可能是等電點沉淀 罔此 將上述菌株稀釋涂布于酪蛋白培養(yǎng) 基中 觀察其分泌的蛋白酶水解活力的大小 表2 所示為部分菌株在酪蛋白培 養(yǎng)基中的水解透明圈的情況 菌株號透明圈大小 l 較小 2 較大 3較大 d 無 5 無 6 無 7 無 8較小 9較大 1 0較人 1 1不明顯 1 2較大 表2 部分菌株水解酪蛋白的情況 根據(jù)各菌株在上述條件培養(yǎng)的特征 將各菌株接入發(fā)酵培養(yǎng)基中 1 8 0 r p m 3 0 c 培養(yǎng) 細菌2 4 4 8 h 霉菌培養(yǎng)3 j d 得到3 1 1 號菌株有較高的酶活 以l l 號為佳 針對1 1 號菌為霉菌的特點 對發(fā)酵過程進行優(yōu)化 最終 在發(fā) 酵培養(yǎng)基i i 中 1 5 0 r p m 3 0 c 培養(yǎng)2 d 再在2 5 c 靜置培養(yǎng)3 d 后 租酶液的酶 活最高可達1 1 6 u m l 該酶蛋白水解的活力僅為o 3u m l 2 菌種鑒定 l 菌落形態(tài) 在p d a 培養(yǎng)基上生長良好時 菌絲體匍匐向四周生長 菌落為絮狀 菌 四川大學碩士學位論文 叢高度約i c m 2 8 培養(yǎng)6 天 如圖1 菌叢直徑為6 5 7 4 a m 呈白色 隨 生長時間的增加 顏色逐漸變?yōu)樯罨野咨?圖1h s 巾1 1 菌落形態(tài)和孢子形態(tài)照片 2 2 個體形態(tài) 在顯微鏡下觀察乳酸石炭酸棉藍染液的涂片 菌絲有分枝 有隔膜 直徑 為2 5 5 6 微米 孢子囊位于菌絲頂端 孢子呈橢球形 直徑約2 0 微米 由上述特征 初步確定該菌株為毛霉科毛霉屬 3 豆乳凝固酶的性質 3 1 溫度對酶活力的影響 分別在不同溫度下按常規(guī)方法測定酶活力 如圖2 從圖中可以看出 在 1 0 0 釜8 0 r6 0 器4 0 罌2 0 0 4 0 4 55 05 56 0 6 57 07 5 8 0 8 5 溫度 圖2 溫度對酶活力的影響 1 7 叫川人學碩 學位論史 6 5 下時 該酶的活力隨溫度的升高而緩慢升高 而在7 0 c 后 隨溫度的升高 迅速下降 豆乳凝固酶在6 0 一7 0 的溫度范圍內顯示出較高的活力 在6 5 時 其酶活達到最高 因此 6 5 為該酶的最適溫度 32 酶的熱穩(wěn)定性 將豆乳凝固酶分別在5 0 6 0 7 0 8 04 c 保溫1 0 2 0 3 0 4 0 分鐘 然后 立即測定其酶活 以未保溫的酶活力為1 0 0 如圖3 從圖中可以看出 該酶 在6 0 以上對溫度比較敏感 7 0 4 0 m i n 該酶基本失活 8 0 c 只需2 0 m i n 該 酶幾乎沒有活性 該酶的最適溫度為6 5 似乎與此矛盾 然而 溫度也是豆 乳凝固的一個重要參數(shù) 隨著溫度的升高 蛋白質變性速度加快 因此在溫度 與酶的相互協(xié)調作用下 6 5 時豆乳凝固達到最佳 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 0 一5 0 溫度 6 c 卜6 0 卜7 0 十8 0 圖3 酶的熱穩(wěn)定性 4 0 3 3p h 對酶活力的影響 在6 5 時 d h5 9 6 1 6 3 6 5 6 7 下分別測定酶活力 以p h 5 9 時的 酶活力為1 0 0 如圖4 從圖中可以看出 隨著p h 值的升高 酶活力下降 酶活力隨p h 上升而降低的原囚有兩點 一是隨著p h 的升高 電荷數(shù)增加 s j 二是由于大豆蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性隨著p h 的升高而提高 這些因素使 得豆乳溶液體系變得穩(wěn)定 而p h 5 8 時 豆乳因等電點而沉淀 不能測其酶活 因此 p h 5 9 是該酶的最適p h 四川大學碩l 學位論文 j96 16 36 j67 p h 圖4p h 對酶活力的影響 3 4 酶的p h 穩(wěn)定性 用0 1 m o l h c l 或n a o h 調節(jié)粗酶液p h 到3 0 4 0 5 0 6 0 7 0 8 0 9 0 常溫保存l 小時 再用o 1 m o l h c l 或n a o h 調節(jié)p h 值到6 0 測定各酶 活力 以p h 6 0 時的酶活力為1 0 0 如圖5 從圖中可以看出 該酶對酸的耐 受比較強 在p h 5 6 范圍內穩(wěn)定 在堿性條件下敏感 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 4 5 6789 p h 圖5 酶的p h 穩(wěn)定性 3 5c a m 9 2 對酶活力的影響 分別調節(jié)豆乳液中c a 2 