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原花青素提取方法的研究進展【摘要】原花青素是一種具有重要生理活性的多酚類化合物。本文綜述了天然原花青素的提取方法，其中包括有機溶劑提取、微波提取、超聲波提取、超臨界CO2萃取以及酶法等，以期為開發(fā)利用原花青素提供依據?！娟P鍵詞】原花青素；提取方法；研究進展原花青素（簡稱PC）是植物界中廣泛存在的一大類多酚類化合物。植物化學家通常將從植物中分離得到的一切無色的、在無機酸存在和加熱處理下能產生紅色的花青素（Cyanidin）的一類多酚化合物統(tǒng)稱為原花青素。許多研究表明，原花青素是清除自由基很強的抗氧化劑，其抗氧化、清除自由基的能力是VE的50倍、VC的20倍，它能防治80多種因自由基引起的疾病，包括心臟病、關節(jié)炎等，還具有改善人體微循環(huán)功能。目前，原花青素已廣泛應用于食品、藥品、化妝品等領域。全世界對原花青素的研究越來越深入，其中對原花青素提取方法的研究是一大重點。原花青素傳統(tǒng)的提取方法是有機溶劑提取法，但這種方法存在著對有效成分損失大、周期長、工序多、提取率不高等缺點，因此近10年來，在植物有效成分的提取方面出現了許多新技術、新方法，如超臨界CO2萃取技術、超聲波提取技術、微波萃取技術以及酶解技術等?，F將原花青素提取方法綜述如下。1原花青素的分類及分布原花青素是一大類多酚化合物的總稱，起初統(tǒng)稱歸于縮合鞣質或黃烷醇類。最簡單的原花青素是兒茶素、表兒茶素或兒茶素與表兒茶素形成的二聚體。此外，還有三聚體、四聚體等直至十聚體。按聚合度的大小，通常將二四聚體稱為低聚體（ProcyanidolicOligomers，簡稱OPC），將五聚體以上的稱為高聚體（ProcyanidolicPolymers，簡稱PPC）。OPC為水溶性物質（PPC水溶性較差）、極易吸收；OPC消除自由基的能力與分子結構、聚合度有關。二聚體中，因兩個單體的構象或鍵合位置的不同，可有多種異構體，易分離鑒定的8種結構形式分別命名為B1B8，其中，B1B4是由C4C8鍵合，B5B8是由C4C6鍵合。在各類原花青素中，二聚體分布最廣，研究得最多，也是最重要的一類原花青素。三聚體中，也因組成的單體及其相連接碳原子位置的不同形成各種各樣的結構并命名為C1、C2等，其中C1在自然界中分布最豐富。研究表明，原花青素主要分布于以下的植物中：葡萄、英國山楂、單子山楂、花生、銀杏、日本的羅漢柏、北美的崖柏、土耳其的側柏、花旗松、白燁樹、野生刺葵、番荔枝、野草萄、日本莽草、扁桃、高粱、耳葉番瀉、兩谷椰子、可可豆、貫葉金絲桃、頭狀胡枝子、粘膠乳香樹、海岸松、洋萎陵菜和大黃等。2提取方法21水提取法由于有機溶劑會帶來環(huán)境污染和產品的有毒有機物殘留，人們在大力發(fā)展對環(huán)境友好的綠色提取技術水提取法。Masquelier最早從松樹皮中用沸水粗提、乙酸乙酯純化得到原花青素。1998年Duncan和Gilmour發(fā)明一種從植物材料（樹皮、樹葉、葡萄籽、皮、大豆、綠茶）中提取原花青素的方法。將材料粉碎（15mm），常壓、60100或高壓100125條件下采用脫氧熱水提取（1min20h），過濾采用超濾或反滲透或兩者連用，濃縮濾液，真空噴霧或冷凍干燥，此法主要是提取分子量5000D的水溶性原花青素，得率為05100之間，通常為6596（隨取樣部位的差異而定），分離得到原花青素B1、B3、B6和C2。獲得的產物對AAPH引發(fā)的亞油酸的氧化有明顯抑制作用，1gmL能達到7079的抑制率。毒理學檢測表明：對于按人體重劑量給藥組和100倍人體質量的劑量給藥組24h內無毒害和副作用產生，慢性毒理學（5個月）試驗也無明顯毒、副作用。1999年Karim等人發(fā)明了在加壓條件下，采用脫氧去離子水提取植物材料中的原花青素。將提取液超濾后，采用疏水性微孔聚合物樹脂作填料的柱色譜方法，選用極性洗脫液（乙醇水）洗脫，將洗脫液采用反滲透方法除去乙醇，干燥得到原花青素。選水作為提取劑，浸提耗時長，溫度高，容易造成原花青素的損失；同時水的極性較大，溶出雜質也較多，很少單獨使用。