基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù).doc

一、基本概念(一)基因?qū)?或基因轉(zhuǎn)導(dǎo))將外源性基因(或基因組DNA)采用分子生物學(xué)技術(shù)人工地導(dǎo)入細(xì)胞，觀察它在細(xì)胞中的表達(dá)，研究其生物學(xué)特性和功能，這種把基因?qū)爰?xì)胞中的技術(shù)稱為基因轉(zhuǎn)導(dǎo)(gent transfer)或稱基因轉(zhuǎn)移，也簡(jiǎn)稱為導(dǎo)入。是研究基因表達(dá)、結(jié)構(gòu)和功能的重要研究手段。(二)基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的種類：目前基因轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)很多，可根據(jù)研究目的、對(duì)象和實(shí)驗(yàn)條件加以選擇。1、染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)：將染色體(甚至是全套染色體)和分離提取的細(xì)胞核或DNA大分子片斷，可采用細(xì)胞融合或細(xì)胞顯微注射法將染色體或染色體片斷導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)并與受體細(xì)胞(或稱宿主細(xì)胞)發(fā)生DNA整合，研究整合的細(xì)胞特性和功能，這種轉(zhuǎn)導(dǎo)稱為染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)，這項(xiàng)技術(shù)在細(xì)胞融合和單克隆抗體雜交瘤技術(shù)中已介紹，本章從略。2、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)：將已克隆到的目的基因（或基因的DNA片斷或序列），轉(zhuǎn)導(dǎo)入離體細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的方法稱基因轉(zhuǎn)導(dǎo)，它有兩類：一類是將目的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入體外培養(yǎng)的細(xì)胞，另一類是導(dǎo)入從體內(nèi)取出的細(xì)胞中，觀察目的基因在細(xì)胞中表達(dá)，這項(xiàng)技術(shù)稱基因轉(zhuǎn)染(gene transfection)。體外培養(yǎng)的人體細(xì)胞可以是已建立的細(xì)胞系(株)包括二倍體正常細(xì)胞。如同體內(nèi)細(xì)胞，如淋巴細(xì)胞、LAK細(xì)胞、TIL細(xì)胞等，基因?qū)牒笤倩剌旙w內(nèi)，已用于基因治療(gene treatment),另一類是將已克隆化的目的基因?qū)胧芫?，?dǎo)入基因后的受精卵植入子宮，發(fā)育成胚胎和個(gè)體，可在胚胎期和出生后觀察目的基因在整體內(nèi)的表達(dá)，此項(xiàng)技術(shù)稱轉(zhuǎn)基因技術(shù)（transgenic technique）,轉(zhuǎn)基因技術(shù)所產(chǎn)生的動(dòng)物稱轉(zhuǎn)基因動(dòng)物(transgenic animal)。基因轉(zhuǎn)染的方法常用磷酸鈣法、脂質(zhì)體介導(dǎo)法、電擊法(電穿孔技術(shù))、DEAE葡聚糖法、細(xì)胞顯微注射法等，這均屬于物理、化學(xué)方法的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，此法轉(zhuǎn)入至細(xì)胞內(nèi)的基因一般均不與細(xì)胞染色體發(fā)生整合，而是在細(xì)胞質(zhì)呈現(xiàn)暫時(shí)性表達(dá)，但不持久，隨時(shí)間推移而逐漸減弱或消失，為了使目的基因進(jìn)入細(xì)胞后能與細(xì)胞基因組DNA發(fā)生整合、產(chǎn)生永久性的表達(dá)，常用病毒載體將目的基因?qū)爰?xì)胞，并發(fā)生整合，如用逆轉(zhuǎn)錄病毒、皰疹、腺病毒等改建的病毒載體、因此基因細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)可歸納如下： 細(xì)胞融合技術(shù) 染色體轉(zhuǎn)導(dǎo) 染色體轉(zhuǎn)導(dǎo)(顯微注射法)基因細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo) 基因轉(zhuǎn)染 磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質(zhì)體法、 (體細(xì)胞) 顯微注射法、逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒介導(dǎo)法 基因轉(zhuǎn)導(dǎo) 其它 轉(zhuǎn)基因技術(shù) (生殖細(xì)胞)(三)目的基因和受體細(xì)胞選擇1、目的基因的選擇：從基因來說，存在有功能性基因和誘發(fā)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的基因及使癌細(xì)胞發(fā)生逆轉(zhuǎn)分化的抑癌基因，功能性基因表達(dá)時(shí)能產(chǎn)生特定的功能性蛋白，如細(xì)胞因子IFN、IFN、IFN、IL-2IL-18、TNF、CSFS、EPO、TPO等有功能性基因可選用來進(jìn)行基因制藥。