MTT法檢測細胞活力講解.ppt

MTT法檢測細胞活力 甘肅中醫(yī)藥大學(xué) MTT法目的和意義 檢測細胞存活和生長情況用于評價藥物產(chǎn)生的細胞毒作用 原理 四唑鹽 噻唑藍 是一種能接受氫原子的染料 簡稱MTT活細胞的線粒體中的琥珀脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結(jié)晶物并沉積在細胞中 而死細胞無此功能 二甲基亞砜 DMSO 能溶解細胞中的紫藍色結(jié)晶物 用酶聯(lián)免疫檢測儀在490nm波長處測定其光吸收值 可間接反映活細胞數(shù)量 從而反映細胞的增殖情況 在一定細胞數(shù)范圍內(nèi) MTT結(jié)晶物形成的量與活細胞數(shù)成正比 活細胞 MTT 琥珀酸脫氫酶 紫藍色結(jié)晶物Formazan 貼壁細胞操作步驟 1 接種細胞 用0 25 胰蛋白酶消化單層培養(yǎng)細胞 用含血清的培養(yǎng)液配成單個細胞懸液 以每孔2000 3000個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中 每孔體積90ul 邊緣孔用PBS或空白培養(yǎng)基填充 2 培養(yǎng)細胞 將培養(yǎng)板移入CO2孵箱中 在37 5 CO2及飽和濕度條件下培養(yǎng) 至細胞單層鋪滿孔底 96孔平底板 大約12h 加入濃度梯度的藥物 原則上 細胞貼壁后即可加藥 每孔加藥10ul 一般設(shè)5個復(fù)孔 3 5 CO2 37 孵育分別孵育24小時后 倒置顯微鏡下觀察 4 每孔加入10ulMTT溶液 5mg ml 即0 5 MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4h 若藥物與MTT能夠反應(yīng) 可先離心后棄去培養(yǎng)液 小心用PBS沖2 3遍后 再加入含MTT的培養(yǎng)液 5 終止培養(yǎng) 小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液 6 每孔加入100ul二甲基亞砜 置搖床上低速振蕩10min 使結(jié)晶物充分溶解 在酶聯(lián)免疫檢測儀OD490nm處測量各孔的吸光值 7 同時設(shè)置調(diào)零孔 培養(yǎng)基 MTT 二甲基亞砜 對照孔 細胞 培養(yǎng)液 MTT 二甲基亞砜 懸浮細胞操作步驟 1 將細胞離心收集后 調(diào)節(jié)細胞懸液濃度大約1 104 ml 每孔先加細胞懸液90ul 相應(yīng)梯度的藥物每孔10ul 共100ul加入到96孔板 邊緣孔用PBS填充 每板設(shè)對照 同時設(shè)置調(diào)零孔 培養(yǎng)基 MTT 二甲基亞砜 對照孔 細胞 培養(yǎng)液 MTT 二甲基亞砜 每組設(shè)5個復(fù)孔 2 置37 5 CO2孵育24小時 倒置顯微鏡下觀察 3 每孔加入10ulMTT溶液 5mg ml 即0 5 MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4h4 每孔加三聯(lián)裂解液 10gSDS 異丁醇5ml 10MHCl0 1ml用雙蒸水溶解配成100ml 過夜 第二天早晨置搖床上低速振蕩10min 使結(jié)晶物充分溶解 在酶聯(lián)免疫檢測儀OD570nm測量各孔的吸光值 藥物的配制 濃度體積過濾 MTT的配制 MTT一般最好現(xiàn)用現(xiàn)配 過濾后4 C避光保存兩周內(nèi)有效 或配制成5mg ml保存在 20度長期保存 避免反復(fù)凍融 最好小劑量分裝 用避光袋或是黑紙 錫箔紙包住避光以免分解 尤其當(dāng)MTT變?yōu)榛揖G色時就絕對不能再用了 MTT有致癌性 用的時候小心 有條件最好帶那種透明的簿膜手套 配成的MTT需要無菌 MTT對菌很敏感 往96孔板加時不避光也沒有關(guān)系 因為時間較短 實驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)值以x s表示 應(yīng)用SPSS軟件進行方差分析 p 0 05時為相差顯著 p 0 01時為相差非常顯著 可以以時間為橫軸 光吸收值為縱軸繪制細胞生線曲線 專門公式求IC50 半數(shù)抑制濃度 或計算抑制率 OD對照組 OD實驗組抑制率 OD對照組 100 實驗結(jié)果統(tǒng)計學(xué)處理 公式如下 lgIC50 Xm I P 3 Pm Pn 4 Xm lg最大劑量I lg 最大劑量 相臨劑量 P 陽性反應(yīng)率之和Pm 最大陽性反應(yīng)率Pn 最小陽性反應(yīng)率 舉例 藥物濃度0 1 0 01 0 001 0 0001 0 00001 0 000001umol l 稀釋倍數(shù)為10 最大濃度為0 1 抑制率為0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 代入計算公式 Pm 0 95Pn 0 06P 0 95 0 80 0 65 0 43 0 21 0 06 3 1Xm lg0 1 1lgI lg0 1 0 