《疫學(xué)原理及檢測(cè)》PPT課件.ppt

免疫學(xué)原理及檢測(cè) 技術(shù)支持部胡賀 主要內(nèi)容 免疫學(xué)基本內(nèi)容血清學(xué)一般特點(diǎn)ELISA方法的技術(shù)根據(jù)ELISA方法的種類影響因素中山生物產(chǎn)品各類產(chǎn)品簡介 免疫學(xué) 一門自然科學(xué) 從研究機(jī)體對(duì)傳染病的抵抗力開始 是微生物學(xué)的一個(gè)分支 但隨著科技的發(fā)展 成為了一門獨(dú)立的學(xué)科 免疫學(xué)反應(yīng) 是抗原與抗體的反應(yīng) 僅在高等脊椎動(dòng)物中存在 這是已知的最精妙復(fù)雜的身體抵御外部物質(zhì)的系統(tǒng) 抗原 Antigen 抗原是指能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生免疫應(yīng)答而生成抗體和致敏淋巴細(xì)胞等免疫應(yīng)答產(chǎn)物 并能與之發(fā)生特異性結(jié)合的物質(zhì) 具有免疫原性和反應(yīng)原性 一般抗原都是外來物 如細(xì)菌 病毒 寄生蟲 大分子蛋白等 抗體 Antibody 機(jī)體受外來抗原物質(zhì)刺激后 產(chǎn)生的一種能與該抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白 Ig 免疫球蛋白分類 Ig通常是指具有抗體活性和 或 抗體樣結(jié)構(gòu)的球蛋白 應(yīng)用免疫電泳與超速離心分析可將Ig分5類 IgG IgA IgM IgD IgE IgG 含量最多或最主要的Ig 75 唯一能夠通過胎盤的Ig 主要由脾臟和淋巴結(jié)中的漿細(xì)胞合成與分泌 IgM 分子量最大 由5個(gè)IgM單體通過J鏈連接 是最早出現(xiàn)的Ig 是抗原刺激后最早出現(xiàn)的抗體 其殺菌 溶菌 溶血 促吞噬以及凝集作用比IgG高500 1000倍 IgG抗體的結(jié)構(gòu)及與抗原的反應(yīng) 血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn) 1 抗原 抗體的結(jié)合具有特異性 但當(dāng)有共同抗原 抗體存在時(shí) 會(huì)出現(xiàn)交叉反應(yīng) 2 抗原 抗體的結(jié)合是分子表面的結(jié)合 這種結(jié)合雖相當(dāng)穩(wěn)定 但是可逆的 3 抗原 抗體的結(jié)合是按一定比例進(jìn)行的 只有比例適當(dāng)時(shí) 才能出現(xiàn)可見反應(yīng) 最適比例示意圖 4 血清學(xué)反應(yīng)大體分為兩個(gè)階段進(jìn)行 但其間無嚴(yán)格界限 第一階段為抗原抗體特異性結(jié)合階段 反應(yīng)速度很快 只需幾秒至幾分鐘反應(yīng)即可完畢 但不出現(xiàn)肉眼可見現(xiàn)象 第二階段為抗原抗體反應(yīng)的可見階段 表現(xiàn)為凝集 沉淀 補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)等 反應(yīng)速度慢 需幾分 幾十分以至更長時(shí)間 血清學(xué)反應(yīng)的一般特點(diǎn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)enzymelinkedimmuno sorbentassayELISA ELISA方法的技術(shù)根據(jù) 抗原或抗體能結(jié)合到固相載體的表面 并保持其免疫活性 