病毒的形態(tài)學(xué)診斷.doc

實驗十 病毒的形態(tài)學(xué)診斷、培養(yǎng)方法和血清學(xué)試驗?zāi)?的（一）觀察病毒包涵體，并掌握其診斷意義。（二）掌握病毒的形態(tài)并了解病毒包膜的獲得。（三）了解病毒培養(yǎng)的三種方法。（四）掌握病毒學(xué)中主要血清學(xué)反應(yīng)的原理（五）熟悉病毒血凝抑制試驗的測定過程內(nèi) 容（一）病毒的形態(tài)學(xué)診斷1. 病毒的電鏡照片（示教）2. 狂犬病毒包涵體（示教）3. 麻疹病毒包涵體（示教）（二）病毒的培養(yǎng)法（錄像） 1. 病毒的動物接種法 2. 病毒雞胚培養(yǎng)法 3. 病毒的組織培養(yǎng)法 （三）血凝抑制試驗（操作）一、 病毒的形態(tài)學(xué)診斷病毒形態(tài)學(xué)研究方法可分為兩種：一種是應(yīng)用電子顯微鏡技術(shù)，觀察其大小，形態(tài)及排列特征，以幫助診斷；另一種是應(yīng)用光學(xué)顯微鏡通過涂片染色或切片染色，觀察包涵體。病毒感染細(xì)胞所產(chǎn)生的包涵體，其特征基本是固定的，故對病毒性疾病的診斷具有一定價值?！痉椒ā浚ㄒ唬┎《镜碾婄R照片（示教）觀察腺病毒、皰疹病毒的電鏡照片，注意其形態(tài)結(jié)構(gòu)、大小、排列、及其包膜的形成。（二）狂犬病病毒內(nèi)基（Negri）包涵體（示教）用高倍鏡或油鏡觀察經(jīng)HE（蘇木紫-伊紅染色）染色的死于狂犬病的犬腦組織切片，注意包涵體在細(xì)胞內(nèi)的形態(tài)、位置及染色性。（三）麻疹病毒包涵體（示教）用高倍鏡或油鏡觀察經(jīng)麻疹病毒培養(yǎng)后，HE染色的人胚或羊膜細(xì)胞標(biāo)本片，注意包涵體在細(xì)胞內(nèi)的位置、形態(tài)、染色性以及細(xì)胞融合情況。二、 病毒動物接種法實驗動物在病毒學(xué)研究中有四方面用途：分離鑒定病毒，如乙腦病毒；連續(xù)傳代通過，以減弱有毒株對人的致病力，如狂犬病病毒；制備抗血清；病毒致病機(jī)理的研究。常用的實驗動物有小白鼠、地鼠、豚鼠、家兔、綿羊、雞、猴等。在病毒學(xué)研究中，動物接種時為避免動物本身可能帶有病毒，多采用實驗室自己繁殖的動物。首先根據(jù)研究目的選擇動物種類，對病毒致病機(jī)制的研究，則選擇愈接近人類的高等動物（例如靈長類）研究結(jié)果愈有價值；其次要注意動物的年齡、性別和接種的途徑等各種因素，一般年幼的動物比成年動物對病毒的敏感性高。至于接種的途徑應(yīng)根據(jù)病毒的嗜性決定，例如腦炎病毒以腦內(nèi)注射最敏感。（一）小白鼠尾靜脈接種（錄像）【材料】1. 動物：小白鼠2. 病毒懸液3. 碘酒、酒精、二甲苯、無菌0.25ml注射器、4號針頭及小鋁匣【方法】1. 將小白鼠固定在小鋁匣內(nèi)，露出尾部，用碘酒消毒尾部，然后用酒精棉球連續(xù)擦尾部皮膚（必要時用二甲苯擦）使血管擴(kuò)張。2. 尾背和左右兩側(cè)三根血管皆為靜脈，可選一根擴(kuò)張較好的靜脈作接種用。左手拇指捏住尾部的遠(yuǎn)端，向下彎45，右手持注射器，于彎處進(jìn)針靜脈，推液0.1毫升。注意：推注時遇阻力且皮下隆起發(fā)白時，表示針頭不在血管內(nèi)應(yīng)拔出重新進(jìn)針；如針頭在血管內(nèi)，推注時不感阻力，且可看到血管中血液由于注入液體而后退。