布魯氏菌病實驗研究及生物安全課件.ppt

布魯氏菌病實驗研究及生物安全ResearchProgressofBrucellosisinChinaandControlandPrevention 中國人間布魯氏菌病疫情1950 2014年 中國人間布魯氏菌病空間分布變化 中國家畜布魯氏菌病疫情 2014年中國布魯氏菌病疫情分布 中國人間布魯氏菌病疫情 2012 2013 2014年布病病例報告分析 Amsterdam TheNetherlandswww kit nl 世界衛(wèi)生組織建議的人布魯氏菌病診斷 世衛(wèi)組織建議的檢測包括 虎紅平板試驗 RBT 血清凝集試驗 SAT Coomb s試驗補體結(jié)合試驗 CFT ELISA熒光偏振布氏菌培養(yǎng)PCR世衛(wèi)組織未具體確定流程 取舍值和檢測特征 診斷靈敏性和特異性 沒有明確的陽性和陰性預(yù)測值 PPV NPV 結(jié)論取舍值 及靈敏性 特異性 因抗原來源和流程差異而不同 有待優(yōu)化PPV和NPV取決于疾病的流行程度 有待確立建議開展檢測前 應(yīng)在設(shè)計適當?shù)沫h(huán)境中確定診斷功效 靈敏性 特異性 PPV和NPV等 WHO人布魯氏菌病的診斷檢測 IgM IgG側(cè)向?qū)游鰴z測熒光偏振檢測虎紅平板試驗血清凝集試驗2 ME試驗IgM IgGELISA庫姆斯 IgG CFT培養(yǎng) 僅在BSL 3中 PCR 簡易 快捷 復(fù)雜 要求高 靈敏性 參考 特異性 參考 保健點 參比實驗室 診斷機構(gòu) Amsterdam TheNetherlandswww kit nl 虎紅平板試驗 檢測特征 流行率低 靈敏度92 9 急性病例 特異性94 3 無暴露史 特異性91 7 重復(fù)暴露 特異性76 9 既往布病患者 Ruis MezaetalClinMicrobiolInfect 2005 11 3 221 5 不同來源 品牌 和批次的抗原質(zhì)量差異很大難以解讀 弱陽性 由于暴露和非特異性反應(yīng) 在疾病流行地區(qū)的表現(xiàn)不良需要確定取舍值結(jié)論診斷功效在很大程度上取決于制劑來源和疾病流行程度 需要確定取舍值 血清凝集檢測 1 401 801 1601 3201 6401 1280 發(fā)現(xiàn)凝集抗體 IgM和IgG 靈敏性隨疾病持續(xù)時間下降頑固性和布病復(fù)發(fā)患者中表現(xiàn)不佳在本地流行地區(qū) 暴露個體中的特異性較低流行地區(qū)的建議取舍值為1 320 提高特異性導(dǎo)致的低靈敏度難以讀取和標準化2 ME檢測可用于確診急性病 IgM的指示性滴度降低2倍或2倍以上 布氏菌可被堿性染料著色 如革蘭染色為陰性 姬姆莎染色呈紅色 布氏菌對染料吸收緩慢 布氏菌革蘭染色 雙相全血培養(yǎng)瓶 已接種 自動培養(yǎng)儀和培養(yǎng)瓶 布氏菌生化鑒定 血平皿布氏菌菌落 布氏瓊脂布魯氏菌菌落 布氏菌產(chǎn)生S2H試驗 BCSP31 PCR 引物和擴增片段 產(chǎn)物223bpPrimer1 B45 TGGCTCGGTTGCCAATATCAA 3 Primer2 B55 CGCGCTTGCCTTTCAGGTCTG 3 檢測BCSP31基因的PCR方法 可以在屬的水平上檢測和鑒定布魯氏菌菌株OIE推薦鑒定布魯氏菌種的方法之一 MDL2000DNALadder1 B melitensis2 B abortus3 B suis4 B ovis5 B neotomae6 B canis M123456 布魯氏菌屬BCSP31 PCR電泳結(jié)果 223bp AMOS PCR鑒定布氏菌種 布魯氏菌DNA多態(tài)性一個原因就是插入序列分布 IS711就是一段插入序列 在數(shù)量和位置上都很保守 一個引物錨定在IS711上 其他不同的引物分別選在與插入基因IS711鄰近的單染色體DNA上 代表種的特異性 通過擴增帶的大小來鑒別種 設(shè)計5條引物的混合反應(yīng)體系 適用于布魯氏菌種間的鑒定方法 可鑒別布氏菌牛種1 2 4型 羊種布魯氏菌 豬種1型和綿羊附睪種 除了共有的178bp以外牛種布魯氏菌1 2 4型擴增條帶為498bp 羊種布魯氏菌擴增片段為731bp 豬種1型擴增條帶為285bp 綿羊附睪種961bp 19株標準菌株AMOS PCR擴增結(jié)果 1 22 DL2000DNALadder2 4 B Melitensis1 35 11 B Abortus1 712 B Abortus913 17 B Suis 1 518 B ovis19 B neotomae20 B canis21 陰性對照 750bp500bp250bp M1234567891011 250bp223bp 布魯氏菌屬種鑒定 1 5AMOS擴增1 c 2 羊13 牛14 豬15 待檢菌株6 10BCSP31 PCR 6 羊17 