免疫檢測(cè)技術(shù).ppt

第九章 免疫檢測(cè)技術(shù) 免疫檢測(cè)是目前生物學(xué)檢測(cè)方法中用途最廣泛的一種方法 具有高度精確 靈敏 特異的特點(diǎn) 可用于免疫學(xué)的基礎(chǔ)理論和應(yīng)用研究 也可應(yīng)用于生物學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域 1 免疫疾病診斷2 動(dòng)物植物生理活動(dòng)研究 激素 維生素 3 物種及微生物鑒定4 動(dòng)物 植物性狀的免疫標(biāo)記5 免疫增強(qiáng)藥物和疫苗的研究6 發(fā)病機(jī)理研究7 分子生物學(xué)研究 免疫檢測(cè)技術(shù)在生物科學(xué)領(lǐng)域中的應(yīng)用 第一節(jié)抗原抗體反應(yīng)原理 抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原 并與之結(jié)合 這種結(jié)合在體外也能發(fā)生 當(dāng)抗原和抗體在體外特異性結(jié)合后可出現(xiàn)肉眼可見或借助儀器可檢測(cè)出的反應(yīng)現(xiàn)象 試驗(yàn)時(shí)既可用已知抗體檢測(cè)標(biāo)本中有無相應(yīng)抗原 也可用已知抗原檢測(cè)標(biāo)本中有無相應(yīng)抗體 這種特性就是許多免疫檢測(cè)方法的基礎(chǔ) 一 體外抗原抗體反應(yīng)的特點(diǎn) 特異性 抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性 可逆性 抗原抗體反應(yīng)所形成的復(fù)合物較穩(wěn)定 但在一定條件下可解離 低酸 高鹽 比例性 抗原抗體的比例合適 才可出現(xiàn)可見的反應(yīng)現(xiàn)象 網(wǎng)格理論 階段性 特異性結(jié)合階段和可見反應(yīng)階段 網(wǎng)格理論 解釋抗原抗體形成沉淀的機(jī)制 網(wǎng)格學(xué)說 latticetheory 抗體過剩 抗原過剩 抗體抗體比例合適 抗原 抗體 二 影響抗原抗體反應(yīng)的因素 溫度 在一定溫度范圍內(nèi) 提高溫度可加速反應(yīng)速度 縮短反應(yīng)時(shí)間 常用反應(yīng)溫度為37 45 溶液的pH pH過高或過低可改變抗原和抗體理化性質(zhì) 影響反應(yīng)結(jié)果 因此溶液的pH應(yīng)適宜 pH6 8 電解質(zhì) 反應(yīng)中必須有適宜的電解質(zhì) 0 85 NaCl 參與 否則不出現(xiàn)可見反應(yīng) 三 抗原抗體反應(yīng)類型 1 沉淀反應(yīng)2 凝集反應(yīng)3 補(bǔ)體參與的反應(yīng)4 中和反應(yīng)5 免疫標(biāo)記技術(shù) 第二節(jié)常見免疫檢測(cè)方法 可溶性抗原 血清蛋白 病毒抗原 細(xì)胞裂解液或組織液等 與相應(yīng)抗體結(jié)合 在一定條件下形成肉眼可見的沉淀物稱沉淀反應(yīng) 一 免疫沉淀反應(yīng) 一 免疫沉淀反應(yīng) 1 液相沉淀反應(yīng) 2 凝膠擴(kuò)散沉淀 3 凝膠免疫電泳 絮狀沉淀 環(huán)狀沉淀 免疫濁度沉淀 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 血清免疫電泳 火箭電泳 對(duì)流免疫電泳 免疫印跡等 絮狀沉淀試驗(yàn) 操作步驟 1 將可溶性抗原作一系列倍比稀釋 2 各管加入一定濃度的適量抗血清 3 振搖使抗原 抗體充分混勻 置37 孵育 4 產(chǎn)生沉淀量隨抗原量而不同 以出現(xiàn)沉淀物最多的管為最適比例管 絮狀沉淀試驗(yàn)方法簡(jiǎn)單 設(shè)備要求低 