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結構基因組學 1 基因組學的基本概念 基因組作圖與測序的原理和方法 重點 2 結構基因組學 1 概念和目的2 基因組作圖遺傳圖譜物理圖譜轉錄圖譜序列圖譜3 基因圖譜 3 概念和目的 以全基因組測序為目標的基因結構研究弄清基因組中全部基因的位置和結構 為基因功能的研究奠定基礎 其目的是建立高分辨的遺傳圖譜 物理圖譜 轉錄圖譜和序列圖譜 一個生物體基因組的最終圖就是它的全部DNA序列 4 結構基因組學主要任務基因組作圖 遺傳圖譜 連鎖圖譜 物理圖譜轉錄圖譜序列圖譜 分子水平的物理圖譜 5 遺傳圖譜 6 遺傳圖譜 連鎖圖譜 概念 指基因或分子標記在染色體上的相對位置與遺傳距離 用厘摩 cM 表示 cM含義 1cM的遺傳距離表示在100個配子中有1個重組子 在哺乳動物中 遺傳圖譜上1cM的距離大約相當于物理圖譜上1000000bp 7 用途 通過該圖譜可分清各基因或分子標記之間的相對距離與方向 如靠近著絲?；蚨肆Ｗ⒁?該圖譜的構建是以位于同一染色體相鄰的2個基因或遺傳標記的重組率為基礎 因而需要有參考家系和分子遺傳標記或基因作為研究基礎 8 一 遺傳圖譜與遺傳標記 遺傳圖譜采用遺傳分析的方法將基因或其他DNA序列標定在染色體上構建連鎖圖 什么是遺傳標記 有可以識別的標記 才能確定目標的方位及彼此之間的相對位置 9 遺傳圖譜 通過遺傳重組所得到的基因線性排列圖稱為遺傳連鎖圖 它是通過計算連鎖的遺傳標記之間的重組頻率 確定它們的相對距離 cM 物理圖譜 是利用限制性內切酶將染色體切成數個片段 根據重疊序列把片段連接成染色體 確定遺傳標記之間物理距離 堿基對 bp 或千堿基 kb 或兆堿基 Mb 的圖譜 10 要構建構建遺傳圖譜 需要尋找基因組不同位置上的特征標記 遺傳標記 包括 1 形態(tài)標記 2 細胞學標記 3 生化標記 4 DNA分子標記 11 二 標記的多態(tài)性 所有的標記都必須具有多態(tài)性花色 白色 紅色身高 高 矮血型 A B O型淀粉 糯 非糯所有多態(tài)性都是基因突變的結果 12 1 形態(tài)標記 形態(tài)性狀 株高 顏色 白化癥等 又稱表型標記控制性狀的其實是基因 所以形態(tài)標記實質上就是基因標記 態(tài)標記的特征 數量少很多突變是致死的受環(huán)境 生育期等因素的影響 13 14 2 細胞學標記 明確顯示遺傳多態(tài)性的染色體結構特征和數量特征 染色體的核型染色體的帶型染色體的結構變異染色體的數目變異優(yōu)點 不受環(huán)境影響缺點 數量少 費力 費時 對生物體的生長發(fā)育不利 15 3 生化標記 又稱蛋白質標記 就是利用蛋白質的多態(tài)性作為遺傳標記 如同工酶優(yōu)點 數量較多 受環(huán)境影響小缺點 受發(fā)育時間的影響 有組織特異性 只反映基因編碼區(qū)的信息 16 夏臘梅同工酶譜照片 17 4 DNA分子標記 簡稱分子標記 以DNA序列的多態(tài)性作為遺傳標記隨著分子生物學的發(fā)展 相繼建立了RFLP TRS SNP等多種分子遺傳標記檢測技術 開創(chuàng)了遺傳標記研究的新階段 優(yōu)點 不受時間和環(huán)境的限制遍布整個基因組 數量無限不影響性狀表達自然存在的變異豐富 多態(tài)性好共顯性 能鑒別純合體和雜合體 18 遺傳作圖的標記 Settheflagsonthegenomes 19 染色體上的基因和DNA順序均可作為路標 路標具有物理屬性 他們由特定的DNA順序組成 路標位于染色體上的位置是固定的 不會更改的 因而提供了作圖的依據 20 三 分子標記類型 RFLP 第一代 限制性片段長度多態(tài)性TRS 第二代 串聯重復序列標記SNP 第三代 