新型抗IgE人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究.doc

新型抗IgE人源化單克隆抗體的結(jié)構(gòu)與功能研究錢衛(wèi)珠 【摘要】：研究目的:I型超敏反應(yīng)又稱過敏反應(yīng),主要由特異性IgE抗體所介導(dǎo),由于IgE處于變態(tài)反應(yīng)炎癥級聯(lián)反應(yīng)的最上游,在變態(tài)反應(yīng)啟動和發(fā)生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。1987年,首次提出應(yīng)用抗IgE抗體治療IgE介導(dǎo)的過敏性疾病,并描述了具有特異性結(jié)合能力的抗IgE單克隆抗體。1993年,Kolbinger等報道了一株鼠源性單抗(MaE11)的人源化過程,該抗體又稱為Omalizumab或Xolair,包括大約5%的鼠源和95%的人源序列。2003年6月,美國FDA批準Xolair上市。上市伊始,2004年在美國的銷售額即達到1.4億美元,顯示出良好的市場前景。然而Xolair抗體與IgE的親和常數(shù)則僅有26nM左右,當抗IgE抗體的治療濃度達到IgE基礎(chǔ)水平的100倍時,才可結(jié)合99%的IgE分子,從而充分抑制IgE分子與FcR相結(jié)合。在過敏性哮喘患者體內(nèi),游離IgE水平可升高數(shù)倍,Xolair抗體的臨床用量需要根據(jù)IgE的基礎(chǔ)水平進行調(diào)整,往往需要數(shù)百毫克才能達到治療效果。因此,Xolair的治療費用十分昂貴,即使在美國也受到醫(yī)療保險的限制,目前僅用于吸入激素無法控制的嚴重病例。國外也有其它醫(yī)藥公司研制了抗IgE的人源化抗體(瑞士Novartis、美國Tanox公司),但由于其臨床療效尚不及Xolair,均于1996年終止了臨床試驗。 本研究利用哺乳動物表達系統(tǒng),制備了含有關(guān)鍵的功能表位的IgE片段(Fc2-4),通過雜交瘤技術(shù)制備新型的高親和力抗IgE單克隆抗體,篩選具有競爭抑制IgE與其受體FcR結(jié)合功能的克隆。為降低鼠源單抗的免疫原性,對篩選獲得的抗體進行人源化改造,比較制備所獲抗體及Xolair與IgE結(jié)合的親和力及體外功能,以期從結(jié)構(gòu)上闡明該抗體的作用機制。通過該課題的研究,以期獲得親和力更高的、可望用于過敏性疾病預(yù)防和治療的新型抗IgE人源化單克隆抗體。 研究方法:本課題采用小鼠雜交瘤技術(shù),利用IgE Fc2-4作為免疫原,免疫獲得具有競爭抑制IgE與FcR結(jié)合功能的鼠源單克隆抗體。為進一步降低單抗的免疫原性,減輕用于人體時的HAMA反應(yīng),提高安全性,我們采用計算機輔助設(shè)計模擬抗體空間構(gòu)象的方法,對鼠源抗體進行了人源化改造,對改造成功的人源化單克隆抗體體外功能進行了詳細分析,并與Omalizumab的體外功能進行比較。我們應(yīng)用噬菌體隨機七肽庫對人源化單克隆抗體的抗原表位進行親和淘選,從而明確抗體識別的表位,通過分析IgE與其高親和力受體FcRI的復(fù)合物結(jié)晶,與抗IgE抗體所識別表位進行比較,從空間結(jié)構(gòu)上解釋和闡明抗IgE人源化單克隆抗體的功能學基礎(chǔ)。 結(jié)果:獲得哺乳動物細胞表達的IgE Fc2-4以及FcRIA,通過雜交瘤技術(shù)篩選獲得具有競爭抑制IgE與FcR結(jié)合的鼠源抗IgE單克隆抗體7A5。利用計算機輔助設(shè)計的手段,改造獲得親和力和特異性均較好的人源化抗IgE體Hu7A5m18。體外功能分析結(jié)果表明:Hu7A5m18可抑制IgE與可溶性及細胞表面FcRI結(jié)合,而對結(jié)合于細胞表面FcRI的IgE則無影響,Hu7A5m18可以抑制IgE與細胞表面FcRI結(jié)合導(dǎo)致的脫顆粒反應(yīng)。Hu7A5m18介導(dǎo)上述體外功能的EC50僅為Omalizumab的1/10左右。