敏感度較低 目前多用以測(cè)定抗原抗體反應(yīng)的最適比 環(huán)狀沉淀試驗(yàn) 操作步驟 1 用毛細(xì)滴管吸取抗血清加于沉淀管 5 50mm 底部 避免產(chǎn)生氣泡 已知 2 將抗原溶液沿管壁緩緩疊加于抗血清液面上 形成清晰的交界面 待測(cè) 3 置沉淀管于室溫下使其反應(yīng) 1 5min內(nèi)在兩界面間呈現(xiàn)乳白色沉淀環(huán)為陽性 30min仍無沉淀環(huán)出現(xiàn)則為陰性 應(yīng)用 主要用于抗原的定性試驗(yàn) 用已知抗體來檢測(cè)未知抗原 診斷炭疽的Ascoli實(shí)驗(yàn) 細(xì)菌分型 血跡鑒定 2 凝膠擴(kuò)散沉淀 凝膠擴(kuò)散沉淀是指抗原與抗體在凝膠介質(zhì)中自由擴(kuò)散形成濃度梯度 抗原與抗體在比例合適的擴(kuò)散部位相遇形成沉淀線的反應(yīng) 常用的凝膠有瓊脂 瓊脂糖 葡聚糖或聚丙稀酰胺凝膠等 最常用的方法為 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 單向瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn) 原理 將適當(dāng)濃度的抗體混入瓊脂凝膠中 瓊脂凝固后 打成小孔 加入待測(cè)的抗原物質(zhì) 使抗原在凝膠中由小孔自由向周圍擴(kuò)散 并在小孔周圍合適的位置與抗體結(jié)合形成沉淀環(huán) 沉淀環(huán)的大小與抗原濃度呈正相關(guān) 單向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)示意圖 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn) 雙向免疫擴(kuò)散試驗(yàn)是在瓊脂板上按一定距離打數(shù)個(gè)小孔 在相鄰的兩孔內(nèi)分別放入抗原和抗體材料 當(dāng)抗原和抗體向四周凝膠中擴(kuò)散 在兩孔間可出現(xiàn)2 3條沉淀線 本法常用于抗原或抗體的定性或定量檢測(cè) 或用于兩種抗原材料的抗原相關(guān)性分析 3 免疫電泳技術(shù) 免疫電泳技術(shù)是電泳分析與沉淀反應(yīng)的結(jié)合產(chǎn)物 這種技術(shù)有兩大優(yōu)點(diǎn) 一是加快了沉淀反應(yīng)的速度 二是將某些蛋白組分利用其帶電荷的不同而將其分開 再分別與抗體反應(yīng) 以此作更細(xì)微的分析 免疫電泳包括 血清免疫電泳 對(duì)流免疫電泳 火箭電泳 免疫印跡等 血清免疫電泳 將抗原混合物 病人血清 在凝膠中用電泳分離后 沿電泳方向挖一平行的小槽 加入抗血清 進(jìn)行雙向擴(kuò)散 沉淀線的特點(diǎn)顯示病人血清與正常人血清存在的差異 即血清蛋白組分的缺少或增加 免疫電泳原理圖解 火箭免疫電泳 火箭免疫電泳技術(shù)又稱作單向電泳擴(kuò)散免疫沉淀試驗(yàn) 它是由單向擴(kuò)散發(fā)展起來的一項(xiàng)定量技術(shù) 實(shí)質(zhì)上是加速度的單向擴(kuò)散 沉淀線的高度與抗原量成正比 火箭電泳圖 二 凝集反應(yīng) Agglutination 顆粒性抗原 如細(xì)菌 細(xì)胞 與相應(yīng)抗體 在適當(dāng)電解質(zhì)存在的條件下 經(jīng)過一定時(shí)間后出現(xiàn)肉眼可見凝集塊稱為凝集反應(yīng) 1 直接凝集 將細(xì)菌或紅細(xì)胞與相應(yīng)的抗體直接反應(yīng) 出現(xiàn)細(xì)菌凝集或紅細(xì)胞凝集現(xiàn)象 又分為玻片法和試管法 2 間接凝集 將可溶性抗原包被在紅細(xì)胞或乳膠顆粒表面 與相應(yīng)抗體反應(yīng)出現(xiàn)顆粒凝集現(xiàn)象 