接種后逐日觀察動物發(fā)病情況。（二）小白鼠鼻內(nèi)接種（錄像）【材料】小白鼠、流感病毒鼠肺適應(yīng)株病毒懸液、無菌小試管、無菌毛細(xì)管、麻醉用乙醚、棉球及小玻瓶。【方法】1. 首先將沾有乙醚的棉球放入一清潔小玻瓶內(nèi)。左手握小瓶，右手抓住小白鼠，將其頭部塞入瓶口，進(jìn)行全身麻醉。注意麻醉深度，不宜太淺或太深，太深時易遭致麻醉死亡或非特異性吸入性肺炎，太淺則易在滴種時打噴嚏。2. 用無菌毛細(xì)吸管吸取病毒懸液少許，連同毛細(xì)吸管插在無菌試管中備用。3. 用左手將小白鼠握在手掌中，大拇指及食指抓住小白鼠耳部使其頭部朝前并呈仰臥位置，另一手取事先吸有病毒懸液的吸管，慢慢滴出一點于滴管口而不使其自然掉落，呈懸滴狀。將懸滴靠近動物鼻尖，動物在呼吸時自然吸入，一般為0.030.05毫升，不宜過多。4. 小白鼠慢慢蘇醒，在飼養(yǎng)盒中逐日開始發(fā)病，發(fā)病的癥狀常為毛聳、咳嗽、不食、甚至死亡。解剖尸體可觀察到肺炎或血性病灶。（三）小白鼠腦內(nèi)接種（錄像）【材料】腦炎病毒（小白鼠腦脊髓炎病毒）懸液。腦組織先用無菌生理鹽水洗去血液，再加10脫脂奶鹽水研磨成101懸液，然后用3000轉(zhuǎn)/分離心沉淀30分鐘，吸取上清液供接種用。小白鼠：3周齡，體重68克。無菌0.25毫升注射器及針頭（4號）、煮針鍋、碘酊、棉簽?！痉椒ā?. 以無菌0.25毫升注射器抽取腦炎病毒懸液0.1毫升，去除注射器內(nèi)的氣泡。2. 取出小白鼠，左手將小白鼠固定，固定時用大拇指和食指捏住小白鼠的頭部，左手手掌輕輕按住小白鼠的體部。3. 右手以棉簽蘸以碘酒，消毒小白鼠顳部皮毛（不碰到眼）。4. 右手拿注射器在小白鼠顳部（眼與耳根連線的中點略偏耳朵的方向）刺入，進(jìn)入顱腔，進(jìn)針23毫米，不要插得太深，注射量為0.020.03毫升。5. 注射完畢，將用過得注射器放入煮針鍋內(nèi)煮沸消毒。動物一般在34天后開始發(fā)病，食欲減退，活動遲鈍，毛聳，震顫，慢慢發(fā)展為麻痹，癱瘓而死亡。本法適用于一些腦炎病毒的分離培養(yǎng)。三、 病毒雞胚培養(yǎng)法雞胚培養(yǎng)法常用于痘類病毒、粘病毒和皰疹病毒的分離、鑒定、制備抗原、生產(chǎn)疫苗以及研究病毒性質(zhì)等。雞胚和實驗動物一樣，為一整體動物，有神經(jīng)血管的分布及臟器的構(gòu)造；雞胚的組織分化程度低，病毒易于繁殖，感染了病毒的膜結(jié)構(gòu)和液體中，含有大量病毒；雞胚來源充足，操作簡單、通常本身是無菌的，對接種的病毒不產(chǎn)生抗體為其優(yōu)點，但除產(chǎn)生痘皰的病毒及引起雞胚死亡的病毒外，通常不產(chǎn)生特異性的感染指征，必須利用第二個試驗系統(tǒng)來測定病毒的增殖。常用的雞胚接種方法有四種，即絨毛尿囊膜上接種法、羊膜腔接種法、尿囊接種法及卵黃囊接種法。根據(jù)不同病毒和不同目的采用合適的接種方法。（一）尿囊腔接種法（錄像）【材料】副流感病毒103稀釋液，1012日齡雞胚、無菌1毫升注射器及7號針頭、電動磨蛋器、檢蛋燈、彎頭小鑷子、蛋架、碘酒棉球、膠布、大頭針、無菌試管、無菌毛細(xì)吸管。【方法】1. 