實(shí)驗(yàn)室常用幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)胞熒光染色方法小結(jié).ppt

目前實(shí)驗(yàn)室常用幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)步驟和細(xì)胞熒光染色方法小結(jié) 幾種細(xì)胞實(shí)驗(yàn)步驟 EC原代的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 人臍帶縱剖面和直觀圖 實(shí)驗(yàn)操作步驟 將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺(tái)內(nèi) 超凈工作臺(tái)內(nèi)事先UV滅菌 注意 紫外滅菌時(shí)應(yīng)關(guān)閉日光燈 送風(fēng)機(jī) 人員要離開生化間 20分鐘后返回關(guān)閉紫外燈 打開日光燈 風(fēng)機(jī) 5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 打開NS 點(diǎn)燃酒精燈 不建議使用 將酒精棉鋪開在操作臺(tái)中央 方便將所有器械和瓶蓋的擺放 3將半月盤內(nèi)倒入少許無菌NS 取出新鮮臍帶輕輕放入半月盤內(nèi) 用滅菌后的脫脂棉球?qū)⒛殠庵艿难E擦干 將臍帶兩端血跡擦干以便暴露靜脈血管 將圓頭不銹鋼針頭輕緩的插入兩端靜脈血管內(nèi) 并順勢(shì)用止血鉗夾死固定 注意 本實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要戴好橡膠手套 操作前進(jìn)行醫(yī)用酒精擦拭消毒 當(dāng)臍帶過短時(shí) 只要一端插入圓頭針 另一端用止血鉗夾死 用無菌NS 將臍帶靜脈血管內(nèi)的淤血沖洗干凈 直到?jīng)_出的NS 無色為止 接著將血管內(nèi)的空氣抽空 兩端固定 5將 型膠原酶注入臍帶靜脈血管內(nèi) 此步驟操作時(shí) 注意兩端的注射器要來回做活塞運(yùn)動(dòng)以便使血管內(nèi)壁與 型膠原酶充分接觸 注入的 型膠原酶比例為8ml 15cm 注意 一般本步消化時(shí)間為10分鐘左右 型膠原酶的溫度保證在37 左右消化能力最好 特別提醒的是在消化過程中要用手來回揉搓臍帶外壁 有助于內(nèi)皮細(xì)胞的脫落 此細(xì)節(jié)至關(guān)重要 決定了實(shí)驗(yàn)成敗 此細(xì)節(jié)至關(guān)重要 終止消化 將靜脈內(nèi)含有EC細(xì)胞的消化液注入含有小牛血清的離心液里終止消化 兩者比例為1 1 并用離心液沖洗靜脈血管兩次 并將收集的細(xì)胞懸液裝入離心管 封口離心 將離心管放入離心機(jī) 設(shè)定離心速度和時(shí)間 一般1200r min 8分鐘 待離心機(jī)完全停穩(wěn)后 打開 取出離心管 小心取放 避免震動(dòng)幅度過大 倒去上清液 將貼壁細(xì)胞用新鮮的培養(yǎng)基全液吹打垂懸 放入細(xì)胞培養(yǎng)瓶 一般5ml 瓶 937 5 CO2孵箱培養(yǎng) 第二天換液 去除未貼壁細(xì)胞 繼續(xù)培養(yǎng) 待細(xì)胞幾乎鋪滿瓶底時(shí)傳代約為3 4 一傳二 二SMC的原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 SMC細(xì)胞來源 采用方法 組織貼壁法 實(shí)驗(yàn)操作步驟 將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺(tái)內(nèi) 超凈工作臺(tái)內(nèi)事先UV滅菌 注意 紫外滅菌時(shí)應(yīng)關(guān)閉日光燈 送風(fēng)機(jī) 人員要離開生化間 30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈 打開日光燈 風(fēng)機(jī) 5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍取出臍帶 5CM即可 放入半月盤內(nèi) 用滅菌后脫脂棉擦去臍帶周圍血跡注意 個(gè)體差異性大 選取臍帶時(shí)無明顯水腫 淤血 無結(jié)節(jié)現(xiàn)象 觀察臍帶縱面 找到臍帶內(nèi)兩根動(dòng)脈 