另一類是誘發(fā)轉(zhuǎn)化的基因，可誘生細(xì)胞發(fā)生無限制增殖，發(fā)生永生化和惡性化的細(xì)胞轉(zhuǎn)化，因此細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)應(yīng)選用癌基因或原癌基因。還有一類基因可以誘導(dǎo)細(xì)胞分化，使腫瘤細(xì)胞逆轉(zhuǎn)向正常細(xì)胞分化。因此在研究對(duì)腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)分化時(shí)，應(yīng)選用抑癌基因。細(xì)胞培養(yǎng)已成為研究基因、癌基因和抑癌基因表達(dá)的重要手段。2、受體細(xì)胞的選擇：不同的受體細(xì)胞對(duì)導(dǎo)入后基因表達(dá)有很大影響，同樣的目的基因進(jìn)入不同的受體細(xì)胞中表達(dá)能力差異較大，有的為高表達(dá)，有的呈現(xiàn)低水平表達(dá)，有的甚至不能表達(dá)，如-球蛋白基因在導(dǎo)入MEL14(ATCC、HB132)細(xì)胞中能促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生分化，具有高表達(dá)功能，但導(dǎo)入HELA細(xì)胞中卻無表達(dá)，因此受體細(xì)胞的選擇也應(yīng)引起關(guān)注?；?qū)爰?xì)胞后的表達(dá)與受體細(xì)胞性狀、細(xì)胞種類和細(xì)胞來源密切相關(guān)。此外，若目的在于獲取瞬時(shí)表達(dá)效果可采用磷酸鈣沉淀法、電擊法、脂質(zhì)體法等；若目的要獲取永久性穩(wěn)定表達(dá)應(yīng)選用逆轉(zhuǎn)錄病毒等病毒載體導(dǎo)入法。下面介紹幾種常用基因轉(zhuǎn)染方法。二、物理化學(xué)法基因轉(zhuǎn)染技術(shù)(一)磷酸鈣-DNA共沉淀法核酸以磷酸鈣-DNA共沉淀物的形式出現(xiàn)時(shí)，可使DNA附在細(xì)胞表面，利于細(xì)胞吞入攝取，或通過細(xì)胞膜脂相收縮時(shí)裂開的空隙進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)入細(xì)胞的DNA僅有1%5%可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中僅有不到1%的DNA可以與細(xì)胞DNA整合，在細(xì)胞中進(jìn)行穩(wěn)定表達(dá)，基因轉(zhuǎn)導(dǎo)的頻率大約為10-4，這項(xiàng)技術(shù)能用于任何DNA導(dǎo)入哺乳類動(dòng)物進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)或長(zhǎng)期轉(zhuǎn)化的研究。此方法對(duì)于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染是最常用并首選的方法。1、配液(1)2HBS 1.63g NaCl 1.19g Hepes 0.023g Na2PO4、2H2O 加水至100ml pH7.1過濾，4保存(2)2mmol/L CaCl2 過濾除菌(3)TE：0.1mmol/L EDTA 1mmol/L Tris-HCL PH8.0(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H2O至10mL過濾除菌4保存。(5)G418選擇培養(yǎng)基：用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液配制G418，G418濃度為200800mg/L注意：對(duì)受體細(xì)胞先做預(yù)試驗(yàn)，選用濃度為在1014天內(nèi)能殺死細(xì)胞50%以上的最低濃度。2、操作步驟方法一：(1)供體DNA制備：方法按前介紹的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。(2)受體細(xì)胞的培養(yǎng)：研究癌基因轉(zhuǎn)移應(yīng)選擇不含人類Alu序列的動(dòng)物細(xì)胞系作為受體細(xì)胞。