22傳統(tǒng)有機溶劑提取傳統(tǒng)的有機溶劑提取法有回流、滲漉及恒溫水浴等方法。甲醇、丙酮、乙醇和乙酸乙酯是提取葡萄籽原花青素常用的有機溶劑，它們對原花青素有很好的溶解性，它們的極性大小順序為甲醇乙醇丙酮乙酸乙酯。乙醇是常用的提取溶劑，價格低廉，來源豐富。乙酸乙酯提取出的原花青素成分生物活性較好，但是由于極性較小，對原花青素的提取并不完全。甲醇和丙酮水溶液（5075）對原花青素都有較好的提取性能，同時也多用做原花青素含量測定時的提取溶劑。熊何健等人比較了甲醇、乙醇、丙酮水溶液對多酚的提取效果，結果表明：70丙酮水溶液為最好溶劑。丙酮水溶液提取效果好的原因：原花青素分子含有多個苯環(huán)和醚鍵，油溶性較強，同時又有大量的羥基連接在分子骨架上，在水中具有很好的溶解性，擁有油水雙溶性的丙酮與之相互匹配，原花青素的溶解度自然增加，其提取率相應得到提高。Sun等人認為葡萄籽中的原花青素物質通常以結合態(tài)與蛋白質、纖維素結合在一起，一般不易提出，通常選用有機溶劑或水提取，具有斷裂氫鍵的作用。同時由于有機溶劑的滲透性較差，一般不單獨使用，常需要水作為傳質劑。Romanczyk等人發(fā)明從可可中提取原花青素時，對脫脂可可豆用質量分數70甲醇去離子水提取后，再用質量分數70丙酮去離子水溶劑提取2次，真空濃縮，除去有機溶劑后，再溶于水中，用CHCl3提取，其水相用乙酸乙酯提取后，真空濃縮除去乙酸乙酯，水相冷凍干燥，得到原花青素。由于有機溶劑提取時間長，對熱不穩(wěn)定成分易被破壞，雜質含量高，不易純化，萃取溶劑消耗量大以及污染環(huán)境等缺點，許多學者都在研究開發(fā)新型提取方法。23微波輔助提取法微波輔助提取過程中，微波輻射導致植物細胞內的極性物質，尤其是水分子，產生大量熱量，使得細胞內的溫度迅速上升，液態(tài)水汽化產生的壓力將細胞膜和細胞壁沖破，形成微小的孔洞，進一步加熱，導致細胞內部和細胞壁水分減小，細胞收縮，表面出現裂紋。由于孔洞和裂紋的存在，胞外溶劑容易進入細胞內，溶解并釋放細胞內原花青素。微波的頻率很高，能深入滲透物體，對細胞的結構有較大作用。微波加熱的熱效率高，溫度升高快速而均勻，因此，應用微波加熱提取手段，能夠顯著縮短提取時間，較大程度地提高原花青素的提取效率。劉征濤等人發(fā)明了一種采用頻率為2450MHz或915MHz、功率為50015000W的微波對葡萄籽在選自水、碳鏈長為C1C3的醇、乙醚、丙酮、乙酸乙酯、甲苯或其混合物的溶劑中進行處理，從葡萄籽提取原花青素類物質的新方法。該方法較常規(guī)化學法工藝簡便、高效、快速，成本低，廢液排放量少。王克亮等人利用微波輔助提取葡萄整籽中的原花青素，研究了不同操作條件及不同因素對原花青素浸取率的影響。試驗結果表明，對葡萄整籽最佳提取條件為：浸泡時間48h，固液比13，微波作用時間30min，溶劑濃度40，占空比30。當滿足上述條件時浸取率高達5976。經正交分析可知，在5個影響因素中微波作用時間和溶劑濃度對原花青素浸取率的影響最顯著。李鳳英等人研究了微波對葡萄籽原花青素的浸出和結構的影響。結果表明，以乙醇為介質，微波處理有利于葡萄籽中原花青素的浸出，葡萄籽整粒用料液比（gL）11的體積分數70乙醇溶液，微波處理10s，在50水浴浸提30min，原花青素浸提量為4109mgg，較不用微波處理同等水浴條件浸提量增加1715mgg。通過對微波聯(lián)合水浴浸提和單純水浴浸提的原花青素的紫外圖譜顯示短時微波處理對原花青素的分子結構沒有破壞作用。微波輔助提取原花青素根據提取設備的不同一般提取時間從幾分鐘到幾十分鐘不等，同時在操作方面也具有一定的優(yōu)越性，但是提取過程使用了有機溶劑，這是微波輔助提取的最大缺點。24超聲輔助提取法應用超聲技術來強化提取過程，可有效提高提取效率，縮短提取時間，而且，超聲波破碎過程不會改變被浸泡的化學成分的結構和性質。超聲的機械作用通過破壞細胞壁和加強細胞內的傳質作用，提高了植物中有機化合物的提取速度。超聲波在液體內傳播時，液體介質不斷受到壓縮和拉伸，在拉力作用下，液體斷裂形成暫時的近似真空的空洞，壓縮時，這些空洞就會發(fā)生崩潰，出現局部高溫以及放電現象，產生空化作用。