抗原或抗體與酶連接所形成的結(jié)合物仍保持免疫學(xué)和酶的活性 在測(cè)定時(shí)待測(cè)血清與固相載體的抗原或抗體結(jié)合 然后再加入酶標(biāo)記的抗原或抗體 形成復(fù)合的結(jié)合物 最后加入底物溶液 與酶反應(yīng)的顏色深淺與標(biāo)本中相應(yīng)抗原或抗體的量成比例 ELISA方法的種類 雙抗體夾心ELISA法示意圖 影響因素 試劑因素標(biāo)本因素 內(nèi)源性 外源性 操作因素 試劑因素 選擇優(yōu)良的檢測(cè)試劑 操作前平衡到室溫不同批號(hào)的試劑不能混用在有效期內(nèi)使用 標(biāo)本因素 外源性干擾 標(biāo)本應(yīng)避免溶血 細(xì)菌的污染 假陽性 抗凝不完全的標(biāo)本 假陽性 建議盡量不用抗凝劑血尤其是肝素抗凝劑 標(biāo)本保留時(shí)間過長 間接法本底值增高 如需保存一周以上 則應(yīng) 20 保存 融解后應(yīng)充分混勻 標(biāo)本間應(yīng)避免交叉污染 不應(yīng)與生化標(biāo)本共用同一管標(biāo)本 不能用NaN3防腐 標(biāo)本因素 內(nèi)源必干擾 類風(fēng)濕因子 假陽性 檢測(cè)抗原時(shí)可用2 巰基乙醇加入到標(biāo)本稀釋液中 使其降解或F ab 2代替完整IgG 補(bǔ)體 假陽性 可用EDTA稀釋標(biāo)本或滅活補(bǔ)體 嗜異性抗體 自身免疫性抗體 交叉反應(yīng)物質(zhì)等 操作時(shí)影響因素 加樣應(yīng)加在孔的下1 3處 注意不可濺出或有氣泡產(chǎn)生 加樣應(yīng)每人一吸頭 防止交叉污染 樣本的稀釋 目的是減少非特異性反應(yīng) 要先加稀釋液再加標(biāo)本并用微量振蕩器混勻30秒 加試劑時(shí)應(yīng)搖勻并棄去第一滴 洗滌應(yīng)徹底 中山生物產(chǎn)品 乙肝兩對(duì)半 缺少e抗原 丙肝梅毒EB病毒登革熱G6PD 乙型肝炎病毒血清標(biāo)志物檢測(cè) 常用ELISA法檢測(cè) 目前HBsAg診斷試劑質(zhì)量較高 靈敏度可達(dá)0 2ng L 從全國室間質(zhì)控評(píng)價(jià)結(jié)果顯示 陽性標(biāo)本率達(dá)到或超過98 HBsAg滴度越高 HBeAg HBVDNA陽性的可能性越大 血液與肝組織的HBsAg含量并不完全相關(guān) HBsAg 為什么血清HBsAg陰性不能排除HBV感染 檢測(cè)試劑不夠敏感 S基因變異 抗原性發(fā)生改變 X基因變異 轉(zhuǎn)錄受抑制 重疊HCV感染 干擾HBsAg合成 如何診斷血清HBsAg陰性的HBV感染 提高檢測(cè)敏感性 采用針對(duì)變異抗原的檢測(cè)試劑 HBVDNA的檢測(cè) 組織中標(biāo)志物的檢測(cè) 陽性就萬無一失了嗎 低滴度應(yīng)注意假陽性單一HBsAb陽性HBVDNA檢出率0 11 8 先后感染了不同的HBV亞型 S基因變異 X基因變異 HBsAb HBsAb陽性HBVDNA陰性并不排除肝細(xì)胞內(nèi)HBV的存在 可出現(xiàn)在HBV感染的恢復(fù)期 此時(shí)HBsAg未消失 HBsAb已產(chǎn)生 大部分歸功于檢測(cè)敏感性的提高 S基因發(fā)生變異 野生株HBsAb不能將其清除 HBsAb陽性者感染了不同亞型HBV或免疫逃避株 HBsAg與HBsAb共存 是重要的免疫耐受因子 大部分情況下其存在表示患者處于高感染低應(yīng)答期 HBeAg與HBVDNA有良好的相關(guān)性 陽性標(biāo)本檢出率90 左右 HBeAg HBeAg與HBeAb