如小鼠NIH3T3胚成纖維細(xì)胞系等，該細(xì)胞有一定自發(fā)轉(zhuǎn)化傾向，一般在轉(zhuǎn)染前一天接種細(xì)胞，接種密度為2104/cm2,用含10%胎牛血清的DMEM液，37、5%CO2培養(yǎng)，待細(xì)胞占5070%瓶底面積時(shí)，用于轉(zhuǎn)染試驗(yàn)。(3)DNA-磷酸鈣沉淀物的制備將供體細(xì)胞DNA和PSV2-neo質(zhì)粒載體DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同時(shí)向供體細(xì)胞DNA液200l中加入帶基因neo質(zhì)粒DNA液(20mg/L)220l和2HBS 250l(PSV2-neo為12mg/L的使用量)。取500l上述DNA溶液加入硅化試管中，緩慢加入3.1ml、2mol/L CaCl2混勻30秒。然后立即混旋，室溫下靜置30分鐘，待溶液輕度混濁后，吹打后即用于轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞。(4)轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期已占瓶底5070%的受體細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)更換一次新鮮培養(yǎng)基，每瓶5ml（25ml培養(yǎng)瓶）。吸取0.5mLDNA-磷酸鈣沉淀，加入含5mL培養(yǎng)液的細(xì)胞瓶中搖勻。置37 5% CO2培養(yǎng)24h或更長(zhǎng)，使細(xì)胞充分吸入DNA-磷酸鈣結(jié)晶顆粒。更換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。更換濃度800mg/L的G418選擇培養(yǎng)液進(jìn)行篩選。同時(shí)設(shè)有未能轉(zhuǎn)染的對(duì)照細(xì)胞。培養(yǎng)大約35天，對(duì)照細(xì)胞大部分死亡，這時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞更換濃度為200mg/L的G418選擇培養(yǎng)基，每34天更換一次選擇培養(yǎng)基。2周后對(duì)照細(xì)胞死亡，在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞瓶中可見有抗藥性的細(xì)胞克隆出現(xiàn)，待其增大后再進(jìn)行克隆化和擴(kuò)大培養(yǎng)，可建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株，并做進(jìn)一步鑒定。本實(shí)驗(yàn)要加入PSV2-neo、DNA與外源DNA共轉(zhuǎn)染受體細(xì)胞，這樣可使受體細(xì)胞獲得新霉素(neo)基因的抗藥性，這樣即使癌基因沒有出現(xiàn)明顯的“轉(zhuǎn)化灶”，也可測(cè)出轉(zhuǎn)入的外源性基因的抗neo的標(biāo)記。而且還可利用被neo基因?qū)氲氖荏w細(xì)胞通過G418選擇培養(yǎng)篩選轉(zhuǎn)化的細(xì)胞建立細(xì)胞株。若以獲取“轉(zhuǎn)化灶”為目的，可不加入PSV2-neo DNA只需將從癌細(xì)胞中提取的基因組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞即可，其方法如下：3、基因組DNA轉(zhuǎn)染方法二：(1)配制磷酸轉(zhuǎn)染液 NaCl 8.0g Hepes 5.0g 用時(shí)現(xiàn)配，pH很重要一定要控制在6.950.65 Na2HPO4 0.099g 消毒滅菌 -20貯存?zhèn)溆?加溫水至 1000mL(2)按前面介紹的方法提取癌細(xì)胞基因組DNA。(3)取供體基因組DNA50100g,加3M NaCl或醋酸鈉，使最終濃度至0.3M混勻。(4)再加2倍體積無水乙醇3000r/min離心10分鐘，去上清。(5)加入轉(zhuǎn)染緩沖液，待DNA充分溶解后，再加入2.5MCaCl2,含最終濃度為125mM，用吸管輕輕吹打三次(不用攪拌器以防DNA袢結(jié))，置室溫下1030分鐘，待液體透明度降低，出現(xiàn)微濁蘭色時(shí)，即可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。(6)取生長(zhǎng)狀態(tài)良好處于半?yún)R合階段的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染前4小時(shí)，更換培養(yǎng)液(5ml/瓶)1次。(7)轉(zhuǎn)染：向每瓶中加DNA-磷酸鈣沉淀物0.51mL/瓶，置37作用46小時(shí)。(8)培養(yǎng)：棄去培養(yǎng)液，用15%甘油處理3分鐘，無血清培養(yǎng)漂洗1次，接近匯合時(shí)血清用量降至5%，培養(yǎng)23周。(9)檢測(cè)：逐日觀察，待出現(xiàn)“轉(zhuǎn)化灶”后，克隆分離，擴(kuò)大培養(yǎng)建立轉(zhuǎn)化細(xì)胞株。