單核苷酸多態(tài)性 21 1 RFLP的原理 利用限制性內切酶消化基因組DNA 形成大小不等 數量不同的分子片段 酶切位點的改變 會使得RFLP譜帶表現出不同程度的多態(tài)性 22 PCR RFLP 將PCR產物術用于RFLP分析 即PCR RFLP 該技術先用1對引物特異性擴增基因組的某一高變區(qū) 然后用限制性內切酶消化PCR產物 電泳檢測多態(tài)性 23 PCR RFLP的應用 CCTGAGGAG CCTGTGGAG Mst 酶切位點 Mst 酶切位點消失 24 2 TRS 真核生物基因組中的可變串聯重復序列 variablenumbertandemrepeatedsequence VNTR 有兩類 小衛(wèi)星和微衛(wèi)星 兩者具有高度的變異性 25 VNTR示意圖 123 VNTR變異的原理示意圖 26 DNA指紋圖譜原理 選擇在VNTR特異序列上沒有酶切位點的限制性內切酶將動物總基因組DNA切成不同長度的片段 以VNTR中特異序列作為探針 進行Southern雜交 由于不同個體的串聯重復序列的數目和位置不同 形成的雜交譜帶具有個體的特異性 人們稱為DNA指紋圖譜 27 28 3 小衛(wèi)星DNA 小衛(wèi)星重復單位的核心序列為15 76bp近緣物種和個體間的小衛(wèi)星核心序列有著一定的同源性 在一定的條件下可以相互雜交 29 4 微衛(wèi)星DNA 又稱簡單序列重復 simplesequencerepeat SSR 是高度重復序列 廣泛存在于真核生物基因組 重復單位的核心序列為2 6bp 30 微衛(wèi)星遺傳標記的原理 以微衛(wèi)星DNA標記兩側特異性序列設計專一引物 通過PCR技術擴增微衛(wèi)星片段 擴增產物經變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離 不同個體間因核心序列的重復次數不同而產生DNA多態(tài)性 31 微衛(wèi)星遺傳標記示意圖 PCR擴增 凝膠電泳 32 5 SNP 是指染色體上的某個存在單個堿基的變化 包括單堿基的轉換 顛換 插入及缺失等 33 遺傳圖譜的構建方法 理論基礎 連鎖與交換基本方法 兩點測驗法和三點測驗法 34 四 遺傳圖譜的構建 35 遺傳圖譜構建的步驟 選擇適合作圖的DNA標記 根據遺傳材料之間的DNA多態(tài)性 選擇用于建立作圖群體的親本組合 建立具有合適的分離群體 測定作圖群體中不同個體或株系的標記基因型對標記基因型數據進行連鎖分析 構建標記連鎖圖 36 1 親本的選配首先要考慮親本間的DNA多態(tài)性 選擇親本時應盡量選用純度高的材料 要考慮雜交后代的可育性 37 2 分離群體大小的選擇 一般選用F2代分離群體遺傳圖譜的分辨率和精度 很大程度上取決于群體大小 群體越大 則作圖精度越高 但群體太大 不僅增大實驗工作量 而且增加費用 因此確定合適的群體大小是十分必要的 合適群體大小的確定與作圖的內容有關 從作圖效率考慮 作圖群體所需樣本容量的大小取決于以下兩個方面 是從隨機分離結果可以辨別的最大圖距 是兩個標記間可以檢測到重組的最小圖距 38 3 圖譜構建的理論基礎 基因重組和連鎖理論遺傳圖譜構建的理論基礎是染色體的交換與重組基因的連鎖是位于同一染色體上的基因在遺傳過程中一般傾向于維系在一起基因的重組是通過一對同源染色體的兩個非姊妹染色單體之間的交換來實現的 39 ShC shc 二分體 ShC ShC ShC ShC ShC shc shc shc shc shc shC Shc CSh CSh CSh cSh Csh csh csh csh 四分體 全部親組合占94 3 親組合3 重組合 6 細胞交換 F1 新 新 新 shc shc ShC ShC P1 P2 94 細胞無交換 40 