HBeAg的存在表示病毒復(fù)制活躍且有較強(qiáng)的傳染性 HBeAg消失而HBeAb產(chǎn)生稱為血清轉(zhuǎn)換 HBeAb陽轉(zhuǎn)后 病毒復(fù)制多處于靜止?fàn)顟B(tài) 傳染性降低 長期HBeAb陽性者并不代表病毒復(fù)制停止或無傳染性 研究顯示20 50 仍可檢測(cè)到HBVDNA 部分可能由于前C區(qū)基因變異 導(dǎo)致不能形成HBeAg HBeAg與HBeAb共存 血清轉(zhuǎn)換過程中 檢測(cè)敏感性提高 野生株與變異株同時(shí)存在 HBcAb 反映肝細(xì)胞受到HBV侵害的一種指標(biāo) 主要包括IgM IgG IgA 抗HBcIgM陽性是最早出現(xiàn)的特異性抗體 是診斷急性乙型肝炎和判斷病毒復(fù)制活躍的指標(biāo) 并提示病人的血液有強(qiáng)傳染性 也見于慢性活動(dòng)性肝炎 抗HBcIgG其陽性滴度高 表明患有乙型肝炎 指正在感染 低滴度為既往感染指標(biāo) 體內(nèi)時(shí)間長 乙型肝炎病毒各項(xiàng)標(biāo)志物檢測(cè)的臨床意義 臨床二對(duì)半檢測(cè)常見模式 建議每個(gè)病人都要進(jìn)行HBVDNA檢測(cè) HBVDNA檢測(cè)的臨床意義 1 診斷方面 HBVDNA是HBV存在最直接的依據(jù) HBVDNA是HBV復(fù)制的標(biāo)志 HBVDNA是患者具有傳染性的標(biāo)志 4 對(duì)HBV M起補(bǔ)充作用 HBeAg HBeAb 乙型肝炎 前C區(qū)變異 HBsAg 乙型肝炎 S區(qū)變異 低水平感染單項(xiàng)抗HBc 乙型肝炎 HBVDNA檢測(cè)的臨床意義 2 療效判斷 HBVDNA是目前判斷乙肝抗病毒藥物療效最敏感的指標(biāo) 3 預(yù)后判斷 HBVDNA水平與病情有一定的關(guān)系 HBVDNA檢測(cè)的臨床意義 調(diào)查表明并不是所有 大三陽 的病人都處于HBV復(fù)制期 具有傳染性 也不是所有 小三陽 的病人HBV都無復(fù)制 因此 要準(zhǔn)確知道HBV是否處于復(fù)制狀態(tài) 最準(zhǔn)確的方法還是通過檢測(cè)HBVDNA來決定 為什么建議每個(gè)病人都要進(jìn)行HBVDNA檢測(cè) HBsAg和HBeAg均陽性而HBVDNA陰性可能的原因 干擾素或拉米夫定等治療后病毒復(fù)制受抑制 PCR所用引物相應(yīng)的DNA序列發(fā)生突變 此引物與突變DNA不能配對(duì)結(jié)合 病毒DNA整合于宿主肝細(xì)胞染色體而血中游離HBVDNA很少或缺乏 丙型肝炎 HCV抗體不是保護(hù)性抗體 是存在HCV感染的標(biāo)志 抗HCVIgM在發(fā)病后即可檢測(cè)到 一般持續(xù)1 3個(gè)月 如果抗HCVIgM持續(xù)陽性 提示病毒持續(xù)復(fù)制 易轉(zhuǎn)為慢性 低滴度抗HCVIgG提示病毒處于靜止?fàn)顟B(tài) 高滴度提示病毒復(fù)制活躍 HCVRNAHCVRNA陽性是病毒感染和復(fù)制的直接標(biāo)志 HCVRNA亦可定量 定量測(cè)定有助于了解病毒復(fù)制程度 抗病毒治療的選擇及療效評(píng)估等 為什么要同時(shí)檢測(cè)抗HCV及HCVRNA 抗病毒治療的要求 防止漏診 有報(bào)道223例丙型肝炎病例中 抗HCV和HCVRNA同時(shí)陽性86例 單純抗HCV陽性118例 單純HCVRNA陽性19例 表明單做其中一項(xiàng)可能導(dǎo)致漏診 艾滋病血清學(xué)檢測(cè) 初篩試驗(yàn) 