(二)脂質(zhì)體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染法脂質(zhì)體(lipofectin regeant,LR)試劑是陽(yáng)離子脂質(zhì)體N-1-2，3-Dioleyoxy, Propyl-n, n,n-Trimethylammonium Chloride(DOTMA)和Dioleoyl photidye-thanolamine(DOPE)的混合物1:1(w/w)。它適用于把DNA轉(zhuǎn)染入懸浮或貼壁培養(yǎng)細(xì)胞中，是目前條件下最方便的轉(zhuǎn)染方法之一。轉(zhuǎn)染率高，優(yōu)于磷酸鈣法，比它高5100倍，能把DNA和RNA轉(zhuǎn)染到各種細(xì)胞。用LR進(jìn)行轉(zhuǎn)染時(shí)，首先需優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件，應(yīng)找出該批LR對(duì)轉(zhuǎn)染某一特定細(xì)胞適合的用量、作用時(shí)間等，對(duì)每批LR都要做：第一，先要固定一個(gè)DNA的量和DNA/LR混合物與細(xì)胞相互作用的時(shí)間，DNA可從15g和孵育時(shí)間6小時(shí)開始，按這兩個(gè)參數(shù)繪出相應(yīng)LR需用量的曲線，再選用LR和DNA兩者最佳的劑量，確定出轉(zhuǎn)染時(shí)間(224小時(shí))。因LR對(duì)細(xì)胞有一定的毒性，轉(zhuǎn)染時(shí)間以不超過24小時(shí)為宜。細(xì)胞種類：COS-7、BHK、NIH3T3、Hela和Jurkat等任何一種細(xì)胞均可作為受體細(xì)胞。1、操作步驟方法一：(1)細(xì)胞培養(yǎng)：取6孔培養(yǎng)板(或用35mm培養(yǎng)皿)，向每孔中加入2mL含12105個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)液，37CO2培養(yǎng)至40%60%匯合時(shí)(匯合過分，轉(zhuǎn)染后不利篩選細(xì)胞)。(2)轉(zhuǎn)染液制備：在聚苯乙稀管中制備以下兩液(為轉(zhuǎn)染每一個(gè)孔細(xì)胞所用的量)A液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋1-10g DNA，終量100L，B液：用不含血清培養(yǎng)基稀釋2-50gLR，終量100L,輕輕混合A、B液，室溫中置10-15分鐘，稍后會(huì)出現(xiàn)微濁現(xiàn)象，但并不妨礙轉(zhuǎn)染(如出現(xiàn)沉淀可能因LR或DNA濃度過高所致，應(yīng)酌情減量)。(3)轉(zhuǎn)染準(zhǔn)備：用2mL不含血清培養(yǎng)液漂洗兩次，再加入1mL不含血清培養(yǎng)液。(4)轉(zhuǎn)染：把A/B復(fù)合物緩緩加入培養(yǎng)液中，搖勻，37溫箱置624小時(shí)，吸除無血清轉(zhuǎn)染液，換入正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。(5)其余處理如觀察、篩選、檢測(cè)等與其它轉(zhuǎn)染法相同。注意：轉(zhuǎn)染時(shí)切勿加血清，血清對(duì)轉(zhuǎn)染效率有很大影響。2、快速脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法操作步驟如下方法二：(1)以5105細(xì)胞/孔接種6孔板(或35mm培養(yǎng)皿)培養(yǎng)24小時(shí)，使其達(dá)到5060%板底面積。(2)在試管中配制DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物方法如下：在1mL無血清DMEM中稀釋PSV2-neo質(zhì)粒DNA或供體DNA。旋轉(zhuǎn)1秒鐘，再加入脂質(zhì)體懸液，旋轉(zhuǎn)。室溫下放置510分鐘，使DNA結(jié)合在脂質(zhì)體上。(3)棄去細(xì)胞中的舊液，用1mL無血清DMEM洗細(xì)胞一次后棄去，向每孔中直接加入1mL DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物，37培養(yǎng)35小時(shí)。(4)再于每孔中加入20%FCS的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1424小時(shí)，(5)吸出DMEM/DNA/脂質(zhì)體混合物加入新鮮10%FCS的DMEM，2mL/孔，再培養(yǎng)2448小時(shí)。(6)用細(xì)胞刮或消化法收集細(xì)胞，以備分析鑒定。穩(wěn)定的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染方法如下：(1)接種細(xì)胞同前，細(xì)胞長(zhǎng)至50%板底面積可用于轉(zhuǎn)染。