選用1012日齡雞胚，在照蛋燈上照視觀察雞胚是否存活，根據(jù)如下：小血管是否清晰；胚胎是否活動，觀察小雞的眼睛黑點是否移動；蛋白一邊和胎盤一邊是否界限分明，蛋白一邊較亮，胎盤一邊暗紅色，如果胎盤一邊發(fā)黑或蒼白都表示胚蛋已死亡。用鉛筆標(biāo)明天然氣室，雞胚及大血管位置，然后在絨毛尿囊膜發(fā)育區(qū)避開大血管的地方作一記號，定為注射入口。絨毛尿囊膜區(qū)血管豐富，在照視時呈現(xiàn)紅色，幾乎占據(jù)雞蛋的二分之一。2. 用碘酒消毒注射入口和天然氣室端的蛋殼，再用電動磨蛋器于注射入口和天然氣室端的蛋殼上磨一小孔，勿傷及卵膜。3用大頭針通過火焰消毒后刺穿氣室端所開小孔的卵膜，這樣可避免在注射時液體回流出來。4將雞胚橫臥于蛋架上，用無菌1毫升注射器抽取病毒液體，針頭于卵殼成30交角，由注射小孔刺入0.51.0厘米，注射0.10.2毫升（圖10-1）。5注射完結(jié)用膠布封口。封口前膠布用碘酒消毒，并通過火焰燒去余碘。用過的注射器用煮沸法消毒，雞胚放入3537培養(yǎng)。6注射后次日，逐日觀察雞胚生活情況，孵育4872小時后移入4冰箱。注意雞胚必須直立，令氣室端朝上。7收獲尿囊液之前取出雞胚，用碘酒消毒氣室端，并用鑷子擊破氣室端卵殼，沿氣室邊緣小心打開一大缺口，然后用小鑷子撕去卵膜及撕破絨毛尿囊膜，最后用毛細(xì)管吸取尿囊液，一般可吸得45毫升。8滴定尿囊液的病毒血凝效價。尿囊接種法適用于某些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒、新城雞瘟病毒等的培養(yǎng)，惟分離培養(yǎng)不如羊膜腔接種法陽性率高。羊水卵白氣室卵黃囊尿囊液圖 10-1 雞胚尿囊腔接種法（二）絨毛尿囊膜上接種法（錄像）【材料】牛痘苗病毒103稀釋液、1013日齡雞胚、橡皮乳頭、眼科鑷子或小剪刀、無菌培養(yǎng)皿、無菌生理鹽水，其余同尿囊腔接種法?！痉椒ā?選用1013日齡雞胚，在照蛋燈上照視觀察是否活胚蛋，用鉛筆劃下絨毛尿囊膜發(fā)育的界限。2將胚蛋橫臥于蛋座上，使其絨毛尿囊膜部位朝上，用碘酒消毒絨毛尿囊膜部位和天然氣室端的中心部，待干后即用磨蛋器輕輕在絨毛尿囊膜中心部磨一三角形窗口（每邊一厘米許），磨破卵殼而不使卵膜破裂，同時用磨蛋器于氣室端開一小孔。注意：已磨好之雞胚必須于12小時內(nèi)接種，否則絨毛尿囊膜易與卵殼粘著。3用分離針或大頭針通過火焰消毒，穿通天然氣室端所鋸小孔；并用分離針或大頭針輕輕劃破卵殼，露出三角形卵膜，最好將分離針或大頭針30角度自上往下壓迫卵膜一個小口，這樣不致?lián)p傷絨毛尿囊膜。4立即用橡皮乳頭在天然氣室一端小孔吸氣23次，目的將天然氣室的空氣吸去，而上面所開的洞口進(jìn)入空氣，形成一個人工氣室，可在照蛋燈上照視一下，看天然氣室是否消失，如未消失則尚需再吸氣數(shù)次（圖10-2）。5用小鑷子通過火焰滅菌，稍待冷卻后將三角形窗口的卵膜撕去、暫時蓋以無菌培養(yǎng)皿防止污染，然后用消毒注射器吸取牛痘苗懸液（103稀釋液，內(nèi)加適量的鏈霉素及青霉素），揭去培養(yǎng)皿，于窗口滴入0.10.2毫升病毒液，注畢后窗口用膠布封口，封口前膠布用碘酒消毒，并通過火焰，燒去余碘。用過的注射器煮沸消毒。6孵育于37溫箱，每日觀察生活情況，接種103稀釋的牛痘苗后的雞胚一般不死亡，但也可能在3天之后發(fā)生死亡，如發(fā)現(xiàn)死亡則立即放入普通冰箱，如不死亡則培養(yǎng)45日后放入普通冰箱，等待觀察檢查。