從中間小心剪一豁口 用組織剪牽拉兩部分 直至分離出動(dòng)脈血管 將剖離的動(dòng)脈轉(zhuǎn)移到一干凈的6孔板內(nèi) 孔內(nèi)加入少許NS 剝離血管外膜 小心用一眼科直鑷夾住血管一端 用另一把彎鑷輕輕向下牽拉血管外壁 直到明顯可見一層狀組織與內(nèi)層組織分離 此時(shí)應(yīng)夾緊該層組織 迅速向下剝離 注意 此步驟最為關(guān)鍵 直接決定細(xì)胞組織的增殖活力7將剩下的血管組織再次轉(zhuǎn)移到另一孔內(nèi) 孔內(nèi)加入少許NS 用彎鑷夾住血管一端輕輕地套在眼科剪前端 漸次將組織依次剪開 用一滅菌脫脂棉輕輕擦拭血管內(nèi)壁 除去血管內(nèi)皮細(xì)胞 8將血管中層再次轉(zhuǎn)移到一孔內(nèi) 孔內(nèi)加入少許培養(yǎng)基 用眼科剪 直 將組織盡數(shù)剪成1mm 1mm的小組織塊 將剪好的組織塊用一彎頭吸管吸出來放進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 小心將培養(yǎng)基吸出來 將組織塊輕輕地均勻的貼在細(xì)胞瓶底 加入新鮮的培養(yǎng)基 小心不要將瓶底的組織塊沖刷掉 將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 5 CO2孵箱培養(yǎng)注意 此時(shí)的細(xì)胞培養(yǎng)瓶是倒置的 第二天翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶時(shí)才使得組織塊浸入培養(yǎng)基里12培養(yǎng)到第六天時(shí)可見組織塊周圍有細(xì)胞攀爬出來 此后兩天便可進(jìn)行初次傳代 三MSC的原代培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備 培養(yǎng)方法 全骨髓培養(yǎng)法和密度梯度離心法實(shí)驗(yàn)步驟1將滅菌后的實(shí)驗(yàn)物品按操作順序擺放在超凈工作臺(tái)內(nèi) 超凈工作臺(tái)內(nèi)事先UV滅菌 注意 紫外滅菌時(shí)應(yīng)關(guān)閉日光燈 送風(fēng)機(jī) 人員要離開生化間 30分鐘后返回關(guān)閉紫外燈 打開日光燈 風(fēng)機(jī) 5分鐘后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)將實(shí)驗(yàn)過程中需要的用到的器械依次擺放在酒精燈周圍 將老鼠引頸處死 放入事先配好的醫(yī)用酒精內(nèi)浸泡15分鐘后 轉(zhuǎn)移到超凈室內(nèi) 用大號(hào)止血鉗夾住鼠尾 用無菌NS 將大鼠身上的酒精沖洗干凈后 放入無菌半月盤內(nèi) 轉(zhuǎn)移至超凈臺(tái)內(nèi) 剪去鼠尾 用第一套器械 小心剝離老鼠四肢表皮 露出肌肉層 用第二套器械 小心剝離老鼠四肢上的肌肉層 露出股骨和脛骨 用第三套器械 小心剝離老鼠的脛骨和股骨注意 此步驟很關(guān)鍵 在分離四肢股骨 脛骨時(shí)要格外小心 最好用眼科剪 不可暴露骨髓腔將股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到小培養(yǎng)皿內(nèi) 里面倒入少許NS 用眼科剪和眼科鑷將骨頭周圍的肌肉組織剝離將剝離后的股骨和脛骨轉(zhuǎn)移到一新的培養(yǎng)皿內(nèi) 小心并迅速用大號(hào)組織剪剪斷骨頭兩端 暴露骨髓腔 不建議使用酒精 此步驟以前各步在保證無菌操作情況下可避免染菌 將剪斷的骨髓 用5ml的注射器吸取無血清培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔 收集骨髓懸液的培養(yǎng)基 在50ml離心管內(nèi)加入Ficoll人淋巴細(xì)胞分離液 將細(xì)胞懸液小心的鋪在分離液上層注意 在操作此步驟時(shí) 要戴好手套 口罩 在Ficoll液面上鋪細(xì)胞時(shí)眼睛要與頁(yè)面平齊小心封口離心管 離心機(jī)內(nèi)離心 設(shè)定為2000r min 30分鐘離心后取出離心管 小心吸取離心管內(nèi)中間白色云霧層 用無血清培養(yǎng)基混勻后再次離心 設(shè)定為1500r min 10分鐘 將離心后的上清液棄除 用新鮮的全培養(yǎng)基垂懸細(xì)胞 裝入細(xì)胞培養(yǎng)瓶15將細(xì)胞培養(yǎng)瓶放入37 