醫(yī)學(xué)論文-HCV檢測(cè)現(xiàn)狀及新進(jìn)展

醫(yī)學(xué)論文 -HCV 檢測(cè)現(xiàn)狀及新進(jìn)展 【摘要】 丙肝是嚴(yán)重威脅人類健康的傳染病之一，主要通過(guò)血液傳染。我國(guó)平均感染率為 3.2%。北方稍高，約為 4.6%，南方為 2.6% 2.9%，感染人數(shù)估計(jì)有3700 萬(wàn)。受感染的母親傳播給嬰兒的發(fā)生率為 5%?；技毙愿窝缀蠹s有 50% 70%的感染者有轉(zhuǎn)為慢性肝炎的傾向，重者 20 25 年后可轉(zhuǎn)化為肝硬化，肝硬化患者 10 年內(nèi)有大約 30%的發(fā)展為終末期肝病 1-2，并且 HCV 感染與原發(fā)性肝細(xì)胞癌有較密切的關(guān)系。對(duì)于 HCV 感染者，第 3、 5、 7、 10 年的肝癌累積發(fā)生率達(dá)11%、 18.1%、 29%、 45.6% 3。隨著醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)的 迅猛發(fā)展， HCV 檢測(cè)技術(shù)也不斷提高但與檢測(cè)乙型肝炎病毒（ HBV）相比， HCV 的檢測(cè)還有許多難題有待解決。 【關(guān)鍵詞】 HCV 抗 HCV RNA ELISA RT-PCR HCV 檢測(cè)目前存在的主要問(wèn)題有： 1.由于 HCV 抗原結(jié)構(gòu)的特殊性，直接檢測(cè)血清中 HCV 抗原的技術(shù)問(wèn)題還未徹底解決。 2.抗體（抗 HCV）出現(xiàn)時(shí)間晚，從 HCV感染后到抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)的時(shí)間平均為 50 70天，有的患者可延長(zhǎng)至 6 9個(gè)月，檢測(cè)的“窗口期”較長(zhǎng)。 3.病毒基因型復(fù)雜而且容易變異，使基因水平的檢測(cè)質(zhì)量不夠穩(wěn)定。 隨著有關(guān)人員近年來(lái)的不斷努力和相關(guān)科學(xué)的迅猛發(fā)展，已經(jīng)在HCV 檢測(cè)技術(shù)方面有了重要進(jìn)展。 1 第三代抗 HCV 試劑的應(yīng)用 檢測(cè)丙型肝炎病毒抗體（抗 HCV）仍是目前常用手段，這方面的檢測(cè)方法主要是第三代酶免疫測(cè)定法（ EIA）或間接酶免疫法（ ELISA），我國(guó)大多采用ELISA 方法。 ELISA 方法中包被抗原的組成和質(zhì)量是關(guān)鍵因素。第三代 ELISA 試劑比第一、第二代試劑有明顯的改進(jìn)，其包被的抗原為 HCV核心抗原 NS3、 NS4和 NS5。由于第一、第二代試劑的 重組基因多肽抗原中仍有 SOD 多肽，所以都存在抗 SOD造成的假陽(yáng)性。而第三代 HCV 試劑，用中國(guó)北方地區(qū) HCV 全基因序列，根據(jù)文獻(xiàn)開發(fā)的預(yù)測(cè)蛋白理化性質(zhì)及三級(jí)結(jié)構(gòu)和抗原決定簇的位點(diǎn)的序列軟件，完成了HCV 全基因序列的親水性親近性移動(dòng)性分析，已預(yù)測(cè)到 HCV 抗原決定簇的位點(diǎn)。第三代試劑的特異性達(dá)到 99%4?？?HCV 檢測(cè)可成為丙型肝炎病毒早期感染的檢測(cè)指標(biāo) 5。 HCV 感染通常是持續(xù)的終生感染。雖然第三代 HCV 抗體 ELISA 試劑增加了 HCV Ns5 區(qū)表達(dá)的蛋白作為抗原，提高了試劑敏感性 ， HCV 感染的“窗口期”通常還需要平均 40 多天。因此，第三代 ELISA 試劑仍需要提高和改進(jìn)，例如在篩查試驗(yàn)的特異性方面，仍存在假陽(yáng)性結(jié)果。對(duì)強(qiáng)陽(yáng)性或弱陽(yáng)性樣本的檢測(cè)，國(guó)產(chǎn)試劑（主要廠家）的 s/co 值高于進(jìn)口試劑，但是無(wú)論對(duì)陽(yáng)性及陰性樣本檢測(cè)，國(guó)產(chǎn)試劑的 CV 值及特異性均明顯低于進(jìn)口試劑，以致出現(xiàn)更多的假陽(yáng)性結(jié)果。此外，丙肝抗體酶免試劑皆沒(méi)有灰區(qū)的設(shè)定， s/co 比值較低（但大于）的結(jié)果也報(bào)告陽(yáng)性，亦是假陽(yáng)性比較多的原因。 6 2 丙型肝炎病毒抗原檢測(cè)方法的建立 多年來(lái)， 專業(yè)人員一直探索能夠直接檢測(cè) HCV 抗原，以達(dá)到縮短窗口期的目的。但是由于 HCV 抗原的特殊性和相關(guān)抗體制備中存在的困難，使這方面的進(jìn)展受到阻礙。 2.1 HCV 核心抗原檢測(cè) HCV 核心抗原是 HCV 感染者體內(nèi)出現(xiàn)的早期感染指標(biāo)，幾乎與 HCV RNA同時(shí)出現(xiàn)，核心抗原和 HCV RNA 的動(dòng)力學(xué)變化密切相關(guān)。 HCV核心抗原檢測(cè)用雙抗體夾心法定性或定量檢測(cè)血清樣品中的 HCV核心抗原，其基本原理是：以基因工程核心抗原免疫小鼠后獲得的純抗 HCV 核心抗原單克隆抗體作為 固相包被物，用與固相包被物有不同抗原決定簇的抗 -HCV 核心抗原單克隆抗體作為辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記物，與血清中的 HCV 核心抗原反應(yīng)，OPD 顯色后進(jìn)行定性或定量測(cè)定。