SPR技術(shù)檢測M7A5、Hu7A5m18及Omalizumab與IgE的親和力分別為1.9nM、1.7nM和23.8nM,因此Hu7A5m18人源化改造成功,而且該單抗的親和力明顯高于Omalizumab。 我們應(yīng)用噬菌體隨機七肽庫對Hu7A5m18的抗原表位進行親和淘選,通過對陽性噬菌體序列的分析比對,發(fā)現(xiàn)一個非常保守的序列被高度擴增,而這個序列與IgE恒定區(qū)C3片段內(nèi)的391KQR393高度同源。通過分析IgE與其高親和力受體FcRI的復(fù)合物結(jié)晶,發(fā)現(xiàn)IgE恒定區(qū)C3片段內(nèi)的391KQR393序列在空間上臨近IgE高親和力受體FcRI在IgE分子上的結(jié)合位點,從而推論正是由于這種結(jié)合位點上的空間位置,使Hu7A5m18可以通過空間位阻抑制IgE分子同高親和力受體FcRI結(jié)合。我們前期的研究結(jié)果顯示,Omalizumab識別表位定位于IgE-Fc C3的424HLP426,該序列與高親和力IgE受體結(jié)合位點重疊。由于Hu7A5m18識別表位391KQR393在空間上與Omalizumab識別表位424HLP426也臨近,這也正是Hu7A5m18能夠與Omalizumab競爭結(jié)合IgE的結(jié)構(gòu)原因。 結(jié)論:本研究制備的新型抗IgE人源化單克隆抗體,具有更好的親和力以及體外功能,可望解決目前臨床應(yīng)用的IgE抗體活性不高,用量過大的瓶頸,成為過敏性疾病預(yù)防和治療的候選藥物。表位淘選獲得該抗體識別的新的功能性表位391KQR393,由于其與Omalizumab識別表位424HLP426在空間上的接近,因此Hu7A5m18可以更有效的抑制IgE與靶細胞的結(jié)合而導(dǎo)致的脫顆粒反應(yīng),從而減輕過敏反應(yīng)?！娟P(guān)鍵詞】：IgE單克隆抗體表位噬菌體展示肽庫【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2011【分類號】：R392【目錄】：摘要6-8 Abstract8-10 縮略詞表10-12 前言12-16 第一部分 抗IgE 單克隆抗體的制備16-51 一、材料16-17 （一） 細胞株、菌株、實驗動物16 （二） 試劑16-17 （三） 主要儀器設(shè)備17 二、方法17-25 （一） IgE Fc2-4 表達載體的構(gòu)建17-18 （二） IgE Fc 高親和力受體FcRIA 胞外區(qū)表達載體的構(gòu)建18 （三） 蛋白表達、純化和理化性質(zhì)鑒定18-20 （四） 雜交瘤制備20-21 （五） 抗IgE 單克隆抗體的人源化21-25 三、結(jié)果25-48 （一） IgE Fc2-4 及IgE FcRIA 的構(gòu)建、表達及鑒定25-34 （二） 抗IgE Fc 單克隆抗體的制備、純化及鑒定34-36 （三） 抗IgE 鼠源單抗7A5 的人源化改造36-48 四、討論48-51 第二部分 抗IgE 人源化單抗Hu7A5m18 的功能研究51-70 一、材料51-52 （一） 重組蛋白、抗體及細胞系51 （二） 試劑51-52 （三） 主要儀器設(shè)備52 二、方法52-57 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 與可溶性FcRI 的結(jié)合實驗52-54 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 與細胞表面FcRI 的結(jié)合實驗54-55 （三） Hu7A5m18 與結(jié)合于細胞表面FcRI 的IgE 的結(jié)合實驗55-56 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 引起脫顆粒的功能學實驗56-57 三、結(jié)果57-68 （一） Hu7A5m18 抑制IgE 與可溶性FcRI 結(jié)合57-62 （二） Hu7A5m18 抑制IgE 與細胞表面FcRI 結(jié)合62-66 （三） Hu7A5m18 不與結(jié)合于細胞表面FcRI 的IgE 