假設某一對同源染色體上存在Sh sh C c兩對連鎖基因 現有兩個親本P1和P2 它們的基因型分別為ShShCC和shshcc 兩親本雜交產生ShshCc雙雜合體 F1在減數分裂過程中應產生4種類型的配子 其中兩種為親型配子ShC和shc 兩種為重組型配子Shc和shC 由于Sh sh和C c位于同一染色體上 要產生重組型配子必須在這兩個基因的連鎖區(qū)段上發(fā)生交換 41 1 遺傳圖譜構建原理 基因連鎖與互換定律遺傳圖譜 基因或標記的排序與遺傳距離 物理圖譜 基因或標記的排序與物理距離 42 4 重組率的計算重組型配子所占的比例取決于減數分裂細胞中發(fā)生交換的頻率 交換頻率越高 則重組型配子的比例越大 重組型配子數重組率 100 總配子數重組率用于估計交換率 但并不完全等于交換率只有發(fā)生奇數次交換 重組率才等于交換率 43 重組型配子最大可能的比例是50 這時在所有減數分裂的細胞中 在兩對基因的連鎖區(qū)段上都發(fā)生交換 相當于這兩對基因間無連鎖 表現為獨立遺傳 重組率的高低取決于交換的頻率 而兩對基因之間的交換頻率取決于它們之間的直線距離 重組率的值變化于完全連鎖時的0 到完全獨立時的50 之間 因此重組率可用來表示基因間的遺傳圖距 圖距單位用厘摩 centi Morgan cM 表示 1cM的大小大致符合1 的重組率 44 5 圖譜制作的統(tǒng)計學原理 一 兩點測驗如果兩個基因于同一染色體上且相距較近 則在分離后代中通常表現為連鎖遺傳 對兩個基因座之間的連鎖關系進行檢測 稱為兩點測驗了解各等位基因分離是否符合孟德爾分離比例 這是連鎖檢驗的前提 在顯性條件下 F2群體中分離比例為3 1 45 二 多點測驗對多個座位進行聯合分析 利用多個座位間的共分離信息來確定它們的排列順序 也就是多點測驗 在一條染色體上 經過多次多點測驗 就能確定出最佳的基因排列順序 并估計出相鄰基因間的遺傳圖距 從而構建出相應的連鎖圖 46 6 構建DNA標記圖譜的計算機軟件許多學者為構建遺傳圖譜設計了專用程序包 通過網址http linkage rockefeller edu soft list html可以獲得各種專用程序的相關信息 應用于植物遺傳連鎖分析和遺傳圖譜構建的常用軟件是MAPMAKER EXP等 MAPMAKER EXP可通過ftp ftp genome wi mit edu distri bution software mapmaker3獲得 該軟件可以應用于各種類型的實驗群體進行遺傳作圖 是目前應用最為廣泛的作圖軟件之一 47 7 DNA標記連鎖圖譜的完善 DNA標記連鎖群的染色體定位把分子標記所建立的連鎖群與經典遺傳圖譜聯系起來 并將其歸屬到相應的染色體上 是構建了一個比較飽和的分子圖譜之后十分重要的工作 通常根據分子標記與已知染色體位置的形態(tài)標記的連鎖關系來確定分子標記連鎖群屬于哪條染色體 48 8 遺傳圖距與物理距離對應關系的估計不同生物的1cM圖距所對應的實際物理距離 堿基對數量 存在很大差異 一般而言 生物越低等或越簡單 1cM圖距平均對應的堿基對數量就越少 49 分子標記實例1遺傳圖繪制 親本基因型 50 遺傳圖繪制 F2基因型分析 51 52 遺傳圖的偏離 大量的細胞遺傳學研究表明 染色體的各個區(qū)段交換頻率有很大的差別 近端粒區(qū)和遠著絲粒區(qū)有較高的重組率 染色體的某些位點之間比其他位點之間有更高的交換頻率 被稱為重組熱點 recombinationhotpoint 性別也能引起重組率的差異 一般而言 由女性減數分裂事件繪制的遺傳圖比男性的要長的多 53 部分連鎖與遺傳作圖 構建遺傳圖譜的基本原理是真核生物遺傳過程中會發(fā)生減數分裂 此過程中染色體要進行重組和交換 這種重組和交換的概率會隨著染色體上任意兩點間相對距離的遠近而發(fā)生相應的變化 