該方法不受被檢測(cè)樣品中抗 -HCV 的干擾，檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確可靠?？捎糜?HCV 早期急性丙型肝炎診斷，抗 -HCV 陽(yáng)性感染者的病毒血癥分析以及 HCV 感染者治療前后病毒血癥追蹤分析 7。 有報(bào)道， HCV-CAg 檢測(cè)可以較 HCV 抗體檢出時(shí)間提早 23 46d8，且EIA 法較 PCR 法簡(jiǎn)便、快速，現(xiàn)有能力開展 ELISA 檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)室無(wú)需增加特殊設(shè)備， 均可檢測(cè)。其結(jié)果與 RT-PCR 方法的復(fù)合率為 85.71%。因此，在不具備 RNA檢測(cè)條件的實(shí)驗(yàn)室開展 HCV-CAg 檢測(cè)時(shí)很好的篩查方法。有報(bào)道，在對(duì) 180 例抗-HCV 陰性患者的篩查中，檢出 HCV CAg 陽(yáng)性 2 例，表明僅用抗 HCV 檢測(cè)將有可能存在 0.55%感染者漏診的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)手術(shù)前丙肝病毒篩查的病例，它涉及到術(shù)中感染責(zé)任和用血安全等問(wèn)題。丙肝核心抗原檢測(cè)在一定程度上降低了這些風(fēng)險(xiǎn)。因此 ,丙肝核心抗原檢測(cè)可作為 HCV 抗體檢測(cè)的補(bǔ)充試劑。 2.2 HCV 抗原檢測(cè) 十幾年來(lái) ，一些學(xué)者曾經(jīng)試圖建立血清中各種 HCV 抗原的檢測(cè)方法，但由于血液中 HCV 抗原含量太低，用常規(guī)方法無(wú)法檢測(cè)出。近年來(lái)，由于 HCV 單克隆抗體的研究成功，已有國(guó)內(nèi)外學(xué)者發(fā)表了肝組織及人體分泌物中 HCV 抗原檢測(cè)成功的報(bào)導(dǎo)。如果能加強(qiáng)對(duì) HCV 中和抗體 Wv、抗 -HCV-IgM、抗 -HCV 核心抗體的研究 9，進(jìn)一步開發(fā)對(duì)血清及肝組織內(nèi) HCV 抗原的測(cè)定，可能會(huì)在丙肝的實(shí)驗(yàn)診斷方面取得更大進(jìn)展。 3 丙型肝炎病毒 RNA 的檢測(cè) 現(xiàn)在用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（ RT-PCR）檢測(cè)血清中的 HCV RNA。基本原理是首先經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄酶作用，在特異性引物存在下，將 HCV RNA 逆轉(zhuǎn)錄為單鏈的CDNA，再通過(guò) PCR 將 CDNA 擴(kuò)增。定性 PCR 的靈敏度高于定量 PCR。羅氏公司的定性 PCR 的靈敏度為 50KIU/L，定量 PCR 為 600KIU/L；拜爾公司的定性 PCR 的靈敏度為 10KIU/L，其定量 PCR 為 615KIU/L。定性 PCR 檢測(cè)主要用于急性丙型肝炎診斷，而定量 PCR 則用于療效監(jiān)測(cè)。 最新報(bào)導(dǎo)，應(yīng)用轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴(kuò)增系統(tǒng) (TMA)可以將 HCV RNA 的檢出率提高到 5 10Iu/ml 的水平。其原理為 ：目標(biāo)序列在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，以引物為引導(dǎo)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄酶的 RNA 酶 H 活性將雜合鏈上的 RNA 降解以后，合成雙鏈的 DNA，并在 T7 RNA 多聚酶的作用下，轉(zhuǎn)錄出成千上萬(wàn)個(gè)目標(biāo) RNA 序列，這些RNA 又可以作為模板進(jìn)行下一個(gè)循環(huán)，整個(gè)反應(yīng)是一個(gè)自我催化過(guò)程，靈敏度高，反應(yīng)條件簡(jiǎn)單，擴(kuò)增效率高，無(wú)需專門的擴(kuò)增儀器，整個(gè)反應(yīng)在一個(gè)試管中進(jìn)行，減少污染。 參 考 文 獻(xiàn) 1 straderDB,wrightT,ThomasDL,Hepatology,2004,39:1147-1171. 2 周永興 .世界華人消化雜志 ,2004,12:2369-2371. 3 謝立 ,吳曉東 .世界華人消化雜志 ,2005,13:884-886. 4 邢文革 ,鄭懷競(jìng) .中華肝臟病毒雜志， 2004， 12： 170-171. 5 Lunel F、 Villon P、 Payan C， Hepatology， 2002， 36（ pt2）： 353. 6 王國(guó)華、張賀秋、李少波等 .丙型肝炎核心抗原檢測(cè)試劑的研究及初步應(yīng)用J|中國(guó)輸血雜志， 2004， 17（ 5）： 11-14. 7 孟淑芳 ,李秀華 ,尹紅章等 .丙型肝炎病毒抗 原檢