的結(jié)合66-67 （四） Hu7A5m18 抑制IgE 導(dǎo)致的脫顆粒67-68 四、討論68-70 第三部分 抗IgE 人源化單抗Hu7A5m18 的結(jié)構(gòu)研究70-85 一、材料70-72 （一） 菌株、噬菌體隨機文庫及抗體70 （二） 試劑配制70-72 （三） 實驗設(shè)備、器材72 二、方法72-76 （一） 噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18 抗原表位72-76 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鑒定76 三、結(jié)果76-84 （一） 噬菌體隨機肽庫篩選Hu7A5m18 抗原表位76-80 （二） Hu7A5m18 抗原表位的鑒定80-84 四、討論84-85 參考文獻85-89 綜述89-109 參考文獻104-109 在讀期間發(fā)表論文和參加科研工作情況說明109-112 致謝112專家共識：外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應(yīng)用2012-12-21 14:59 來源：愛愛醫(yī)我要評論(熱)導(dǎo)讀中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥，深受患者歡迎，且常被認為能夠治本且不良反應(yīng)少。外用中成藥在濕疹皮炎治療中應(yīng)用非常廣泛，有成功經(jīng)驗，也存在一些爭議。 中醫(yī)中藥作為我國傳統(tǒng)醫(yī)藥，深受患者歡迎，且常被認為能夠治本且不良反應(yīng)少。外用中成藥在濕疹皮炎治療中應(yīng)用非常廣泛，有成功經(jīng)驗，也存在一些爭議。有鑒于此，以中國中西醫(yī)結(jié)合學會皮膚性病專業(yè)委員環(huán)境與職業(yè)性皮膚病學組部分專家為基礎(chǔ)，邀請部分知名中醫(yī)專家參加制定本共識，旨在幫助全國廣大皮膚科醫(yī)生了解我國外用中成藥在濕疹皮炎治療過程中的使用現(xiàn)狀，以便發(fā)現(xiàn)問題、總結(jié)經(jīng)驗，更好地發(fā)揮中醫(yī)藥在濕疹皮炎治療中的作用。 一、外用中成藥的定義和分類 中成藥是指在中醫(yī)藥理論的指導(dǎo)下，以中藥為原料，按規(guī)定的處方和標準制成具有一定規(guī)格的劑型，質(zhì)量穩(wěn)定、可控，經(jīng)國家批準依法生產(chǎn)的成方中藥制劑，可直接用于防治疾病。外用中成藥即專用于外治療法的中成藥。 外用中成藥可分為固體制劑如栓劑、膏劑、膜劑等；半固體劑型如乳膏、軟膏劑、凝膠劑、糊劑等；液體制劑如溶液劑、酒劑、酊劑、洗劑、油劑等；氣體劑型如氣霧劑。 二、中醫(yī)對濕疹皮炎的認識 濕疹皮炎歸屬中醫(yī)的“濕瘡”，其他也有“奶癬”、“旋耳瘡”、“繡球風”、“浸淫瘡”等等多種名稱。中醫(yī)學認為其乃因稟性不耐，風濕熱客于肌膚而成；或因脾失健運或營血不足，濕熱滯留，以致血虛風燥，肌膚失養(yǎng)所致。與現(xiàn)代醫(yī)學提出的遺傳性或獲得性皮膚屏障功能障礙，免疫學紊亂等內(nèi)在病因加上環(huán)境中的物理、化學、生物微生物和社會心理因素等造成的皮膚刺激、過敏、感染等外部因素的綜合作用而致病的理論一致。 三、外用中成藥在濕疹皮炎治療中的應(yīng)用現(xiàn)狀 濕疹皮炎類皮膚病是皮膚科的常見病，由于病因非常復(fù)雜，許多患者不能明確病因，容易復(fù)發(fā)，因此長期維持治療是預(yù)防復(fù)發(fā)的重要手段，也是采用中醫(yī)治療的優(yōu)勢病種之一。國內(nèi)外研究均表明目前濕疹皮炎的預(yù)后較差。2008年李鄰峰等對559例皮炎濕疹的預(yù)后研究表明，3年復(fù)發(fā)率高達85%（1）。國外對慢性手部濕疹的預(yù)后研究也有類似結(jié)果（2）。但是當前治療濕疹的主要外用藥物，糖皮質(zhì)激素的常見不良反應(yīng)使多數(shù)患者，尤其兒童和老年患者不能長期堅持用藥，外用中成藥是否可以代替糖皮質(zhì)激素，改善濕疹預(yù)后值得研究。 