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) ELISA 用于對(duì)檢測(cè)對(duì)象感染情況的初步篩查 檢測(cè)結(jié)果可能會(huì)有假陽性 不能發(fā)抗體陽性報(bào)告 確認(rèn)試驗(yàn) 免疫印跡法 WesternBlot 確定檢測(cè)對(duì)象是否有HIV抗體 可發(fā)抗體陽性報(bào)告 第一代ELISA試劑 標(biāo)記抗原 全病毒裂解抗原優(yōu)點(diǎn) 靈敏度高 可檢出各種抗體缺點(diǎn) 制備麻煩 成本高 假陽性 1985年 FDA批準(zhǔn)第一個(gè)HIV抗體篩選試劑 第二代ELISA試劑 標(biāo)記抗原 重組或合成多肽抗原優(yōu)點(diǎn) 重組抗原可消除HLA所致的抗體假陽性 生產(chǎn)成本低 不使用HIV病毒顆粒 較為安全 敏感性特異性較高缺點(diǎn) 仍有一定的假陽性 1990年 FDA批準(zhǔn)第一個(gè)重組抗原篩選試劑 第三代ELISA試劑 標(biāo)記抗原 重組或合成多肽優(yōu)點(diǎn) 可檢測(cè)所有不同種類的抗體 增加了試劑的敏感性和特異性 1994年發(fā)展了雙抗原夾心法 酶標(biāo)物由抗人IgG改變?yōu)樘禺愋訦IV抗原 第四代ELISA試劑 標(biāo)記物 重組或多肽抗原 重組抗體優(yōu)點(diǎn) 同時(shí)檢測(cè)HIV抗原抗體 縮短窗口期注意 抗原檢測(cè)敏感性低于單獨(dú)抗原試劑 20 100pg ml 3 5 10pg ml 1998年第四代試劑首次上市 快速檢測(cè)試驗(yàn) 特點(diǎn) 1 操作簡便 快速 2 普通室溫下可以完成 無需特殊儀器 3 判讀受主觀因素影響 適用范圍 野外 緊急情況 HIV 窗口期 ELISA法檢測(cè)假陽性的原因 由于儀器或加樣頭造成的交叉污染潮濕或試劑滴漏底物被金屬離子污染洗板不充分讀取錯(cuò)誤生物因素 抗體初篩試驗(yàn)的局限性 陽性結(jié)果不能確認(rèn) 需用其他試劑復(fù)查 陰性結(jié)果不能排除HIV感染 在感染早期 血清陽轉(zhuǎn)前存在 窗口期 在感染晚期 某些抗體可能檢測(cè)不到 如p24抗體 反應(yīng)中抗體過量 抗原抗體比例不合適而不能形成特定結(jié)構(gòu) 出現(xiàn)凝集抑制 不能診斷 18月齡嬰兒的母嬰垂直感染 新出現(xiàn)的亞群難以檢測(cè) 梅毒 syphilis 由梅毒螺旋體引起的慢性全身性疾病梅毒螺旋體每30 33小時(shí)繁殖一次 為厭氧微生物 在體外很容易死亡梅毒分為三期 一期和二期梅毒病程在2年以內(nèi)稱為早期梅毒 三期梅毒病程已超過2年稱為晚期梅毒傳播途徑 主要為性行為傳播 少數(shù)通過間接感染或血液 起源及流行情況 15世紀(jì)末 梅毒起源并廣泛流行于歐洲 通過商業(yè)往來 也進(jìn)入了我國 于1505年在廣東省首先發(fā)現(xiàn)梅毒病例 此后 梅毒便從沿海到內(nèi)地在我國廣泛傳播開來 發(fā)病率居高不下 居性病之首 解放后 黨和政府有效地取締了妓院 對(duì)性病進(jìn)行廣泛的普查普治 經(jīng)過十年的努力 已于1959年基本上消滅了梅毒 1964年我國向全世界宣布基本消滅了性病 這一舉動(dòng)震驚了世界 轟動(dòng)了全國 世界各國積極防治 在美國 澳大利亞 加拿大以及歐洲發(fā)達(dá)國家等 已經(jīng)將梅毒的預(yù)防和治療納入到公共衛(wèi)生的范疇在全球?qū)哟紊?