01 1lgIC50 1 1 3 1 3 0 95 0 06 4 3 6025IC50 0 00025 注意事項 1 選擇適當(dāng)?shù)募毎臃N濃度 在進行MTT試驗前 對每一種細胞都應(yīng)測其貼壁率 倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線 然后確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間 2 設(shè)空白對照 與試驗平行設(shè)不加細胞只加培養(yǎng)液的空白對照孔 最后比色時 以空白孔調(diào)零 實驗前應(yīng)明確的問題 1 選擇適當(dāng)?shù)募毎臃N濃度 一般情況下 96孔培養(yǎng)板的一內(nèi)貼壁細胞長滿時約有105個細胞 但由于不同細胞貼壁后面積差異很大 因此 在進行MTT試驗前 要進行預(yù)實驗檢測其貼壁率 倍增時間以及不同接種細胞數(shù)條件下的生長曲線 確定試驗中每孔的接種細胞數(shù)和培養(yǎng)時間 以保證培養(yǎng)終止致細胞過滿 這樣 才能保證MTT結(jié)晶形成酌量與細胞數(shù)呈的線性關(guān)系 否則細胞數(shù)太多敏感性降低 太少觀察不到差異 2 藥物濃度的設(shè)定 一定要多看文獻 參考別人的結(jié)果再定個比較大的范圍先初篩 根據(jù)自己初篩的結(jié)果縮小濃度和時間范圍再細篩 切記 否則 可能你用的時間和濃度根本不是藥物的有效濃度和時間 3 時間點的設(shè)定 在不同時間點的測定OD值 輸入excel表 最后得到不同時間點的抑制率變化情況 畫出變化的曲線 曲線什么時候變得平坦了 到了平臺期 那個時間點應(yīng)該就是最好的時間點 因為這個時候的細胞增殖抑制表現(xiàn)的最明顯 4 培養(yǎng)時間 100ul的培養(yǎng)液對于10的4 5次方的增殖期細胞來說 很難維持68h 如果營養(yǎng)不夠的話 細胞會由增殖期漸漸趨向G0期而趨于靜止 影響結(jié)果 我們是在48h換液的 5 MTT法只能測定細胞相對數(shù)和相對活力 不能測定細胞絕對數(shù) 做MTT時 盡量無菌操作 因為細菌也可以導(dǎo)致MTT比色OD值的升高 7 實驗時應(yīng)設(shè)置調(diào)零孔 對照孔 加藥孔 調(diào)零孔加培養(yǎng)基 MTT 二甲基亞砜 對照孔和加藥孔都要加細胞 培養(yǎng)液 MTT 二甲基亞砜 不同的是對照孔加溶解藥物的介質(zhì) 而加藥組加入不同濃度的藥物 8 避免血清干擾 用含15 胎牛血清培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞時 高的血清物質(zhì)會影響試驗孔的光吸收值 由于試驗本底增加 會試驗敏感性 因此 一般選小于10 胎牛血清的培養(yǎng)液進行 在呈色后 盡量吸凈培養(yǎng)孔內(nèi)殘余培養(yǎng)液 關(guān)于細胞的接種 鋪板 細胞過了30代以后就不要用了 培養(yǎng)板要用好的 最好進口板 不好的板或重復(fù)利用的板只可做預(yù)實驗 接種時最好按照預(yù)實驗摸索出的密度接種 且而細胞過密或者過少 增殖都會過快或者過慢 其增值率線性關(guān)系不佳 故而MTT細胞密度多采用10000 ml 100ul 孔 細胞密度要根據(jù)不同細胞的特點來定 懸浮細胞每孔的細胞數(shù)可達到105 貼壁細胞可為103 104 MTT本身就是比較粗的實驗 增殖率10 左右的波動都不算奇怪 特別是新手 20 的波動也是常見的 所以很可能是技術(shù)原因引起的 特別是種板技術(shù)一定要過關(guān) 注意細胞懸液一定要混勻 已避免細胞沉淀下來 導(dǎo)致每孔中的細胞數(shù)量不等 可以每接幾個就要再混勻一下 加樣器操作要熟練 盡量避免人為誤差 另外 吹散次數(shù)過多也會影響細胞活力 所以要熟練鞋 快些上板 如何清除上清 直接吸出 加DMSO前要把液體吸掉 但培養(yǎng)液里的紫色結(jié)晶可能會吸去 可在這之前先用平板離心機離心96孔板 2000r 5分鐘 然后吸掉上清 如果是懸浮細胞 則推薦此法 懸浮細胞要離心2500rpm 10min 且其做MTT最好用圓底型96孔板 清除上清時注意不要把下面的結(jié)晶顆粒吸掉 建議各孔吸棄150 160ul即可 翻轉(zhuǎn)倒扣法 可以直接將板翻轉(zhuǎn)倒扣 墊幾層濾紙 2 3次 比用 吸 的辦法更不容易使細胞脫離出來 可以輕拍 或者傾斜一點幫助吸液 但前提是細胞貼壁要比較牢 加入DMSO 在同一批實驗中最好不要更換DMSO 加DMSO前把孔中液體盡量棄干凈如果培養(yǎng)液沒棄干凈 空白孔也要留有等量的培養(yǎng)液 這樣在檢測時可以盡量去除培養(yǎng)液的影響 DMSO的量也可為100ul或150ul 加了DMSO后用振蕩器輕輕振蕩5 10min 時間控制盡量嚴(yán)格一點 放置時間長了會影響結(jié)果 值會偏大 且結(jié)果不可信 加入DMSO溶解后盡快檢測 OD值的測定 至于測定波長的選擇是因顯色溶液而異的 對于DMSO 溶解后呈紫 紅 色 490nm有最大吸收值