現(xiàn)代儀器分析__論文.doc

儀器分析 結課論課題：高效液相色譜法研究系別：生物工程系專業(yè)：生物制藥技術班級：制藥1432班學號：201407043240姓名：高慧芳指導老師：王紹良高效液相色譜法研究摘要：高效液相色譜法，也稱高壓液相色譜法。它是在經典的液相柱色譜的基礎上發(fā)展而成的一種高效、快速、高靈敏的色譜分離方法。根據(jù)柱內填料的不同及不同的分離機制，可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜及凝膠色譜。由于采用了高效填充劑，并配以高壓輸液泵、高靈敏檢測器、自動記錄裝置及自動收集裝置，使高效液相色譜法的分離速度及效率均大大提高，更趨于儀器化、自動化，且使用范圍廣。制備型的HPLC能大量分離制備較純的樣品。隨著計算機技術的不斷發(fā)展，HPLC與質譜、核磁共振譜、紅外光譜等波譜技術的聯(lián)用進展加快。關鍵字：液相色譜；分類；應用背景：1903年俄國植物化學家茨維特首次提出“色譜法”和“色譜圖”的概念。茨維特使用色譜法 chromatography來描述他的彩色試驗。他在論文中寫到：植物色素的石油醚溶液從一根主要裝有碳酸鈣吸附劑的玻璃管上端加入，沿管濾下，后用純石油醚淋洗，結果按照不同色素的吸附順序在管內觀察到它們相應的色帶，就象光譜一樣，稱之為色譜圖?！币弧⒏咝б合嗌V法分類根據(jù)分離機理可分為：吸附色譜、鍵合相色譜、離子交換色譜、大小排阻（凝膠）色譜、液-液分配色譜法 。1、吸附色譜分離吸附色譜法是當組分分子流經固定相（吸附劑，如硅膠或氧化鋁）時，不同組分分子、流動相分子就要對吸附劑表面的活性中心展開競爭。這種競爭能力的大小，決定了保留值大小，即被活性中心吸附得越牢的分子，保留值越大。2、鍵合相色譜分離鍵合相色譜法是將類似于氣相色譜中的固定液的液體，通過化學反應鍵合到硅膠表面，從而形成固定相。采用化學鍵合固定相的色譜法稱為鍵合相色譜。若采用極性鍵合相、非極性流動相，則稱為正相色譜；采用非極性鍵合相、極性流動相，則稱為反相色譜。這種分離的保留值大小，主要決定于組分分子與鍵合固定液分子間作用力的大小。3、離子交換色譜分離離子交換色譜法是流動相中的被分離離子，與作為固定相的離子交換劑上的平衡離子進行可逆交換時，它們對交換劑的基體離子親和力大小的不同而達到分離的。組分離子對交換劑基體離子親和力越大，保留時間就越長。4、大小排阻色譜分離大小排阻色譜法的固定相是一類孔徑大小有一定范圍的多孔材料。被分離的分子大小不同，它們擴散滲入多孔材料的容易程度不同。小分子最易擴散進入細孔中，保留時間最長；大分子完全排斥在孔外，隨流動相很快流出，保留時間最短。5、液-液分配色譜法 分離液-液分配色譜的固定相和流動相是互不相溶的兩種溶劑,分離時,組分溶入兩相,不同的組分因分配系數(shù)(K)的不同而被分離.目前廣泛使用的化學鍵合固定相是將固定液的官能團鍵合在載體上而制成的,使用化學鍵合固定相的色譜方法(簡稱鍵合相色譜法)可以用分配色譜的原理加以解釋.鍵合相色譜法在HPLC中占有極其重要的地位,是應用最廣的色譜法.按照固定相和流動相極性的不同,分配色譜法又可分為正相色譜法和反相色譜法兩類. 二、高效液相色譜儀簡介高效液相色譜儀主要由：輸液系統(tǒng)、進樣系統(tǒng)、色譜柱系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、數(shù)據(jù)記錄處理系統(tǒng)等組成。1、輸液泵 ：高效液相色譜的流動相采用高壓泵輸送,有不同類型的輸液泵,按輸液性質可分為恒壓泵和恒流泵.