濃度為l m m 2m m 3m m 4m m m g2 濃度為l m m 2m m 3m m 4m m 5 m m 然后在6 5 c 下測發(fā)酵液酶活 見圖6 從圖中 可以看出 隨著c a 2 m 9 2 離子濃度的升高 單位體積的發(fā)酵液酶活力隨之提 高 鋤 o 四川大學碩f 學位論文 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 l234 濃 叟 m b l 圖6c a m g 對酶活力的影晌 3 6 蛋白水解活力的測定 酪氨酸的標準曲線見圖7 1 0 8 墓0 6 口 6o 4 0 2 0 0 t r y u g 圖7t r y 的標準曲線 根據(jù)實驗數(shù)據(jù) 見圖7 上各散點 利用一元線性回歸方程法求出其回歸方程 為 y o o l x o 0 0 2 根據(jù)此回歸方程求得其吸光常數(shù) k 9 9 8 測得發(fā)酵液中蛋白水解活力的平均吸光度為o 0 0 8 根據(jù)酶活力計算方程計算 出發(fā)酵液的蛋白水解活力為0 3u m l 4 發(fā)酵條件優(yōu)化 四川大學碩l 學位論文 4 1 碳源對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 1 i 不同碳源對豆乳凝固酶相對產(chǎn)量的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基i i 中 分別以3 o 葡萄糖 蔗糖 玉米粉 可溶性淀粉為碳 源 其它成分不變 2 5 0 m i 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入5 的種子液 在2 8 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)j d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖8 由圖8 可知 在幾 o o 8 0 6 0 4 0 2 0 01 klj 乇米粉葡萄糖蔗糖可溶性淀粉 碳源 圖8 不同碳源對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 種不同的碳源中 玉米粉為碳源時 每毫升發(fā)酵液中豆乳凝固酶活力最高 可 能是玉米粉中含有某種生長因子 使得毛霉的生長相對較快 豆乳凝固酶的產(chǎn) 量提高 因此 選擇玉米粉為最佳碳源 4 1 2 不同濃度的玉米粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 將玉米粉按0 0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0 添加到發(fā)酵培養(yǎng)基j i 中 其 它成分不變 2 5 0 r n l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入5 的種子液 在2 8 培養(yǎng) 箱中靜置培養(yǎng)5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖9 由圖9 可知 在不同濃度 的玉米粉中 玉米粉濃度為2 0 2 5 時 豆乳凝固酶的產(chǎn)量最高 但當玉米 粉濃度達到2 5 時 高溫滅菌后培養(yǎng)基粘性明顯增加 過濾后發(fā)酵液體積明顯 少于2 0 的培養(yǎng)基 當玉米粉濃度達到3 0 時 培養(yǎng)基變成糊狀 搖瓶時不 能達到要求 該霉菌雖然能 f 常生長 但發(fā)酵液呈糊狀 發(fā)酵液不能分離出來 按前面測酶活力的方法不能測其酶活力 因此選擇2 o 為最適合的玉米粉濃 席 p i 學碩士學位論文 1 0 0 8 0 一 52 o2 53 o 玉米粉濃度 圖9 不同濃度的玉米粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 42 氮源對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 2 l 不同氮源對豆乳凝固酶相對 2 量的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基i i 中 分別以3 0 n a n 0 3 蛋白胨 牛肉膏 黃豆粉 為 氮源 其它成分不變 2 5 0 m l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入5 的種子液 在 2 8 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖1 