妊娠免疫診斷試驗(yàn) 孕婦尿中 絨毛膜促性腺激素 HCG 含量明顯增高 HCG是可溶性抗原 反之 非孕婦尿中HCG含量甚微 不足以消耗掉抗HCG抗體 三 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 2個(gè)系統(tǒng) 5種成分 已知抗原加入血清 檢測(cè)抗體 加入標(biāo)準(zhǔn)量補(bǔ)體 加入包被抗體的紅細(xì)胞 檢測(cè)紅細(xì)胞溶解情況 Ag Ag 三 補(bǔ)體結(jié)合實(shí)驗(yàn) 2個(gè)系統(tǒng) 5種成分 免疫標(biāo)記技術(shù)是采用酶 熒光素 放射性核素等標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 免疫標(biāo)記技術(shù)既可對(duì)樣品作定性 定量檢測(cè) 也可進(jìn)行定位分析 且大大提高了方法的靈敏度 是目前應(yīng)用最廣泛的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù) 四 免疫標(biāo)記技術(shù) 常見標(biāo)記免疫技術(shù) 放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 四 免疫標(biāo)記技術(shù) 該法是用放射性核素作為標(biāo)記物標(biāo)記抗原或抗體所進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 盡管放射免疫技術(shù)需特殊儀器設(shè)備且有一定的放射性危害 但由于其具有高度的靈敏度 pg 和自動(dòng)化檢測(cè)等特點(diǎn) 因此在實(shí)驗(yàn)研究和臨床檢測(cè)中仍被廣泛應(yīng)用 主要用于激素 小分子藥物 腫瘤標(biāo)志物等小分子化合物的定量分析 1 放射免疫技術(shù) 125I 放射免疫分析 基本原理 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合反應(yīng)的經(jīng)典標(biāo)記抗原 Ag 和非標(biāo)記抗原 Ag 與限量抗體 Ab 競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合Ag 和Ag具有等同的與Ab結(jié)合能力 放射免疫測(cè)定法 RIA 示意圖 RIA法原理及標(biāo)準(zhǔn)曲線 75 50 30 10 0 1 10 100 1000 未標(biāo)記抗原濃度 ng mL 結(jié)合 未結(jié)合的放射活性 Ag Ab Ag 將熒光素 異硫氰酸熒光素或羅丹明等 標(biāo)記抗體 制成熒光抗體診斷試劑 用熒光顯微鏡觀察熒光的產(chǎn)生或熒光強(qiáng)度 以此判斷抗原的存在 定位和分布情況 免疫熒光技術(shù)有直接法和間接法等 2 免疫熒光技術(shù) 免疫熒光技術(shù) 直接法 免疫熒光技術(shù) 間接法 免疫熒光染色顯示細(xì)胞骨架 免疫熒光染色是利用抗原 抗體特異性結(jié)合的原理 用經(jīng)熒光染料標(biāo)記的抗體對(duì)細(xì)胞或組織內(nèi)的蛋白質(zhì)進(jìn)行定性或定量研究的方法 該技術(shù)與熒光顯微鏡觀察相結(jié)合 可對(duì)特定的蛋白質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞或組織內(nèi)的精確定位 常用于抗原 抗體標(biāo)記的熒光染料有以下幾種顯示綠色熒光 Fluoresceinisothocyancie FITC Alexa 488顯示紅色熒光 RhodamineB TexasRed Alexa 546 568 594顯示藍(lán)色熒光 Alexa 