根據概率大小 人們就可以推斷出同一條染色體上兩點間的相對距離和位置關系 正因為如此 我們得到的這張圖譜也就只能顯示標記之間的相對距離 我們稱這一距離 概率 為遺傳距離 cM 由此構建的圖譜也稱為遺傳圖譜 54 基因與分子標記的共分離 共分離 如果多態(tài)性在基因組中自由發(fā)生 則有些會在特定基因附近產生 我們可以確定這樣的標記 因為該標記與突變表型密切相關如果比較患病者的和正常人的DNA限制圖譜 可能發(fā)現一個特定的限制性位點通常出現 或者丟失 在患者DNA中 原因是限制性標記與表型間100 相關 它暗示限制性標記與突變基因距離很緊 以至于它們在重組中不能分離 55 物理圖譜 56 物理圖譜 遺傳圖譜所表現的是通過連鎖分析確定的各基因間的相對位置物理圖則表現染色體上每個DNA片段的實際順序 指DNA序列上兩點間的實際距離用于確定各遺傳標記間的物理距離有兩種物理圖譜 1 以已定位的DNA序列標記位點 STS 為位標 以DNA實際長度為圖譜距離的基因組圖譜 2 由YAC和 或細菌人工染色體 BAC 連續(xù)克隆重疊群組成的物理圖譜 57 物理作圖的概念以及簡介 為什么需要物理作圖技術 為什么不能直接從遺傳作圖進入測序階段呢 主要有兩個原因 A 遺傳圖譜分辨率有限 由于人類及其大多數高等真核生物來說 不可能獲得巨大數量的后代 因此可用于研究的減數分裂體就少很多 連鎖分析就受限制 導致標記密度的減小 從而影響遺傳作圖 B 遺傳圖譜精確度有限 1992年 釀酒酵母三號染色體全序列發(fā)表 人們對比遺傳作圖和DNA測序所顯示的標記的實際位置 發(fā)現重組熱點的存在對遺傳作圖的影響 在遺傳圖譜中甚至出現一對基因的順序被顛倒的情況 58 Physicalmapping 為什么要進行物理作圖 遺傳學圖譜分辨率有限遺傳學圖的分辨率依賴于得到的交換的數目 對于人類與大多數真核生物來說 巨大數量的后代不易獲得 遺傳學圖譜精確度有限重組熱點的存在對遺傳作圖的影響 釀酒酵母chr3遺傳圖與物理圖的比較 59 Physicalmapping 結構基因組學的發(fā)展 遺傳作圖物理作圖基因組測序 60 物理作圖的方法 1 限制酶作圖2 克隆作圖3 熒光原位雜交4 序列標簽位點作圖 61 物理作圖的主要環(huán)節(jié) 62 物理作圖的主要方法 限制性作圖 restrictionenzymemapping 克隆作圖 Cloningmapping 熒光原位雜交 fluorescenthybridization FISH 序列標簽位點 STS 作圖 SequenceTaggedSitesmapping 63 限制性作圖定義 將限制性酶切位點標定在DNA分子的相對位置 局限性 只能應用于相對較小的DNA分子 3Physicalmapping 3 2限制酶作圖 64 熒光原位雜交 fluorescentinsituhybridization FISH 65 66 67 68 69 遺傳圖與物理圖的整合 有些標記既是遺傳標記 又是物理標記 如RFLP標記 SSR標記和某些基因序列借助這些標記可以將遺傳圖和物理圖整合起來 70 基因組測序策略 有了高密度的基因組圖譜 就可以開始全基因組測序了測序的技術飛速發(fā)展 現在可以全自動化測序的策略有兩個 鳥槍法克隆重疊群法 71 采集5個自愿者的DNA樣品 構建3種不同插入子大小的基因組文庫2Kb 10Kb和50Kb 完成約2700萬次插入子末端測序 總長14800Mb GeneBank下載104018個BAC末端順序 PFP發(fā)表的公開數據主要為BAC克隆的順序 共4443 3Mb 隨機測序與序列組裝方法和指導測序與序列組裝方法相結合進行序列組裝 72 國際人類基因組測序策略構建BAC克隆 限制性酶處理獲得指紋 根據指紋重疊方法組建BAC克隆重疊群 根據STS標記 