5 CO2孵箱培養(yǎng)24小時(shí)后將細(xì)胞瓶?jī)?nèi)的培養(yǎng)基吸出放入新的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi) 讓尚未貼壁的細(xì)胞繼續(xù)貼壁一般在24h后細(xì)胞便可見梭型形 一周后傳代 EPC的原代培養(yǎng)方法同MSC 培養(yǎng)基內(nèi)加入VEGF誘導(dǎo)因子即可SPC的原代培養(yǎng)方法同上 培養(yǎng)基內(nèi)加入PDGF BB誘導(dǎo)因子即可外周血來源的EPC的培養(yǎng)同MSC的操作步驟 11 17 人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)同SMC組織貼壁法 去除動(dòng)脈血管和靜脈血管后組織貼壁即可 八細(xì)胞試驗(yàn)中注意的要點(diǎn) 關(guān)于傳代問題atry配置時(shí)PH 7 4時(shí)效果較好btry使用時(shí)的溫度37度時(shí)效果較好 過低不易消化 導(dǎo)致細(xì)胞死亡ctry消化后離心重新垂懸細(xì)胞活性高 d細(xì)胞傳代時(shí)要充分混勻 上圖為傳代時(shí)沒有充分混勻?qū)е录?xì)胞團(tuán)聚嚴(yán)重 關(guān)于血清問題aEC培養(yǎng)時(shí)血清含量不要高于20 否則老化速度過快bsmc培養(yǎng)時(shí)原代血清含量控制在15 傳代后控制10 左右 可有效控制其老化速度c干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)同SMC 在細(xì)胞旺盛期血清含量可進(jìn)一步下調(diào)至5 關(guān)于染菌問題a常見的多為真菌感染 細(xì)胞瓶?jī)?nèi)可見白色菌絲 一旦出現(xiàn)此種情況 需要立刻丟棄細(xì)胞瓶 孵箱內(nèi)重新進(jìn)行滅菌處理b常見細(xì)菌感染如桿菌球菌支原體等c最近實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)黑膠蟲染菌現(xiàn)象 對(duì)于 黑膠蟲 的處理方法 首先 血清買回來滅活前凍融應(yīng)逐級(jí)凍融 即按照 20 4 完全融化后 再置入水浴中 與室溫一起升高到56度 這樣的目的是避免溫度驟變 導(dǎo)致血清中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性 第二 血清滅活后分裝保存 按照每次用血清的量分裝 盡量減少血清凍融的次數(shù) 分裝時(shí)注意無 第三 細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)血清濃度稍大一些 通常細(xì)胞培養(yǎng)血清濃度為10 15 但如果血清凍融次數(shù)過多 那營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)喪失活性 按15 的濃度配制事實(shí)上達(dá)不到15 的營(yíng)養(yǎng)成分 故培養(yǎng)基配置時(shí)一般用18 20 的血清 4關(guān)于細(xì)胞凍存 a10 的DMSO 40 胎牛血清 50 培養(yǎng)基b4 40分鐘 20 30分鐘 80 24h后液氮罐保存c如果凍存細(xì)胞多要先把凍存液配好放四度冰箱 因?yàn)镈MSO放熱 剛加進(jìn)去和容易損傷細(xì)胞 常溫DMSO對(duì)細(xì)胞毒性也大 d凍存的原則是慢凍快蘇 關(guān)于熒光染色 實(shí)驗(yàn)步驟1細(xì)胞取出固定2h后 也可4 保存多日后一起染色2將孔板內(nèi)固定液 2 5 戊二醛或者4 多聚甲醛 吸出 用PBS清洗3次 每次5分鐘3用triton脫細(xì)胞液 0 1 濃度 包被樣品5分鐘 目的是增加細(xì)胞通透性 后用PBS清洗3次 BSA封閉液封閉 具體看抗體的種屬來選擇包被液 37 4h 也可以4 過夜 抗30um well即可 37 30分鐘取出樣品清洗3次 每次5分鐘 加一次封閉30分鐘加熒光 抗 需避光 30um well37 30分鐘注意 此步驟不用清洗上清液吸干 加DAPI 40ng ml 濃度較好4分鐘即可清洗5次熒光拍照 注 細(xì)胞染色有多重方法 本實(shí)驗(yàn)僅是抗 actin染色實(shí)驗(yàn) 其他染色方法有很多相近之處本