0 由圖1 0 可知 在幾種不同氮源中 黃豆粉為氮源時 豆乳凝固酶的產(chǎn)量最高 因此 選擇黃 豆粉為最佳氮源 1 0 0 8 0 譽 s 6 0 蟮4 0 簧 暈2 0 l l 牛肉膏蛋白胨 n a n 0 3 黃豆粉 氨源 圖1 0 不同氨源對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 2 2 不同濃度的黃豆粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 將黃豆粉按0 1 0 2 0 3 0 4 0 添加到發(fā)酵培養(yǎng)基i i 中 其它成分不變 2 5 0 m l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入5 的種子液 在2 8 c 培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng) 5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖i l 從圖1 l 中可以看出 隨著黃豆粉濃度 一 j 一 o i 加0 o 四川i 大學碩十學位論文 的增加 發(fā)酵液的酶活力提高 但 3 0 4 0 黃豆粉濃度時 單位體積的發(fā)酵 液豆乳凝固酶的酶活力變化不大 因此 從節(jié)省原料考慮 選擇3 0 的黃豆 粉濃度為最佳濃度 l o o 8 0 6 0 4 0 2 0 o 黃且粉濃度 圖11 不同濃度的黃豆粉對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 43 發(fā)酵溫度對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)配方的基礎上 2 5 0 m l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接八 5 的種子液 將培養(yǎng)的溫度分別設置為2 0 2 5 2 8 3 0 c 3 5 c 下靜置 發(fā)酵5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖1 2 由圖1 2 可知 發(fā)酵溫度為2 5 和2 8 時 豆乳凝固酶的產(chǎn)量較高 但差別不大 而3 0 培養(yǎng)時 最先有香 味 培養(yǎng)3 6 h 左右發(fā)現(xiàn) 隨時間延長逐漸變濃 此香味是毛霉h s d 1 l 生長過 程中分泌出來的 但酶活卻不高 因此最適發(fā)酵溫度為2 5 2 8 c 1 0 0 8 0r s6 0 燠4 0 引 2 0 2 52 83 0 培養(yǎng)溫度 圈1 2 溫度對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 4 發(fā)酵時間對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 四川大學碩 l 學位論文 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)配方的基礎上 2 5 0 r a l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入 j 的種子液 混勻后在2 8 c 下靜置培養(yǎng) 分別在發(fā)酵時間為3 6 4 8 6 0 7 2 8 4 9 6 1 2 0 1 4 4 小時的時候 取發(fā)酵液測酶活力 結果見表圖1 3 由圖1 3 可知 當培養(yǎng)時間為1 2 0 小時 發(fā)酵液中豆乳凝固酶活力達到雖高 隨著時間 的延長 單位體積的發(fā)酵液巾酶活力無明顯變化 因此 最佳發(fā)酵時間為1 2 0 小時 1 0 0 8 0 6 0 4 0 2 0 0 4 86 07 28 49 612 01 4 4 培養(yǎng)時間 h 圖13 培養(yǎng)時間對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 5 接種量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 液體種子 1 0 2 0 5 0 1 0 o v v 的接種量接種于優(yōu)化后 的發(fā)酵培養(yǎng)基 2 5 0 r a l 三角瓶中裝5 0 r a l 培養(yǎng)液 混勻后在2 8 c 下靜置培養(yǎng)5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖1 4 由圖1 4 可知 