將BAC克隆重疊群標定在物理圖上 每個BAC克隆內部采用鳥槍法測序 組裝 將BAC插入順序與BAC克隆指紋極重疊群對比 將已閱讀的順序錨定到物理圖上 73 克隆重疊群法 clonecontig 將基因組DNA切割長度為0 1Mb 1Mb的大片段 克隆到YAC或BAC載體上然后再進行亞克隆 分別測定單個亞克隆的序列再裝配 連接成連續(xù)的DNA分子 這是一種自上而下的測序策略clone by clonemethod 74 3 序列圖譜 分子水平的物理圖譜 以某一染色體上所含的全部堿基順序繪制的圖譜 既包括可轉錄序列 也包括非轉錄序列 是轉錄序列 調節(jié)序列和功能未知序列的總和 測定序列 75 3 基因組測序與序列組裝 基因組計劃的最終目標是獲得所研究的生物的完整的DNA順序 最佳狀況是將物理圖譜和遺傳圖譜進行有機整合 以便于確定基因以及其他重要的序列在DNA順序中的位置 這里主要介紹基因組測序中所采用的技術和策略 主要內容 1 DNA測序的方法2 DNA順序的組裝 76 77 DNA測序的方法 DNA測序技術主要有兩種方法 都是在20世紀70年代中期發(fā)明的 A 鏈終止法 thechainterminationmethod 是通過合成與單鏈DNA互補的多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序 B 化學降解法 chemicaldegradationmethod 是將雙鏈DNA分子用化學試劑處理 產生切口 用同位素標記進行測序 78 DNA順序的組裝 主要有兩種方法將大量短的DNA順序組裝起來 鳥槍法及克隆重疊群法 79 鳥槍法和重疊群法 基因組計劃的基本目標是獲得全基因組順序 在此基礎上再對所獲得的序列進行解讀 獲得基因組順序的主要方法是進行DNA測序 然后再將讀取的順序組裝 目前的DNA測序每次反應僅能讀取不到1000bp的長度 已知最小的細菌基因組為580kb 因此基因組測序的第一步是構建基因組圖 然后將基因組區(qū)段分解逐個測序 最后進行組裝 基因組作圖的基本構想是 在長鏈DNA分子的不同位置尋找特征性的分子標記 根據分子標記將包括這些序列的克隆進行連鎖定位 繪制基因組圖 一旦構建好基因組圖 即可著手進入全基因組測序 以基因組圖指導的測序有2種路線 重疊群法和直接鳥槍法 80 81 什么是鳥槍法 全基因組隨機測序戰(zhàn)略主要采用鳥槍法 shotgun 鳥槍法 也俗稱 霰彈法 是隨機先將整個基因組打碎成小片段進行測序 最終利用計算機根據序列之間的重疊關系進行排序和組裝 并確定它們在基因組中的正確位置 鳥槍法 82 鳥槍法 優(yōu)點 速度快 簡單易行 成本較低 可以在較短的時間內通過集中機器和人力的方法獲得大量的基因片斷 鳥槍法 缺點 最終排序結果的拼接組裝比較困難 尤其在部分重復序列較高的地方難度較大 此外有許多序列片段難以定位在確切的染色體上 成為游離片斷 同時又會有許多地方由于沒有足夠的覆蓋率而形成空缺 這些缺陷最終導致整個基因圖會留下大量的空洞 gap 也影響其準確度 83 84 重疊群法 以大片斷定位的克隆為基礎的定向測序戰(zhàn)略主要采用克隆步移法或稱重疊群法 過程 先構建遺傳圖 再利用幾套高度覆蓋的大片段基因組文庫 BAC PAC等 獲得精細的物理圖 選擇合適的BAC或PAC克隆測序 利用計算機拼裝 BAC內的空洞基本上都可以利用設計引物等手段填補 形成一條完整的BAC序列 然后由相互關聯 部分重疊的BAC克隆連成一個大的重疊群 Contig 理想狀況下 整條染色體就是由一個完整的重疊群構成 85 但通常情況下部分BAC之間會有物理空洞 PhysicalGap 這是目前國際上還未克服的難題 利用克隆步移法測序 國際上通行的標準要求BAC測序達到十倍覆蓋率 使所測的序列達到99 99 以上的