目前使用較多的是柱塞式往復泵。2、進樣器 ：進樣器是將試樣送入色譜柱的裝置.一般要求進樣裝置的密封性好,死體積小,重復性好,保證中心進樣,進樣時對色譜系統(tǒng)的壓力,流量影響小。 3、色譜柱 ： 色譜柱是色譜分離的核心.為了保證色譜柱的柱效高,使用壽命長,一般使用由專業(yè)化工廠生產的商品柱.色譜柱管多由不銹鋼制成,內裝一定的固定相.色譜往長一般1030cm,內徑25mm. 化學鍵合相是廣泛使用的固定相,其中又以十八烷基硅烷鍵合硅膠的應用最為廣泛。 4、檢測器 ：樣品經色譜柱分離后進入檢側器進行檢測.按其適用范圍檢測器可分為通用型和專屬型兩大類,專屬型檢測器只能檢測某些組分的某一性質,紫外檢測器(UVD),熒光檢測器(ED)屬于這一類,它們只對有紫外吸收或熒光發(fā)射的組分有響應;通用型檢測器檢測的是一般物質均具有的性質,示差折光檢測器(RID),蒸發(fā)光散射檢測器(ELSD)等.液相色譜-質譜聯(lián)用(LC-MS)則是用質譜作為高效液相色譜的檢測器。5、數(shù)據(jù)記錄處理和計算機控制系統(tǒng) :現(xiàn)代HPLC的特征是用微機控制儀器.HPLC儀器的中心計算機控制系統(tǒng),即能做數(shù)據(jù)采集和分析工作,又能程序控制儀器的各個部件,還能在分析一個試樣之后自動改變條件而進行下一個試樣的分析,許多色譜儀的軟件系統(tǒng)具有方法認證功能,使分析工作更加規(guī)范化. 三、高效液相色譜的特點高壓壓力可達150300 kg/cm2。色譜柱每米降壓為75 kg/cm2以上。高速流速為0.110.0 mL/min。高效塔板數(shù)可達5000/米。在一根柱中同時分離成份可達100種。高靈敏度紫外檢測器靈敏度可達0.01ng。同時消耗樣品少。 四、高效液相色譜法的應用1.在鑒別中的應用 在HPLC法中,保留時間與組分的結構和性質有關,是定性的參數(shù),可用于藥物的鑒別.如中國藥典收載的藥物頭孢羥氨芐的鑒別項下規(guī)定:在含量測定項下記錄的色譜圖中,供試品主峰的保留時間應與對照品主峰的保留時間一致.頭抱拉定,頭孢噻酚鈉等頭孢類藥物以及地西泮注射液,曲安奈德注射液等多種藥物均采用HPLC法進行鑒別。 2.在雜質檢查中的應用 HPLC分離效能高,靈敏,在藥物的雜質檢查中應用廣泛.主要用于藥物中有關物質的檢查?！坝嘘P物質”是指藥物中存在的合成原料,中間體,副產物,降解產物等物質,這些物質的結構和性質與藥物相似,含量很低,只有采用色譜的方法才能將其分離并檢測.若雜質是已知的,又有雜質的對照品,可用雜質對照品做對照進行檢查.若雜質是未知的,可以采用主成分自身對照法或峰面積歸一化法進行檢查。 3.在含量測定中的應用 用高效液相色譜法側定含量可以消除藥物中的雜質,制劑中的附加劑及共存的藥物對測定的干擾.中藥材及其制劑組成復雜,基中不少有效成分的含量測定也越來越多地采用了高效液相色譜法。五、高效液相色譜法測定VE含量1 實驗目的1.1 了解高效液相色譜儀的基本操作；1.2 了解高效液相色譜儀測定VE的原理。2 實驗原理高效液相色譜儀的系統(tǒng)由儲液器、泵、進樣器、色譜柱、檢測器、記錄儀等幾部分組成。儲液器中的流動相被高壓泵打入系統(tǒng),樣品溶液經進樣器進入流動相，被流動相載入色譜柱（固定相）內，由于樣品溶液中的各組分在兩相中具有不同的分配系數(shù)，在兩相中作相對運動時，經過反復多次的吸附解吸的分配過程，各組分在移動速度上產生較大的差別，被分離成單個組分依次從柱內流出，通過檢測器時，樣品濃度被轉換成電信號傳送到記錄儀，數(shù)據(jù)以圖譜形式打印出來。