超聲波空化可以從穩(wěn)態(tài)空化轉化成瞬態(tài)空化，空化泡瞬間長大破裂，吸收的能量在極短的時間和極小的空間內釋放出來，形成高溫高壓的環(huán)境，同時伴隨有一定強度的沖擊波和微聲流，從而破壞細胞壁結構，使其在瞬間破裂，釋放細胞內的有效成分，使溶劑滲透到細胞中，令其中的化學成分溶于溶劑中，從而大大提高了提取率。在提取原花青素之類的熱敏性物質顯示出了優(yōu)越的性能。鐘振聲等人研究了從葡萄籽中提取原花青素的改進工藝，主要考察超聲波作用對原花青素提取率和提取物含量的影響，并與傳統(tǒng)溶劑法進行了對比。試驗表明，把風干的葡萄籽破碎成061mm的微小顆粒，先按1g葡萄籽加3mL溶劑的比例加入石油醚，常溫浸泡48h脫除油脂；再按照1g葡萄籽加20mL溶劑的比例，分別用乙醇（C2H5OH）95、丙酮（CH3COCH3）99和純水在常溫下浸泡2h，浸泡期間采用超聲波震蕩加強傳質，原花青素的提取率分別達到463、459和255（以葡萄籽的投料質量計算），提取率分別比不施加超聲波震蕩的傳統(tǒng)溶劑提取法提高11、66和48。吳澎等人采用超聲波法，用乙醇作提取溶劑從西伯利亞白刺果籽中提取原花青素，研究了各種提取條件對白刺籽原花青素提取率的影響。試驗結果表明，白刺果籽中原花青素提取的最佳工藝條件是：體積分數60，乙醇為浸提劑，超聲波輔助提取，提取時間為20min，提取3次，料液比為1g4mL。波蘭Oszmianski1996年申請專利，以丙酮為溶劑，采用超聲波從葡萄籽中提取低聚原花青素，乙酸乙酯在18萃取，三氯甲烷沉淀產物。超聲輔助提取原花青素根據提取設備的不同一般提取時間從幾十分鐘到一兩個小時不等，但是提取過程使用了有機溶劑，這也是超聲輔助提取的最大缺點。25超臨界CO2萃取超臨界CO2萃取是近20年來迅速發(fā)展起來的一種新型萃取分離技術，它是以超臨界狀態(tài)下的CO2流體為溶劑來提取分離混合物的過程，具有很強的溶解能力和滲透能力以及良好的流動性和傳遞性。超臨界CO2萃取正越來越多的用于葡萄籽中原花青素的萃取，其萃取率高，而且使原花青素不受到空氣和光的影響，但由于設備昂貴，推廣使用比較困難。孫云鵬等人發(fā)明一種采用超臨界CO2加丙酮和水組成的極性改性劑，從銀杏葉中萃取原花青素的方法。在萃取溫度6090，萃取壓力2035MPa下加入5080丙酮與2050水組成的極性改性劑，萃取時間24h，進行靜態(tài)、動態(tài)萃取。萃取液經傳統(tǒng)的樹脂濃縮和噴霧干燥器干燥，得到精制銀杏葉提取物。產品含銀杏黃酮甙35g100g，萜內酯8g100g，原花青素7g100g，酚酸5mgkg。該法的優(yōu)點是流程短，能萃取最強的天然抗氧化劑原花青素。成智濤等人以“紫秋”刺葡萄種子為原料，采用單因素試驗和正交試驗，探討了超臨界CO2萃取刺葡萄籽原花青素的工藝。研究結果表明，最佳的萃取條件為萃取壓力30MPa、萃取溫度55、料液比108、60的乙醇為夾帶劑、萃取時間60min，在此條件下，原花青素的產率為1758mg100g，純度可達897。胡佳興等人以原花青素含量為指標，考察了萃取溫度、壓力、CO2流量、萃取時間4個因素對葡萄籽中原花青素的超臨界CO2流體萃取的影響。研究結果表明，以甲醇做夾帶劑，藥材質量30g，萃取壓力32MPa，萃取溫度40，CO2流量為10Lh的條件下萃取60min為最佳工藝。超臨界CO2萃取法提取葡萄籽中原花青素耗時少、準確、效率高。吳朝霞等人采用超臨界CO2萃取技術提取葡萄籽中低聚原花青素，并初步分析了產物的構成。結果表明，不使用夾帶劑時，不能萃取出低聚原花青素；甲醇或乙醇作為夾帶劑時可以增加低聚原花青素的提取率，且甲醇效果更好，但總體提取率仍較低；進一步的色譜分析表明，產物中含有兒茶素、表兒茶素及兩種二聚體。超臨界CO2萃取原花青素需要使用丙酮、水、甲醇或乙醇等極性改性劑作夾帶劑，提取的效果也根據提取設備和提取的條件的不同而不同，一般提取時間從幾十分鐘到一兩個小時。26酶提取法酶反應較溫和地將植物組織分解，可以較大輻度地提高收率，故不失為一種最大限度從植物體內提取有效成分的方法，是一項很有前途的新技術。