(2)DNA/脂質(zhì)體復(fù)合物制備轉(zhuǎn)染細(xì)胞同前(2)、(3)步驟。(3)在每孔中加入1mL、20%FCS的DMEM，37培養(yǎng)48小時(shí)。(4)吸出DMEM，用G418選擇培養(yǎng)液稀釋細(xì)胞，使細(xì)胞生長(zhǎng)一定時(shí)間，篩選轉(zhuǎn)染克隆，方法參照細(xì)胞克隆篩選法進(jìn)行。(三)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染法DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染，其原理還不清楚，可能是通過內(nèi)吞噬作用而使DNA轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞核，此法只適合暫時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，轉(zhuǎn)染效率與DEAE-葡聚糖濃度以及細(xì)胞與DNA/DEAE-葡聚糖混合液接觸時(shí)間的長(zhǎng)短很有關(guān)系，可采用較高濃度的DEAE-葡聚糖(1g/L)作用較短時(shí)間(30分鐘-1.5小時(shí))，又可用較低濃度(250g/L)的DEAE-葡聚糖作用較長(zhǎng)時(shí)間(8小時(shí))。方法如下：(1)接種鼠L成纖維細(xì)胞濃度為5105CO2/孔/皿生長(zhǎng)23天，當(dāng)達(dá)50%板底面積可用。(2)乙醇沉淀的4g的PSV2-neo質(zhì)粒DNA，空氣干燥后溶于40L的TE中，或取供體DNA。(3)用10ml 1PBS、4mL、10%富合生長(zhǎng)因子血清的DMEM洗板(皿)。(4)在80l熱的10g/L DEAE-葡聚糖中緩慢加入DNA，取120L DNA/DEAE-葡聚糖加到每孔(皿)細(xì)胞中，使其分布均勻輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)直到顯示均勻一致的紅色，培養(yǎng)4小時(shí)。(5)從孔(皿)中吸出DNA/DEAE-葡聚糖，加入5mL 10%DMSD，室溫放置1分鐘，吸出DMSO，用5mL 1PBS洗一次吸出，加入10mL培養(yǎng)液(10%血清的DMEM)。(6)培養(yǎng)細(xì)胞，在適當(dāng)時(shí)間分析細(xì)胞，若含有抗藥基因，可用G418選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)，方法同前。(四)電擊法(Electroporation)1、原理：本法需用特殊設(shè)置(電穿孔儀)，把懸浮狀態(tài)的受體細(xì)胞和供體DNA共同放入皿中(或杯中)，再施以高壓電脈沖，能夠促進(jìn)DNA通過細(xì)胞膜而進(jìn)入胞內(nèi)，并可整合到細(xì)胞的DNA中，使細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化。如轉(zhuǎn)移的DNA為帶有選擇標(biāo)記基因的質(zhì)粒，也可在選擇培養(yǎng)基中進(jìn)行鑒定，方法如下：(1)DNA制備(同前)(2)細(xì)胞：離心收獲對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞5106。(3)漂洗：吸除上清，加4PBS冰浴20分鐘，離心去上清。(4)重懸：于冷4PBS中重懸細(xì)胞，調(diào)成5106/ml PBS。(5)加DNA：加入已被酶切割的DNA 1-10g（原體積75l），裝入電擊小室中，把小室置于電擊器中。(6)電擊準(zhǔn)備：接通電源，調(diào)至2000V和0.9mA極限，將瓦數(shù)和電流標(biāo)度盤調(diào)到5%。(7)電擊：接通安全開關(guān)，使電源橫過電擊室放電，在無菌條件下，把電擊后細(xì)胞轉(zhuǎn)入培養(yǎng)瓶中，續(xù)加10ml培養(yǎng)液，置37CO2培養(yǎng)。(8)培養(yǎng)：如含有標(biāo)記neo基因，可按前述篩選培養(yǎng)法處理。注意：上述電擊參數(shù)僅供參考，與其它方法一樣，因細(xì)胞轉(zhuǎn)染DNA不同，所需電擊條件可能需相應(yīng)改變，因此為獲理想效果，以求得最佳條件。(五)細(xì)胞顯微注射轉(zhuǎn)染法本法是借助顯微注射器直接把DNA注射入核內(nèi)，使之發(fā)生整合入受體細(xì)胞基因組中的技術(shù)。本技術(shù)需要有嚴(yán)密無菌的凈化室，以免敞開操作污染，同時(shí)要能有自動(dòng)拉針儀以制備顯微針，一般用手動(dòng)拉針器拉制時(shí)要能使針末端有一個(gè)0.6cm長(zhǎng)的細(xì)部，太長(zhǎng)易折斷，針尖開口為23m間，針口小于1m更佳，針尖開口大于5m易刺傷細(xì)胞。具體方法如下：(1)注射用DNA制備(同前)。