VE（維生素E）又名生育酚或產妊酚，在食油、水果、蔬菜及糧食中均存在。有抗氧化作用，能增強皮膚毛細血管抵抗力，并維持正常通透性；有改善血液循環(huán)及調整生育功能、抗衰老作用等。VE通過高效液相色譜柱進行分離，PDA檢測器檢測，外標法定量。3實驗器材3.1 實驗樣品VE樣品溶液3.2 實驗試劑濃度為50g/ml的VE標樣3.3 實驗儀器高效液相色譜儀附PDA檢測器4 色譜條件色譜柱：C18柱； 流動相速度：0.3ml/min；進樣量：5l； 柱溫：30。5 實驗結果與討論5.1 實驗結果本次實驗采用的是單點法測定。實驗結果見表1。表1. 液相色譜儀測定蘋果的VE含量進樣量保留時間峰面積標樣5l3.59min42217待測樣品5l3.59min17369樣品中VE的濃度=乙烯標樣的總量蘋果的峰面積/乙烯標樣的峰面積=標樣進樣量標樣中VE的濃度樣品峰面積樣品進樣量標樣峰面積=5l50g/mL17369/（5l42217）=20.57g/mL5.2 實驗討論本次實驗中，測定標樣溶液VE含量時，在指定的保留時間內并未出峰。討論分析原因：樣品溶液在上周實驗后，一直置于離心管中，未避光低溫保存，導致樣品中VE氧化，液相測定時沒有在相應的時間出峰。本次實驗時間較短，且主要目的是了解高效液相色譜儀的基本操作，以及液相色譜儀測定VE的原理，故結合前組同學對VE含量的測定數(shù)據(jù)進行討論與分析。因時間有限，實驗采用了單點法進行測量分析，且無平行重復，這樣誤差較大。我們以后實驗時，VE標樣可以選擇5個濃度，每個濃度分別測定3-4次，取其峰面積的平均值后作標準曲線，這樣誤差更小。六.應用前景展望液相色譜分析是指流動相為液體的色譜技術,是色譜法中最古老的一種,但通過改進填料的粒度及柱壓,在經典的液相柱色譜的基礎上引入了氣相色譜的塔板理論,在技術上采用了高壓輸液泵,高效固定相和高靈敏度的檢測器,實現(xiàn)了分析速度快.分離效率高和操作自動化,這種色譜技術被稱為高效液相色譜法。它出現(xiàn)不過三十多年的時間，但這種分離分析技術的發(fā)展十分迅猛，目前應用也十分廣泛。其儀器結構和流程也多種多樣。典型的高效液相色譜儀結構。高效液相色譜儀一般都具備貯液器、高壓泵、梯度洗提裝置（用雙泵）、進樣器、色譜柱、檢測器、恒溫器、記錄儀等主要部件。 高效液相色譜更適宜于分離、分析高沸點、熱穩(wěn)定性差、有生理活性及相對分子量比較大的物質，因而廣泛應用于核酸、肽類、內酯、稠環(huán)芳烴、高聚物、藥物、人體代謝產物、表面活性劑，抗氧化劑、殺蟲劑、除莠劑的分析等物質的分析。 對于高效液相色譜的發(fā)展前景應該是非常樂觀的，現(xiàn)在的社會的發(fā)展節(jié)奏很快，各個領域對于分析檢驗的需求很多，而分析檢驗中，HPLC所占的比重是不言而喻的，已成 化學、醫(yī)學、工業(yè)、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。所以她的發(fā)展情景很樂觀。理由有幾點1， 隨著科技的發(fā)展，技術的日臻完善，較之以前色譜分析的方法有了很大程度的提高，很多科學家在對于一些分析上的難點有了新的突破，這樣一個不斷完善的技術在以后的社會發(fā)展中一定會扮演著一個重要的角色。 2， 最近,一些先進的檢測儀器成功的用在了高效液相色譜分析法上,使得高效液相色譜的應用更廣泛,并充分利用高效快速.選擇性好.靈敏度高等優(yōu)點,建