隨著液體種子的接種量的增 加 豆乳凝固酶的產(chǎn)量呈增長趨勢 而當接種量為5 o 1 0 時 產(chǎn)量變化 不大 因此 液體種子的接種量選擇為5 1 0 0 s 8 0 一r 6 0 輦4 0 冪2 0 o 1 02 05 o1 0 0 接種量 圖1 4 接種量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 2 4 p q 川人學母h j 學位論文 46 培養(yǎng)基起始p h 對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)配方的基礎上 2 5 0 m li 角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 分別將 培養(yǎng)基的p h 調為5 0 5 5 6 0 6 5 7 0 接入5 的種子液 混勻后在2 8 4 c 下靜置培養(yǎng)5 d 取發(fā)酵液測酶活力 結果見圖1 5 由圖1 5 可知 培養(yǎng)基地p h 為6 0 時 豆乳凝固酶的產(chǎn)量最高 o o 8 0 6 0 4 0 2 0 0 p h 圖1 5 培養(yǎng)基起始p h 對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 7 培養(yǎng)基裝輻量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 在優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)配方的基礎上 在2 5 0 m l 三角瓶中 分別裝1 0 2 5 5 0 1 0 0 m l 發(fā)酵培養(yǎng)基 接入5 的種子液 混勻后在2 8 下靜置培養(yǎng)5 d 取 發(fā)酵液測酶活力 結果見圖1 6 由圖1 6 可知 裝瓶量與豆乳凝固酶的產(chǎn)量呈 反比趨勢 一1 羔 姜e 一 莪l 0 體積 m 1 圖16 裝瓶量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響 4 8 震蕩培養(yǎng)箱的轉速對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影晌 四川人學碩1 學位論文 通過上面的培養(yǎng)基裝瓶量對豆乳凝固酶產(chǎn)量的影響實驗可以看出毛霉 h s d i l 是好氧菌 但如果三角瓶中裝液量過少 將很大程度上影響生產(chǎn)效率 于是以2 5 0 m l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液為標準 用震蕩培養(yǎng)來補充氧氣 促進 該菌的生長 但培養(yǎng)后期震蕩可能導致菌絲斷裂 從而影響酶的分泌 而在發(fā) 酵溫度優(yōu)化過程中 發(fā)現(xiàn)該菌前期在2 8 是生長最快 因此在發(fā)酵前期以2 8 作為震蕩培養(yǎng)溫度 所以2 5 0 m l 三角瓶中裝5 0 m l 培養(yǎng)液 接入5 的種子液 分別在1 2 0 r p m 1 5 0 r p m 1 8 0 r p m 下培養(yǎng)2 d 后再靜置培養(yǎng)3 d 取發(fā)酵液測酶活力 發(fā)現(xiàn)先在 1 5 0 r p m 下培養(yǎng)2 d 后再靜置培養(yǎng)3 d 所獲得的發(fā)酵液酶活力最高 分析其原因 可能是在1 2 0 r p mf 培養(yǎng) 由于轉速較低 供養(yǎng)量和菌的分散程度受到限制 從而影響了浚菌的生長 而1 8 0 r p m 下培養(yǎng) 由于轉速過快 使得新形成的菌 絲還未能成熟就脫離了母體 影響了該菌的生長 從而導致酶產(chǎn)量的下降 4 9 討論 在產(chǎn)酶發(fā)酵過程中 酶的合成是受到多種發(fā)酵條件控制的 條件不同 對 酶產(chǎn)量的影響是很大的 通過以上對毛酶h s d 1 1 產(chǎn)酶發(fā)酵條件的研究表明 毛酶h s d 1 l 菌株適宜的產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基為玉米粉2 黃豆粉3 n a c l o 0 5 m g s 0 40 0 2 i 2 h p 0 4 0 1 起始p h 為5 5 6 0 接入5 的種 子液 先在3 0 c 1 5 0 r p m 下培養(yǎng)4 8 h 再在2 5 2 8 c 下靜置培養(yǎng)7 2 h 后 所 獲得的發(fā)酵液中豆乳凝固酶活力穩(wěn)定保持在1 1 u m l 左右 5 豆乳凝固酶