(2)顯微注射針：取顯微注射針數(shù)個(gè)，鏡下挑選最佳者，高壓滅菌后，無菌吸入一定量的DNA，把注射針安裝在顯微針持針器上，調(diào)動(dòng)控制器旋扭，選擇注入DNA壓力參數(shù)。(3)細(xì)胞：取一皿生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，置于顯微針臺(tái)上(能自控調(diào)溫)，敞開皿蓋，調(diào)動(dòng)持針器把顯微針移入培養(yǎng)皿內(nèi)。(4)注射準(zhǔn)備：調(diào)動(dòng)持針器旋扭，把針尖調(diào)至接近細(xì)胞(相差鏡下觀察)使針的長(zhǎng)軸與培養(yǎng)皿平面保持30左右。超過45注射時(shí)，針尖易折斷，小于30時(shí)，針的柄部會(huì)受培養(yǎng)皿邊緣阻擋，靠在皿邊上能有助于限制注射針的活動(dòng)范圍。(5)注射：選健康完整的細(xì)胞(或受精卵)，把注射針尖調(diào)至對(duì)準(zhǔn)細(xì)胞質(zhì)邊緣（如接近中央或超過中央，注射時(shí)細(xì)胞易被針尖穿透），腳踏注射開關(guān)，則一定量的DNA即被注射入細(xì)胞內(nèi)，可立見細(xì)胞微微膨張。說明DNA已被注入，如此反復(fù)注射至所需數(shù)量的細(xì)胞。(6)培養(yǎng)：其培養(yǎng)、觀測(cè)、篩選等方法與其它轉(zhuǎn)染法相同采用此法在大量細(xì)胞群中被注射的細(xì)胞僅為少數(shù)，由于注射損傷，需進(jìn)行修復(fù)，增殖變慢，因此，難以從中克隆出被轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，因此采用neo基因共轉(zhuǎn)染和G418篩選法是可行的或采用標(biāo)記刮除法也可。細(xì)胞顯微注射法除適于注射DNA片斷、寡核苷酸外，也可用于注射蛋白質(zhì)、抗體及各種對(duì)細(xì)胞有影響的藥物。三、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)DNA轉(zhuǎn)染逆轉(zhuǎn)錄病毒載體屬RNA病毒，但可在受染細(xì)胞內(nèi)反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生DNA互補(bǔ)鏈，此DNA單鏈可作為模板合成第二條DNA鏈，第二條DNA鏈可摻入細(xì)胞基因組DNA中。此病毒可利用宿主細(xì)胞的酶自行轉(zhuǎn)錄與復(fù)制，RNA可合成蛋白，再包裝病毒，RNA從胞內(nèi)釋放，成為感染性病毒，該載體可經(jīng)不同方式改變。介導(dǎo)過程可使病毒單拷貝基因組穩(wěn)定地進(jìn)入細(xì)胞。首先，逆轉(zhuǎn)錄病毒的繁殖必須要有適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系，以利于產(chǎn)生高滴度的病毒，同時(shí)還具有適當(dāng)?shù)慕Y(jié)構(gòu)。如：2、(第一代包裝細(xì)胞)，PA317(第二代包裝細(xì)胞) 1-CRIP、PG13、DA、CFA(第三代包裝細(xì)胞)，包裝細(xì)胞可提供逆轉(zhuǎn)錄病毒gag、pol和env蛋白才能使帶有包裝信號(hào)及目的基因的病毒載體RNA進(jìn)行包裝，包裝細(xì)胞只提供gag、pol和env蛋白而不產(chǎn)生具有復(fù)制能力的野生型病毒(RCR)，而第一代包裝細(xì)胞可產(chǎn)生RCR，安全性較差；第二代包裝細(xì)胞，臨床上已廣泛應(yīng)用，也未發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生RCR，安全性好；第三代包裝細(xì)胞更加安全，第三代包裝細(xì)胞中主要區(qū)別是病毒結(jié)構(gòu)基因中env不同。反轉(zhuǎn)錄病毒作為基因轉(zhuǎn)移的載體有如下特點(diǎn)：反轉(zhuǎn)錄病毒感染細(xì)胞的效率高，基因轉(zhuǎn)移率在10%-100%；病毒基因轉(zhuǎn)移能將外源基因整合到宿主細(xì)胞基因組中外源基因能穩(wěn)定存在而不丟失；外源基因整合的拷貝數(shù)一般只有一個(gè)；反轉(zhuǎn)錄病毒只選擇感染分裂細(xì)胞；病毒可容納外源基因的DNA長(zhǎng)度為8Kb。反轉(zhuǎn)錄病毒載體的結(jié)構(gòu)：已切除了病毒的結(jié)構(gòu)基因gag，大部分pol和env，包括兩側(cè)的LTR，被選擇(標(biāo)記)基因和目的基因插入的多聚位點(diǎn)所取代，同時(shí)還帶有包裝信號(hào)。(一)可產(chǎn)生特異性逆轉(zhuǎn)錄病毒細(xì)胞系的建立1、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體進(jìn)入包裝細(xì)胞系概術(shù)：從細(xì)胞質(zhì)粒中產(chǎn)生感染性病毒包括將質(zhì)粒導(dǎo)入包裝細(xì)胞系，可從穩(wěn)定感染細(xì)胞中選擇病毒產(chǎn)生細(xì)胞或用一個(gè)包裝細(xì)胞系暫時(shí)產(chǎn)生的病毒感染另一種有不同包裝的細(xì)胞系，從中選擇病毒的產(chǎn)生細(xì)胞。