外用中成藥在臨床上應(yīng)用很廣，2012年對南京、武漢、濟南三地187位皮膚科主治醫(yī)師以上人員進行的問卷調(diào)查表明：70%的醫(yī)師（西醫(yī)師43%，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)師100%）在日常工作中經(jīng)常開具中成藥。87%的醫(yī)師（西醫(yī)師76%，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合師100%）相信中藥可以有效治療皮炎濕疹。同時也發(fā)現(xiàn)72%的醫(yī)師（西醫(yī)師100%，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合師40%）認為中藥的療效也應(yīng)按照現(xiàn)代醫(yī)學方法進行臨床驗證。有30%的醫(yī)師（西醫(yī)0，中醫(yī)及中西醫(yī)結(jié)合師64%）相信因為中藥是天然藥物，所以一定安全。 四、外用中成藥臨床使用原則 外用中成藥治療濕疹皮炎屬于中醫(yī)外治法，總的原則是對癥治療，同西藥一樣，應(yīng)該針對不同皮損、病期、部位采用不同的外用中成藥。其中止癢，阻斷瘙癢搔抓瘙癢的惡性循環(huán)是關(guān)鍵。療程要足夠。 1常用治療濕疹皮炎的外用中成藥分類：根據(jù)劑型，也可以分為溶液類、洗劑類、軟膏類等。 2. 使用方法：可以單獨使用也可以與西藥聯(lián)合、序貫應(yīng)用。急性期：治宜清熱除濕、收斂止癢。皮損表現(xiàn)為潮紅、紅斑、丘疹、斑丘疹，無滲出者，以清熱止癢類中藥洗劑外涂或濕敷，常用有止癢消炎水、復(fù)方爐甘石洗劑等；皮損表現(xiàn)為丘皰疹、水皰、糜爛，滲出者，以清熱燥濕止癢之溶液劑濕敷或冷濕敷，常用有皮膚康洗液、復(fù)方黃柏液、甘霖洗劑等。亞急性期：治宜除濕收斂、祛風止癢。皮損表現(xiàn)為少量滲出者，以清熱收斂止癢的洗劑外搽或濕敷，常用有舒樂搽劑、兒膚康搽劑。皮損表現(xiàn)為潮紅、鱗屑，無滲出者，以清熱除濕，祛風止癢的洗劑、軟膏先搽后涂，常用有舒樂搽劑、兒膚康搽劑、膚疾洗劑、青鵬軟膏、消炎癬濕藥膏、丹皮酚軟膏、冰黃膚樂軟膏等。慢性期：治宜清熱、活血化瘀，潤膚止癢。皮損表現(xiàn)為皮膚肥厚浸潤，苔蘚樣變者，以清熱、活血化瘀止癢的酊劑、軟膏外用或封包，常用青鵬軟膏、消炎癬濕藥膏、冰黃膚樂軟膏、蜈黛軟膏等；皮損表現(xiàn)為皮膚干燥粗糙、有鱗屑者，以清熱、潤膚止癢的軟膏外涂，常用有青鵬軟膏、冰黃膚樂軟膏、黑豆餾油軟膏等。 3特殊部位用藥：頭面部：有滲出者，常以溶液劑或洗劑濕敷或外搽，常用有皮膚康洗劑、甘霖洗劑等；無滲出者，以丹皮酚軟膏、冰黃膚樂軟膏等外涂。涂藥后，任其暴露，勿包扎；忌用刺激性強的藥物，并注意勿誤涂入口眼部。外陰部：以皮膚康洗液、復(fù)方黃柏液、甘霖洗劑等濕敷、坐??；若皮膚肥厚、瘙癢劇烈者，以羌月軟膏、冰黃膚樂軟膏等外涂。忌用刺激性強的藥物。有些藥物如皮膚康洗液，需稀釋后外用，切忌將原液直接涂抹于患處。肛門部：以百安洗液、甘霖洗劑等坐浴、熏洗，若皮膚干燥、皸裂者，以冰黃膚樂軟膏、除濕止癢軟膏等外涂。手足部：急性、亞急性者，常用皮膚康洗液、除濕止癢洗液、復(fù)方爐甘石洗劑等濕敷、溻漬、浸浴、外搽；慢性肥厚性者，以青鵬軟膏、丹皮酚軟膏、消炎癬濕藥膏等外涂。乳部：糜爛滲出瘙癢者，常用皮膚康洗液、復(fù)方黃柏液等濕敷，若肥厚、皸裂者，可以用消炎癬濕藥膏、冰黃膚樂軟膏、奇正青鵬軟膏、除濕止癢軟膏等外涂。 4使用中成藥注意事項：應(yīng)交待外用藥物的用法、用量、濃度和療程。目前還缺乏外用中成藥療程的相關(guān)研究，但可以參照西藥的方法，在癥狀完全消失后在原皮損處再間斷外用（每周2天）3-6個月，以減少復(fù)發(fā)的可能。要考慮患者的部位、性別、年齡的差異，如頭面、乳房及外陰部位濕疹忌用刺激性強的外用藥物，兒童及老年患者忌用刺激性強的外用藥物。注意勿涂入口眼等粘膜處。應(yīng)注意觀察藥物治療的不良反應(yīng)，及時處置。如某些外用中藥含有冰片等，長期大面積應(yīng)用可能會引起中毒；樟腦、薄荷腦、肉桂醇