牛18 豬19 OVIS10 待檢菌株 多重PCR Bruceladder EvaluationofaMultiplexPCRAssay Bruce ladder forMolecularTypingofAllBrucellaSpecies IncludingtheVaccineStrains B abortus B melitensis B suis B cains 布氏菌MLVA分型 中國分離株的基因型分布 生物安全 布氏菌在病原微生物的危害等級劃分 2類屬于高致病性實驗室適用等級分類 BSL 3其中弱毒株或疫苗株可在BSL 2實驗室操作小量標本 初代分離等可以在BSL 2實驗室操作血清學(xué)檢測可以在BSL 1實驗室操作 1 布魯氏菌強毒菌株 疫苗菌株 弱毒菌株均可能造成人體感染 感染所需菌量會有較大差別 2 實驗活動與實驗室級別要求布病血清學(xué)實驗可以在BSL 1實驗室進行未知標本分離菌 少量菌株實驗 弱毒菌株的實驗在BSL 2實驗室進行布氏菌的抗原制備 菌種保存在BSL 3 生物安全 注 a大量活菌操作 實驗操作涉及 大量 病原菌的制備 或易產(chǎn)生氣溶膠的實驗操作 如病原菌離心 凍干等 c樣本檢測 包括樣本的病原菌分離純化 藥物敏感性實驗 生化鑒定 免疫學(xué)實驗 PCR核酸提取 涂片 顯微觀察等初步檢測活動 d非感染性材料的實驗 如不含致病性活菌材料的分子生物學(xué) 免疫學(xué)等實驗 生物安全 病原微生物實驗室感染分析實驗室獲得性感染 laboratory acquiredinfection 由于沒有監(jiān)測 報告系統(tǒng) 數(shù)據(jù)資料不全生物安全包括 實驗室實踐 實驗室設(shè)計 個人防護措施和安全設(shè)備 生物安全 美國一份文件統(tǒng)計實驗室感染43 由細菌 27 由病毒 15 由立克次體布氏菌是最常見的實驗室獲得性感染最多的操作是 動物攻毒試驗 凍干菌種 強毒株的大量抗原制備等 生物安全 感染途徑吸入 皮膚粘膜污染 攝入等吸入感染很多操作可產(chǎn)生氣溶膠 如 感染動物的皮毛 糞便 燒接種環(huán) 抽真空 離心 攪拌 研磨等氣溶膠 5um液滴核會懸浮于空中 皮膚粘膜污染 含病原體的液體濺在眼睛 口鼻粘膜及其他皮膚感染攝入感染 誤食和不洗手吃食物接種感染 當實驗室活動涉及傳染或潛在傳染性生物因子時 應(yīng)進行危害程度評估 危害程度評估應(yīng)至少包括下列內(nèi)容 生物因子的種類 已知的 未知的或未知傳染性的生物材料 來源 傳染性 致病性 傳播途徑 在環(huán)境中的穩(wěn)定性 感染劑量 濃度 動物實驗數(shù)據(jù) 預(yù)防和治療 危害程度評估應(yīng)由適當?shù)挠薪?jīng)驗的專業(yè)人員進行 生物安全的評估 生物安全設(shè)備 生物安全柜吸附墊 在操作臺上放上貼有吸附材料的塑料薄膜 每日更換 可以把操作臺的污染減少到最低程度 柜內(nèi)實驗器材和材料的取出 生物安全實驗室的廢棄的污染性材料 使用過的包裝材料 容器 紙張等廢棄物 都收裝好或者經(jīng)高壓滅菌器滅菌后拿到緩沖區(qū) 實驗中或完畢后 必須從安全柜中取出非滅活的病原體時 應(yīng)裝好放在消毒液槽中 使容器外側(cè)被消毒后取出 消毒液種類因病原體不同而異 生物安全設(shè)備 回收容器 在安全柜內(nèi)配置回收污染物質(zhì)的容器 配置存放污染的玻璃器皿和廢棄物容器 容器中必須配有消毒液 將污染物質(zhì)完全浸沒 這些回收容器至少每天操作完畢后蓋好以防污染 再次使用時需重新清配置消毒液 瓶蓋 安全柜內(nèi)使用的瓶子不用橡膠塞 而用螺旋蓋 開啟時可減少氣溶膠的發(fā)生 消毒火焰 用火焰消毒是經(jīng)典的微生物學(xué)操作方法 但是由于會產(chǎn)生氣溶膠 并顧慮使柜內(nèi)氣流紊亂 盡量不使用 良好的內(nèi)務(wù)行為 應(yīng)指定專人監(jiān)督保持良好內(nèi)務(wù)的行為 工作區(qū)應(yīng)時刻保持整潔有序 禁止在工作場所存放可能導(dǎo)致阻礙和絆倒危險的大量物品 所有用于處理污染性材料的設(shè)備和工作表面在每班工作結(jié)束 有任何漏出或發(fā)生了其他污染時應(yīng)使用適當?shù)脑噭┣鍧嵑拖?對漏出的樣本或培養(yǎng)物應(yīng)在風(fēng)險評估后清除并對涉及區(qū)域去污染 清除時應(yīng)使用有效的安全預(yù)防措施 安全方法和個人防護裝備 良好的內(nèi)務(wù)行為 內(nèi)務(wù)行為改變時應(yīng)報告實驗室負責(zé)人以確保避免發(fā)生無意識的風(fēng)險或危險 實驗室行為 工作習(xí)慣或材料改變可能對內(nèi)務(wù)和 或維護人員有潛在危險時 應(yīng)報告實驗室負責(zé)人 并書面告知內(nèi)務(wù)和維護人員的管理者 應(yīng)制