1.1準(zhǔn)備工作用品：(1)適當(dāng)?shù)陌b細(xì)胞系及培養(yǎng)液(2)大多數(shù)包裝細(xì)胞系為鼠源的，含有鼠“Helpe病毒”，此病毒可幫助被去除某些功能結(jié)構(gòu)基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒復(fù)制，并包裝于蛋白衣殼中。(3)逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA常構(gòu)建成含有抗藥基因neo新霉素基因的載體。(4)Hepes-緩沖液(HeBs)。(5)2mol/L CaCL2。(6)含血清及不含血清培養(yǎng)液。(7)HeBs+15%甘油（HeBs/甘油）。(8)800mg/L(100聚凝胺)(肝素對(duì)抗物)。(9)10%15%DMSO。(10)10cm、6cm培養(yǎng)皿。(11)24孔、6孔培養(yǎng)板。(12)克隆環(huán)。1.2 操作步驟：(1)轉(zhuǎn)染前，10cm培養(yǎng)皿中接種大約10%20%皿底面積的包裝細(xì)胞。(2)將10g含抗藥基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒質(zhì)粒DNA加入0.5mL HeBs中，加入32L 2mol/L CaCL2,輕振動(dòng)，加蓋30分鐘，室溫下培養(yǎng)45分鐘，直到小的、模糊的蘭色沉淀產(chǎn)生。(3)從包裝細(xì)胞中棄去舊液，輕輕滴入HeBs-DNA沉淀于細(xì)胞培養(yǎng)皿中心，使細(xì)胞接觸DNA20分鐘，每10分鐘輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)皿，使溶液均勻，加入10mL培養(yǎng)液，并于37放置4小時(shí)。(4)完全吸出培養(yǎng)液，逐滴加入2.5mL的HeBs/甘油，放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，如果使用的是2/YCRE/YCRIP/PA317包裝細(xì)胞系，需培養(yǎng)3.5分鐘，若為Q2bn包裝細(xì)胞系，需培養(yǎng)1.5分鐘，或根據(jù)不同包裝細(xì)胞選用不同時(shí)間。迅速棄去HeBs/甘油，用10mL培養(yǎng)液洗2次，加入含有血清的5ml培養(yǎng)液培養(yǎng)1824小時(shí)。(5)取出培養(yǎng)液用0.45m過濾，可獲得含有短期產(chǎn)生病毒的培養(yǎng)上清，-70或-80貯存，或立即用于其它包裝細(xì)胞系的感染。(6)加入10ml培養(yǎng)液于上述已感染的細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)23天，繼續(xù)步驟10。(7)另一包裝細(xì)胞受感染前1:10或1:20傳代。(8)倒去包裝細(xì)胞的培養(yǎng)液，加入步驟5獲得的病毒。方法如下：對(duì)于10cm培養(yǎng)皿，將0.1至1.0mL病毒貯存液稀釋至35mL的終體積，加入800mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)1小時(shí)以上。(9)若10cm培養(yǎng)皿加入10mL培養(yǎng)液，6mL培養(yǎng)皿中應(yīng)加入4mL培養(yǎng)液，培養(yǎng)23天。(10)步驟6或步驟9得到的感染細(xì)胞，23天后按1:10或1:20傳代，接種于選擇培養(yǎng)液培養(yǎng)3天，更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)34天，直至克隆出現(xiàn)。(11)用克隆環(huán)挑出分離的克隆，每個(gè)克隆接種24孔板或6孔板中的二個(gè)孔，生長(zhǎng)至5090%底部面積。(12)倒去培養(yǎng)液，換入1倍體積的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)13天，收取培養(yǎng)液，馬上滴定，或者貯存于-70或-80。(13)繼續(xù)傳代克隆細(xì)胞直到能被冷凍或被鑒定，若病毒產(chǎn)生克隆被鑒定，10%15%DMSO保護(hù)劑液氮凍存細(xì)胞。即產(chǎn)生病毒細(xì)胞系建立。2、病毒滴度鑒定在分離產(chǎn)生病毒的克隆后，需進(jìn)行病毒滴度的測(cè)定，常用的方法是用病毒感染目的細(xì)胞，可根據(jù)載體RNA或蛋白的出現(xiàn)粗略定量分析。