7將感染病毒的雞胚自冰箱中取出，用碘酒消毒人工氣室面，然后用鑷子撕去膠布并將卵殼的三角形窗口擴(kuò)大，以便剪取絨毛膜，此時在明亮處可清楚地看到牛痘斑，呈白色點狀，有時融合成一堆或一片。8左手用小鑷子鑷起絨毛尿囊膜，右手用小剪順卵殼四周剪下絨毛尿囊膜放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，并用無菌生理鹽水洗滌12次，再將膜張開，膜上牛痘斑就看得更為清楚。絨毛尿囊膜上接種法，除適用于天花，牛痘等病毒外，尚適用于單純皰疹病毒和其它一些病毒，但其它一些病毒不如天花、牛痘、單皰疹病毒那樣具有明顯的病斑。絨毛尿囊膜羊水卵白卵黃囊尿囊液圖10-2 雞胚絨毛尿囊膜上接種（三）羊膜腔接種法（錄像）【材料】副流感病毒103稀釋液、910日齡雞胚、滅菌液體石蠟、其余同尿囊腔接種法?！痉椒ā?所用雞胚在使用前一天，將雞胚直立卵盤培養(yǎng)，使其胚胎向上，便于操作。 2接種前檢查雞胚生活情況，并用鉛筆畫出天然氣室和胚胎的位置，然后用磨蛋器沿天然氣室的邊緣和胚胎位置近處，鋸一方形小窗（每邊約1厘米許，如圖10-3）。3用小鑷子挑去方形卵殼和撕去卵膜，再用無菌吸管，吸取石蠟油少許，滴入2滴，石蠟油在氣室面的卵膜上很快散開，使膜透明，這樣在雞蛋照明燈或檢蛋燈上，可清楚地觀察到整個雞胚。4用無菌1毫升注射器抽取少許流感病毒液體，將雞蛋直立于照明燈或檢蛋燈上，針頭自窗口對著雞胚直下，穿過絨毛尿囊膜，羊膜腔、推動注射器，注入0.10.2毫升，針頭刺入時注意勿傷及雞胚本身，最好從小雞的頸部空隙中插入。5注射完畢后，用膠布封口（膠布先經(jīng)碘酒消毒和通過火焰燒去余碘處理）。用過的注射器煮沸消毒處理。雞胚放入3537培養(yǎng)4872小時。6自注射后次日起逐日檢查雞胚的生活情況，2日以內(nèi)死亡者多為非特異性損傷而致死；2日后死亡者視為特異性死亡，流感或副流感病毒103稀釋注射時，一般不引起死亡。收獲病毒之前將雞胚移入普通冰箱1824小時，將雞胚凍死，以減少收獲時的出血。7冰箱取出雞胚，碘酒消毒雞蛋氣室端，撕去膠布并將蛋殼窗口擴(kuò)大，用小鑷子撕破卵膜及絨毛尿囊膜，然后用毛細(xì)管吸出尿囊液棄去，尿囊液吸完后，左手持鑷子鑷住羊膜腔，右手以毛細(xì)吸管插入羊膜腔吸取羊水，一般羊水可吸出一毫升左右。8滴定羊水的病毒血凝效價。羊膜腔接種方法適用于一些呼吸道病毒，如流感病毒、副流感病毒及流行性腮腺炎病毒等的分離。 卵黃囊氣室卵白羊水尿囊液圖 10-3羊膜腔接種法四、病毒細(xì)胞培養(yǎng)法及病變觀察（錄像）細(xì)胞培養(yǎng)法是目前培養(yǎng)病毒應(yīng)用最廣的一種培養(yǎng)方法，其優(yōu)點是（1）經(jīng)濟(jì)適用，結(jié)果正確且敏感；（2）較實驗動物易于控制。細(xì)胞培養(yǎng)法多應(yīng)用于病毒的分離培養(yǎng)，進(jìn)行血清中和試驗及制造疫苗和抗原等方面。很多組織細(xì)胞，包括雞胚、鼠胚、各種動物的腎組織細(xì)胞，人胚羊膜組織細(xì)胞或流產(chǎn)胎兒組織細(xì)胞（應(yīng)在死后6小時內(nèi)采取，因時間過長，組織細(xì)胞生長成功率下降）等均可作細(xì)胞培養(yǎng)的來源。細(xì)胞的選擇主要依據(jù)組織細(xì)胞對病毒的敏感性。