目前，應用較多的是纖維素酶，大部分植物的細胞壁是由纖維素構成的，植物的有效成分往往包裹在細胞壁內，纖維素酶是一組復合酶，能夠水解纖維，使植物細胞壁破壞，充分釋放細胞內含物，有利于對有效成分的提取，進而提高物料的利用率。吳春等人以葡萄籽中原花青素的提取率為指標，采用單因素法和正交設計法對纖維素酶解法提取工藝條件進行優(yōu)選。試驗結果表明，影響酶法提取原花青素的因素次序為：酶解溫度酶解濃度pH值乙醇濃度，其最佳工藝條件為：酶解濃度為010，酶解溫度為50，pH值為55，乙醇濃度為60，所得葡萄籽中原花青素的提取率為416。使用酶法提取原花青素環(huán)保無污染，是今后研究的一個重要方向。3展望原花青素是一類有特殊醫(yī)療保健功能的多酚物質，在化妝品、保健品、藥品及多種飲料產品上都有著廣泛的開發(fā)應用價值，且富含原花青素的野生植物非常豐富，提取天然原花青素，符合當今人們對保健品的新要求。原花青素的提取從傳統(tǒng)的溶劑萃取法到微波輔助法、超聲輔助法、超臨界CO2萃取以及酶法的應用，總體來說，原花青素的提取效率和安全性都有所提高，對應的提取成本也就有所提高。對于不同的原花青素，要根據其所要達到的目的和具備的條件，采用不同的提取方法。為了達到最好的提取效果，可以將幾種提取方法配合使用，例如可首先采用超臨界CO2萃取葡萄籽油后再采用其他方法提取剩余物中的原花青素，這樣可以排除油的存在對提取原花青素的影響。隨著科學理論的不斷發(fā)展，研究工作的深入，將會有更多、更有效的原花青素的提取方法涌現出來，并且各種提取方法也將逐步走向標準化。所有這些必將為原花青素的利用提供有利的技術支持。參考文獻1MasquelierJPlantextractwithaproanthocyanidinscontentastherapeuticagenthavingradicalscavengereffectandusethereofPUSA，4698360198504092DuncanKandGilmourIProcessforExtractionofProanthocyanadinsfromBotanicalMaterialPUSA，5968517，199910193KarimNM，ThomasTS，WilliamASMethodforextractionofproanthocyanidinsfromplantmaterialUSA，5912363，199906154熊何健，陳益梅，吳國宏，等葡萄籽多酚提取條件的優(yōu)化J食品工業(yè)科技，2004，25（4）：1151165SunBS，PintoT，LeandroMC，etalTransferofcatechinandproanthocyanidinsfromsolidpartsofthegrapeclusterintowineJAmJEnolVitic，1999，50（2）：1791846RomanczykLJ，HammerstoneJF，BuckMMProcyanidincompositionsandmethodsformakingthesamePUSA，6479539，200211127劉征濤，倪紅，陳復微波提取葡萄籽中原花青素類物質的方法P中國，1281857，200101318王克亮，白光輝微波輔助提取原花青素最佳工藝條件的研究J蘭州理工大學學報，2006，32（1）：79819李鳳英，崔蕊靜，李春華采用微波輔助法提取葡萄籽中的原花青素J食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（1）：394210鐘振聲，馮焱，孫立杰超聲波法從葡萄籽中提取原花青素J精細化工，2005，22（1）：414311吳澎，王明林超聲波輔助法提取白刺果籽中原花青素的工藝J食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31（5）：15816012OszmianskiJMethodsofobtainingbiologicallyactiveoligomersofproanthocyanidinsfromplantsPPoland，169082，199613孫云鵬，孫明華，孫傳經超臨界二氧化碳從銀杏葉中萃取含有原花青素物的方法P中國，1228432，1