350 用Alexa488標(biāo)記的抗人 tubulin抗體染色顯示微管 綠色 細(xì)胞核 紅色 DAPI染色 人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色 用抗 tubulin抗體染色顯示微管 綠色 細(xì)胞核 紅色 DAPI染色 激光共聚焦顯微鏡照片 PtK1細(xì)胞免疫熒光染色 本法是抗原抗體反應(yīng)的特異性與酶對(duì)底物的高效催化活性相結(jié)合的免疫檢測(cè)技術(shù) 酶標(biāo)記的抗原或抗體與待檢標(biāo)本中的相應(yīng)成分特異性結(jié)合 根據(jù)酶作用底物后的顏色變化 采用肉眼或酶標(biāo)檢測(cè)儀分析 判斷結(jié)果 常用方法有酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和酶免疫組化法 前者用于檢測(cè)可溶性抗原或抗體 后者常用于檢測(cè)組織中或細(xì)胞表面的抗原 3 免疫酶測(cè)定法 是在固相載體 通常為聚苯乙烯反應(yīng)板 表面進(jìn)行的抗原抗體反應(yīng) 實(shí)驗(yàn)中常用的酶是辣根過氧化物酶 HRP 底物為二苯基聯(lián)苯胺 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA ELISA試驗(yàn)三個(gè)必要的試劑 1 固相的抗原或抗體 免疫吸附劑 2 酶標(biāo)記的抗原或抗體 標(biāo)記物 3 酶作用的底物 顯色劑 底物顯色定性或定量的分析 原理 包被 反應(yīng)加入待測(cè)抗體或抗原和酶標(biāo)抗原或抗體 洗滌使結(jié)合在固相上的抗原抗體復(fù)合物與未結(jié)合的分離 1 2 3 4 基本步驟 五種常見的檢測(cè)方法 1雙抗夾心法 測(cè)定抗原 2測(cè)定抗體的間接法3競(jìng)爭(zhēng)法 測(cè)定抗原 4捕獲包被法測(cè)IgM抗體5ABS ELISA法 適用于測(cè)定二價(jià)或二價(jià)以上的大分子抗原 但不適用于測(cè)定半抗原及低于二價(jià)的小分子單價(jià)抗原 因其不能形成兩位點(diǎn)夾心 1雙抗夾心法測(cè)抗原 2間接法測(cè)抗體 幾種標(biāo)記 檢測(cè)技術(shù)靈敏度的比較 酶標(biāo) 熒光 放免 發(fā)光 靈敏度 mol L 10 1810 1510 1210 9 幾種標(biāo)記 檢測(cè)試劑的有效期比較 酶標(biāo) 熒光 放免 發(fā)光 有效期 月 1815129630 人民幣 人民幣 三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用 三種免疫測(cè)定技術(shù)的成本及費(fèi)用 放免 酶標(biāo) 發(fā)光 A 將Ab吸附在固相載體表面 B 加入酶標(biāo)Ag和待測(cè)Ag 競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合Ab 對(duì)照只加入酶標(biāo)Ag C 加底物 對(duì)照孔與樣品孔底物降解量的差 未知Ag量 3競(jìng)爭(zhēng)法測(cè)定抗原 血清標(biāo)本中的IgM包括針對(duì)抗原的特異性IgM抗體和非特異性的IgM加入特異性抗原試劑 它只與固相上的特異性IgM結(jié)合抗人IgM抗體包被加入血清標(biāo)本加入特異性抗原試劑加入針對(duì)特異性抗原的酶標(biāo)抗體加底物顯色 4捕獲包被法測(cè)IgM抗體 捕獲法 原理 抗人IgM 鏈抗體包被捕獲待測(cè)標(biāo)本中IgM類抗體加入特異性抗原和酶標(biāo)記特異性抗原的抗體底物顯色 ABS為親和素 avidin 生物素 biotin 系統(tǒng) syst