能引起病變的組織細(xì)胞，往往取自病毒的自然宿主，特別是引起疾病的宿主的某些臟器組織細(xì)胞。人類病毒，用人或猴的組織細(xì)胞較敏感，但這不是絕對的，如地鼠腎細(xì)胞較人腎細(xì)胞對流行性乙型腦炎病毒敏感。（一） 原代細(xì)胞培養(yǎng)法【材料】910日齡雞胚、Hanks氏溶液、0.25胰酶溶液、無菌小剪、鑷子、無菌培養(yǎng)皿、毛細(xì)吸管、吸管、沉淀管、無菌細(xì)胞培養(yǎng)管（抗生素空瓶）、100毫升無菌玻璃瓶或三角燒瓶、備有四層紗布的玻璃漏斗。【方法】1用碘酒消毒雞胚蛋氣室外殼，并將它直立于蛋架上，以鑷子將雞胚取出放入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，去頭爪及內(nèi)臟。2用小剪在培養(yǎng)皿內(nèi)將胚胎剪成小塊（45毫米3），加Hanks氏溶液（約10毫升）沖洗，靜置12分鐘后，用毛細(xì)吸管吸取液體。依同法再洗滌2次，將血球充分洗去。3用鑷子將組織塊放入無菌玻璃瓶或三角燒瓶內(nèi)，加入1015毫升0.25胰酶溶液，37水浴20分鐘，中間搖動幾次。由于胰酶的作用可使大量細(xì)胞游離，液體變混。經(jīng)四層紗布過濾后的細(xì)胞懸液，低速離心沉淀（1000轉(zhuǎn)/分以內(nèi)）5分鐘，吸取上清液，沉淀物加入適量營養(yǎng)液，用白細(xì)胞計數(shù)的方法進(jìn)行計數(shù)，使成每毫升含5080萬細(xì)胞懸液以作單層細(xì)胞培養(yǎng)。4每一細(xì)胞培養(yǎng)管，注入細(xì)胞懸液1毫升，蓋好瓶塞，并將瓶略加搖動，橫臥于有槽木架上，使細(xì)胞均勻平鋪于管壁。置37溫箱孵育，一般4小時，細(xì)胞附著于管壁，48小時可長成單層，此時即可調(diào)換營養(yǎng)液，接種病毒。（二） 傳代細(xì)胞培養(yǎng)法從人及動物組織，特別是腫瘤組織，經(jīng)過多次傳代可建立傳代細(xì)胞系。這種細(xì)胞能無限地傳代，但并不是所有的組織細(xì)胞都能建立傳代細(xì)胞。有一些傳代細(xì)胞對病毒敏感范圍較廣，曾被利用作病毒的分離和鑒定。如HeLa細(xì)胞，Hep2細(xì)胞及KB細(xì)胞。HeLa細(xì)胞對脊髓灰質(zhì)炎三型病毒，腺病毒及大多數(shù)實驗室適應(yīng)的ECHO病毒都敏感。Hep2細(xì)胞也曾用來分離脊髓灰質(zhì)炎病毒、柯薩奇A組病毒、腺病毒、RS病毒。HeLa細(xì)胞來自子宮頸癌，Hep2細(xì)胞來自喉癌，而KB細(xì)胞來自上腭癌。由于傳代細(xì)胞有致腫瘤作用，目前僅用做病毒的分離鑒定及一些病毒學(xué)的研究而不能用于疫苗的生產(chǎn)?！静牧稀繂螌蛹?xì)胞培養(yǎng)瓶，營養(yǎng)液，0.25胰蛋白酶溶液，無菌吸管，無菌細(xì)胞瓶?！痉椒ā?將成片細(xì)胞的生長液倒掉，用Hanks液洗一次。2加入適量的0.25胰蛋白酶，37孵育1分鐘。3將細(xì)胞瓶倒放，細(xì)胞在上，胰酶在下，繼續(xù)孵育37510分鐘。4將胰蛋白酶倒掉，再加入原量的生長液，用10毫升吸管吹打分散細(xì)胞。5用生長液按原量34倍稀釋，即一瓶細(xì)胞能傳34瓶。（三） 細(xì)胞培養(yǎng)接種病毒的方法及病變觀察（示教）【材料】單層細(xì)胞培養(yǎng)管、營養(yǎng)液、Hanks溶液、無菌毛細(xì)滴管和腺病毒稀釋液?！