2.1準(zhǔn)備工作：(1)病毒貯存液（步驟5所得）(2)目的細(xì)胞系(NIH3T3成纖維細(xì)胞)(3)G418或其它選擇性藥物2.2操作步驟：(1)目的細(xì)胞系NIH3T3細(xì)胞在感染前一天按1:10至1:20接種6cm培養(yǎng)皿。(2)感染當(dāng)日，棄去目的細(xì)胞培養(yǎng)舊液，加入含病毒的貯存液(步驟5所得)，用12ml含0.010.1病毒貯存液感染6cm培養(yǎng)皿目的細(xì)胞(或者35ml用于10cm培養(yǎng)皿中的細(xì)胞)，加入800 mg/L聚凝胺至終濃度為8 mg/L，培養(yǎng)13小時(shí)，37。(3)加入培養(yǎng)液，稀釋聚凝胺至2 mg/L，再繼續(xù)培養(yǎng)23個(gè)細(xì)胞周期(NIH3T3細(xì)胞周期為23天)。(4)-a，如果病毒帶有組化標(biāo)記基因，如LacZ,用X-gal染色感染細(xì)胞。按步驟6計(jì)算藍(lán)色克隆的數(shù)量以得到病毒的滴度。(4)-b，如果病毒攜帶抗藥基因，傳代細(xì)胞應(yīng)選擇培養(yǎng)條件。如果抗藥基因?yàn)閚eo，細(xì)胞按1:10至1:20傳代，接種含有G418的兩個(gè)10cm(或6cm)培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。(5)更換培養(yǎng)液(含選擇性G418藥物)共培養(yǎng)7-10天，此時(shí)克隆應(yīng)該非常明顯，計(jì)算克隆數(shù)。(6)滴度計(jì)算公式 G418-RCFU(集落形成單位)/m=克隆數(shù)/病毒體積(mL)復(fù)制因子X接種率若為(4)-a中所敘，病毒攜帶LacZ,用X-gal染色細(xì)胞根據(jù)顯示的克隆數(shù)，計(jì)算病毒的滴度，其公式為： X-gal CFU/mL=X-gal陰性克隆數(shù)/病毒體積(mL)(7)其它方法再鑒定產(chǎn)生病毒的克隆，細(xì)胞所產(chǎn)生的病毒基因無重新排列或缺失。附注：X-gal對(duì)感染細(xì)胞的染色方法（此方法可使該病毒感染細(xì)胞著色，可用于直接測(cè)量病毒滴度）。準(zhǔn)備工作：除以上各種實(shí)驗(yàn)用品外，尚需：帶有LacZ編碼病毒的轉(zhuǎn)染(或感染)的細(xì)胞；固定液：0.05%戊二醛或2%多聚甲醛；Xgal染液。操作步驟：倒去培養(yǎng)液，向感染細(xì)胞的皿中加入固定液(6cm皿加2mL，10cm皿加5mL)，加2%多聚甲醛室溫固定60分鐘，或0.05%戊二醛固定515分鐘。去除固定液，用PBS洗3次，第二次洗滌時(shí)放置10分鐘，首次和末次洗滌時(shí)則快速。加入最小體積的X-gal溶液，蓋住細(xì)胞371小時(shí)或過夜，陽(yáng)性細(xì)胞（病毒感染細(xì)胞）則成蘭色。(二)原代培養(yǎng)正常上皮細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染通過將病毒基因轉(zhuǎn)染到上皮細(xì)胞中，使細(xì)胞可在體外無限生長(zhǎng)，保持正常上皮細(xì)胞的特點(diǎn)。1、準(zhǔn)備工作：(1)產(chǎn)生病毒的細(xì)胞系，方法見上。(2)DMEM培養(yǎng)液+谷氨酰胺 0.02g/mL 胰島素 0.25g/mL 轉(zhuǎn)鐵蛋白 0.12g/mL 葡萄糖 67.5g/mL 10%小牛血清 聚凝胺 1g/mL 氫化考的松 0.02g/mL(3)絲裂霉素C、胰酶、6cm培養(yǎng)皿2、操作步驟：(1)病毒產(chǎn)生細(xì)胞系暴露于絲裂霉素C(4 mg/L)2小時(shí)，洗干凈后，胰酶消化，按5106接種6cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)液為DMEM。(2)待轉(zhuǎn)染的原代培養(yǎng)正常上皮細(xì)胞接種于鋪有以上細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3天。(3)更換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)。(4)取50L培養(yǎng)上清，進(jìn)行病毒滴度檢測(cè)，方法同前，91037104集落形成單位/mL可用于轉(zhuǎn)染。(5)正常上皮原代培養(yǎng)10天后，取貼在飼養(yǎng)層細(xì)胞的上皮細(xì)胞，保留至上皮細(xì)胞數(shù)生長(zhǎng)量足夠選擇。(6)在上皮細(xì)胞生長(zhǎng)24周內(nèi)，成活的克隆用克隆環(huán)挑出，再繼續(xù)使用三輪有限稀釋法建立單個(gè)細(xì)胞系克隆。3、鑒定：按病毒所帶有的抗藥基因進(jìn)行選擇培養(yǎng)篩選，或其它方法鑒定轉(zhuǎn)染細(xì)胞，方法見后。4、注意事項(xiàng)：無論用什么方法將DNA導(dǎo)入細(xì)胞，暫時(shí)或穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染率很大程度取決于細(xì)胞的