已經(jīng)提出了消滅胎傳梅毒的全球行動(dòng)策略在我國 目前已經(jīng)開始制定全國梅毒控制規(guī)劃 梅毒檢測(cè)方法 病原體檢查 硬下疳部位的分泌物見到螺旋體梅毒血清學(xué)檢查常規(guī)篩查方法 非梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn) 性病研究實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn) 不加熱血清反應(yīng)素玻片試驗(yàn) 若篩查陽性 應(yīng)做梅毒螺旋體抗原血清試驗(yàn) 熒光密螺旋體抗體吸收試驗(yàn) 梅毒螺旋體血凝試驗(yàn) 測(cè)定血清特異性抗體 現(xiàn)在通常是用梅毒血清學(xué)的檢測(cè)來加以診斷 目前各大醫(yī)院比較常用的是RPR 快速血漿反應(yīng)素環(huán)狀卡片試驗(yàn) 和TPHA 梅毒螺旋體血球凝集試驗(yàn) ELISA檢測(cè)梅毒螺旋體抗體試劑盒則主要應(yīng)用于大規(guī)模梅毒篩查 如血篩 流行病篩查等 EBV 鼻咽癌 NPC 鼻咽癌簡介 鼻咽癌又稱廣東癌 高發(fā)于我國廣東廣西及東南亞 我國3 5歲兒童90 以上已感染EB病毒 華南地區(qū)人群的感染率接近100 早期無明顯癥狀 不易發(fā)現(xiàn) 是我國死亡率最高的10大惡性腫瘤之一 主要受遺傳因素 EB Epstein Barr 病毒感染以及某些環(huán)境因素相互影響而形成 微生物學(xué)檢查 EBV分離培養(yǎng)較困難 一般用血清學(xué)方法做輔助診斷 1 EBV特異性抗體檢測(cè) 對(duì)鼻咽癌早期診斷有很大幫助 2 異嗜性抗體檢測(cè) 主要用于診斷傳染性單核細(xì)胞增多癥 EBV核酸檢測(cè) 原位核酸雜交或PCR G6PD 6 磷酸葡萄糖脫氫酶 蠶豆病 是一種遺傳性酶缺乏病 我國高發(fā)區(qū) 南高北低 主要分布在長江以南各省 以海南廣東廣西云南貴州四川等省為高 病因是由于G6PD基因突變 導(dǎo)致該酶活性降低紅細(xì)胞不能抵抗氧化損傷而遭受迫壞 引起溶血性貧血 臨床表現(xiàn) G6PD缺乏癥的臨床表現(xiàn)與一般溶血性貧血大致相同 分新生兒黃疸 蠶豆病 藥物性溶血 感染性溶血 非球形細(xì)胞溶血性貧血等臨床類型 因G6PD缺乏誘發(fā)的嚴(yán)重的急性溶血性貧血因紅細(xì)胞破壞過多 如不及時(shí)處理 可引起肝 腎 或心功能衰竭 甚至死亡 G6PD缺乏癥又是新生兒病理性黃疸的主要原因 據(jù)中山醫(yī)大的一項(xiàng)統(tǒng)計(jì)表明 患G6PD缺乏癥的新生兒中 約50 的患兒會(huì)出現(xiàn)新生兒黃疸 其中約12 可發(fā)展為核黃疸 導(dǎo)致腦部損害 引起智力低下 遺傳方式 G6PD缺乏癥屬X連鎖不完全顯性遺傳 酶缺乏的表現(xiàn)度不一 一些女性雜合子酶活性可能正常 男性患者多于女性 是否有必要做產(chǎn)前篩查 G6PD缺乏癥不是產(chǎn)前診斷的嚴(yán)格指征 因?yàn)橐恍┗颊咴跓o誘因不發(fā)病時(shí)與正常人一樣 危害不大 但一旦發(fā)病 又屬于嚴(yán)重遺傳病之列 臨床醫(yī)生應(yīng)酌情掌握 關(guān)鍵是要將篩查工作做好 使患者本人明白自己帶有該基因 婚后預(yù)測(cè)胎兒患病風(fēng)險(xiǎn) 做好防治工作 檢查方法 原理 比色法 試劑盒的組成 6 磷酸葡萄糖酸 6PG 6 磷酸葡萄糖 G6P 硝基四氮唑藍(lán) NBT 吩嗪硫酸甲酯 PMS 尿素適用范圍 適用于人體全血標(biāo)本中6 磷酸葡萄糖脫氫酶的檢測(cè) 比色基本原理 以可見光作光源 比較溶液顏色深淺度以測(cè)定所含有色物質(zhì)濃度的方法 以生成有色