痉椒ā?取已長成單層細(xì)胞的培養(yǎng)瓶二只，用無菌毛細(xì)滴管吸去管中液體，用Hanks溶液洗二次。2用無菌的1毫升吸管吸稀釋的腺病毒液0.1毫升加入一只單層細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，另一只加0.1毫升營養(yǎng)液不接種病毒作為對照，細(xì)胞瓶放平，使其接觸整個細(xì)胞層，置37作用1小時，使病毒吸附到細(xì)胞上。3取出單層細(xì)胞瓶，每只中加入營養(yǎng)液0.9毫升，蓋緊后置37孵箱中培養(yǎng)12天。4取出細(xì)胞在低倍顯微鏡下觀察，注意種毒與對照二管的細(xì)胞形態(tài)，排列等。注：為方便保存，此處觀察的細(xì)胞已經(jīng)過固定和染色。五、血凝抑制試驗血凝抑制試驗系利用血凝素特異性抗體與病毒表面相應(yīng)血凝素相互作用，使病毒血凝現(xiàn)象抑制的試驗。血凝抑制試驗適用于具有血凝素的病毒，試驗必須預(yù)先滴定病毒的血凝效價，然后采用一定量的病毒，通常是加入4個血凝單位的病毒，在與血凝滴定試驗相同的反應(yīng)條件下來進(jìn)行測定。（一）血凝效價的滴定【材料】收獲的尿囊液（病毒懸液）、32孔有機(jī)玻璃板。0.2 ml移液器、移液頭、小試管一支、0.5雞紅細(xì)胞懸液、生理鹽水【方法】按下表進(jìn)行，其操作程序為：1將有機(jī)玻璃板孔從110號進(jìn)行編號，從第一孔起直至第10孔，每孔加生理鹽水0.2ml。2將尿囊液在試管中作15稀釋，即吸取0.8ml生理鹽水，加入0.2ml尿囊液。然后吸取15稀釋的尿囊液0.2 ml加入到第1孔，混勻后（吹吸3次），從中吸出0.2 ml移入第2孔，如此對倍稀釋直至第9孔，于第9孔中吸出0.2 ml，棄入消毒缸內(nèi)。第10孔不加尿囊液作為對照。3自第10孔起，反方向每孔補(bǔ)充生理鹽水0.2 ml。1 自第10孔起，反方向每孔加入0.5 雞紅血球0.4 ml，搖勻后放室溫靜止45分鐘，觀察結(jié)果，并確定血（球）凝（集）效價?？?號12345678910生 理 鹽 水（ml）尿 囊 液（ml）0.2+0.2 *0.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.2+0.20.20.2棄去病 毒 稀 釋 度11 012 014 018 01160132016401128012560對 照補(bǔ) 充 液（ml）（生 理 鹽 水）各 0.20.5 雞 紅 細(xì) 胞懸 液（ml ）各 0.4*為15稀釋尿囊液結(jié)果觀察：凡出現(xiàn)凝集者，紅細(xì)胞平鋪孔底，呈倒張的傘狀，邊緣有卷起的趨向。凝集特別顯著者為，次之為，凝集清楚可見者為，稍呈凝集者為；陰性者血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀。血凝效價：指呈現(xiàn)凝集時病毒的最高稀釋度。此時的稀釋度即為1個血凝單位。若1個血凝單位為1640，則4個血凝單位為1160。（二）血凝抑制試驗【材料】4個血凝單位的病毒液，15稀釋的抗血清，32孔有機(jī)玻璃板，0.2 ml移液器，移液頭，0.5雞紅細(xì)胞懸液，生理鹽水【方法】按下表進(jìn)行，其操作程序為：1將有機(jī)玻璃板孔從110號進(jìn)行編號，從第一孔起直至第9孔，每孔加生理鹽水0.2ml，第10孔加0.4ml。