凝集素在生物分子分離提取中的應(yīng)用.doc

植物凝集素最早發(fā)現(xiàn)于1888年，Stillmark在蓖麻(Ricinus communis L)籽萃取物中發(fā)現(xiàn)了一種細(xì)胞凝集因子，它具有凝集紅細(xì)胞的作用。它是一類具有特異糖結(jié)合活性的蛋白，具有一個(gè)或多個(gè)可以與單糖或寡糖特異可逆結(jié)合的非催化結(jié)構(gòu)域。植物凝集素對(duì)真菌的抗生效應(yīng)可能與它特異結(jié)合暴露于真菌細(xì)胞壁表面的糖復(fù)合物并導(dǎo)致真菌細(xì)胞壁及菌體結(jié)構(gòu)形態(tài)改變有關(guān)，凝集素可與真菌表面的葡聚糖、半乳糖、甘露糖等多糖結(jié)合，干擾真菌細(xì)胞壁的合成，影響其細(xì)胞的正常代謝。凝集素（Lectin）是指一種從各種植物，無脊椎動(dòng)物和高等動(dòng)物中提純的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白，因其能凝集紅血球（含血型物質(zhì)），故名凝集素凝集素最大的特點(diǎn)在于它們能識(shí)別糖蛋白和糖肽中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的碳脂化合物決定簇。一種凝集素具有對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力，如刀豆素與D吡喃糖基甘露糖（DMannopyranosy）結(jié)合；麥芽素與N乙酰糖胺（Nacetyl glucosamine）結(jié)合；菜豆凝集素與N乙酰乳糖胺結(jié)合（見本章表61）。 因此，凝集素可以作為一種探針來研究細(xì)胞膜上特定的糖基。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、生物素、酶、膠體金和鐵蛋白等示蹤物結(jié)合，從而在光鏡與/或電鏡水平顯示其結(jié)合部位。凝集素可為熒光素、酶和生物素等所標(biāo)記，分別進(jìn)行下列染色法： 直接法標(biāo)記物直接標(biāo)記在凝集素上，使之直接與切片中的相應(yīng)糖蛋白或糖脂相結(jié)合。 直接法的優(yōu)點(diǎn)是簡便，目前商品用的凝集素藥盒已能購得。但靈敏性不夠高。 間接法將凝集素直接與切片中的相應(yīng)糖基結(jié)合，而將標(biāo)記物結(jié)合在抗凝集素 凝集素受體表達(dá)抗體上間接法較直接法和直接法敏感性高510倍或更多一些，但必須購買或自制抗凝集素抗體。糖凝集素糖法本法是利用過量的凝集素與組織切片中特定的糖基相結(jié)合。經(jīng)沖洗后，凝集素上還存在未被占用的結(jié)合部位，將這些部位與有過氧化物酶標(biāo)記的特異性糖基相結(jié)合，形成一個(gè)三明治樣的糖凝集素糖的結(jié)合物。 本法特異性強(qiáng)，靈敏度高，因?yàn)檫@不象生物素抗生物素法那樣要改變凝集素，又不需要像抗體那樣要制備抗體。方法雖不復(fù)雜（Lee 等1976），但需一定的試劑和設(shè)備。商品化能提供的糖基化過氧化物酶品種尚有限凝集素在動(dòng)、植物體內(nèi)廣泛存在。凝集素最大的特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白和糖脂中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力。因此，凝集素可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的探針。凝集素在無脊椎動(dòng)物血液中具有多種生物活性，可以選擇凝集各種細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞有特異性凝集作用等，是免疫防御的重要體液因子之一。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合、而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作，在探索細(xì)胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過程，顯示腫瘤相關(guān)抗原物質(zhì)，以及對(duì)腫瘤的診斷評(píng)價(jià)等方面均有一定的價(jià)值。此外，植物凝集素在植物體內(nèi)也具有相當(dāng)重要的作用，如在種子萌發(fā)過程中的作用；作為植物胚細(xì)胞的促有絲分裂因子；在作物害蟲防治方面表現(xiàn)出的保護(hù)功能等等。研究凝集素的特異性有助于以分子或原子層次 (Molecular or atomic level) 了解生命現(xiàn)象或病理變化。 物大分子制備的前處理l 2.2.1 生物材料的選擇l l 制備生物大分子，首先要選擇適當(dāng)?shù)纳锊牧稀２牧系膩碓礋o非是動(dòng)物、植物和微生物及其代謝產(chǎn)物。l 選擇的材料應(yīng)含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。l 動(dòng)物組織要先除去結(jié)締組織、脂肪等非活性部分，絞碎后在適當(dāng)?shù)娜軇┲刑崛。绻蟮某煞衷诩?xì)胞內(nèi)，則要先破碎細(xì)胞。l 植物要先去殼、除脂。l 微生物材料要及時(shí)將菌體與發(fā)酵液分開。l 生物材料如暫不提取，應(yīng)冰凍保存。動(dòng)物材料則需深度冷凍保存。 2.2.2 細(xì)胞的破碎ll 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細(xì)胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動(dòng)物臟器的細(xì)胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由于具有較堅(jiān)固的纖維素、半纖維素組成的細(xì)胞壁，要采取專門的細(xì)胞破碎方法。 (1)機(jī)械法：l 1) 研磨：將剪碎的動(dòng)物組織置于研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。l 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細(xì)胞的方法，通常可先用家用食品加工機(jī)將組織打碎，然后再用10000r/min20000r/min的內(nèi)刀式組織搗碎機(jī)(即高速分散器)將組織的細(xì)胞打碎生物大分子的提取ll “提取”是在分離純化之前將經(jīng)過預(yù)處理或破碎的細(xì)胞置于溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，并盡可能保持原來的天然狀態(tài)不丟失生物活性的過程。 影響提取的因素主要有：ll 目的產(chǎn)物在提取的溶劑中溶解度的大小；l 由固相擴(kuò)散到液相的難易；l 溶劑的pH值和提取時(shí)間等。 通常：ll 極性物質(zhì)易溶于極性溶劑，非極性物質(zhì)易溶于非極性溶劑；l 堿性物質(zhì)易溶于酸性溶劑，酸性物質(zhì)易溶于堿性溶劑；l 溫度升高，溶解度加大；l 遠(yuǎn)離等電點(diǎn)的pH值，溶解度增加。 提取時(shí)所選擇的條件應(yīng)有利于目的產(chǎn)物溶解度的增加和保持其生物活性。l生物大分子的分離純化ll 由于生物體的組成成分是如此復(fù)雜，數(shù)千種乃至上萬種生物分子又處于同一體系中，因此不可能有一個(gè)適合于各類分子的固定的分離程序，但多數(shù)分離工作關(guān)鍵部分的基本手段是相同的。l 為了避免盲目性