2于第1孔和第8孔中各加入15稀釋血清0.2ml。將第1孔混勻后從中吸出0.2ml移入第2孔，如此作對倍稀釋直至第7孔，于第7孔中吸出0.2ml棄入消毒缸內(nèi)。第8孔為血清對照。3于第1至第7孔中各加入0.2ml 4個血凝單位的病毒液，第9孔亦加入0.2ml病毒液作病毒對照。4稍加振搖后，每孔加入0.5雞紅細(xì)胞0.4ml，室溫靜置45分鐘，觀察結(jié)果?？?號1234567血 清 對 照病 毒 對 照紅 細(xì) 胞對 照生 理 鹽 水（ml）抗 血 清 （ml）0.20.2 *0.20.20.20.20.20.20.20.20.20.20.2 0.2 0.2棄去0.20.2 *0.2 0.4 血 清 稀 釋 度110120140180116 013 2016404 個 血 凝 單 位 病 毒（ml）各 0.2 0.2 0.5 雞 紅 細(xì) 胞 懸 液（ml）各 0.4*為15稀釋的抗血清結(jié)果：紅 細(xì) 胞 對 照 孔 ，血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明紅細(xì)胞無自凝現(xiàn)象；病毒對照孔，呈現(xiàn)凝集，表明病毒血凝功能正常；血清對照孔，血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明血清中無凝集因子；測定孔中，如血球沉于孔底中心，呈鈕扣狀，表明血清中有相應(yīng)的血凝抑制抗體，為陽性孔；反之凝集者為陰性孔。血凝抑制效價：呈完全血凝抑制時的最高血清稀釋度。附錄：附錄：1雞胚的準(zhǔn)備和發(fā)育過程病毒的雞胚培養(yǎng)，多采用來亨雞卵，其優(yōu)點為卵殼色白而薄，易于照視，如不能得到，一般家雞卵也可應(yīng)用。孵育溫度通常在3839之間，相對濕度4060。孵育45天后即可在檢蛋燈上檢查雞胚受精與否及發(fā)育情況。未受精之雞蛋于4日后僅見模糊卵黃黑影，無雞胚跡象?；畹碾u胚于4日后即可見清晰之血管小網(wǎng)，中有剛剛發(fā)育之胚胎，自45天以后逐日檢查胚胎生活情況，逐日增大之雞胚則可見到清楚之絨毛尿囊膜上的血管及活動之胚胎。受精卵在通過輸卵管時，已開始分裂，當(dāng)產(chǎn)卵時已在卵黃中形成細(xì)胞，名為胚點，在適宜溫度下即能繼續(xù)分裂發(fā)育，形成中、外、內(nèi)三胚層，逐步發(fā)育成各種器官。雞胚的最外層為石灰質(zhì)之卵殼，上有細(xì)孔以行氣體交換，下層為殼膜，很容易與孵殼分開，殼膜的功能是使氣體分子和液體分子在內(nèi)外兩方面進(jìn)行交換，因此在孵育雞胚時需要一定的濕度和氣流，如果濕度太低，雞胚就容易脫水，引起雞胚死亡，氣流同樣是重要的，孵育時如空氣不流通，亦可造成雞胚的死亡。因此殼和殼膜不是簡單的覆蓋，而是本身具有維持內(nèi)部生命的功能。氣室的功能是呼吸和調(diào)節(jié)壓力，殼膜之下為血管豐富的絨毛尿囊膜，外為絨毛膜，系外胚層形成，內(nèi)為尿囊膜，由內(nèi)胚層形成，兩膜結(jié)合之間為中胚層，因此絨毛尿囊膜是尿囊膜在生長發(fā)育過程中與絨毛膜相連而成，血管較多，起著胚胎呼吸器官的功能，氧氣的交換是在膜的血管內(nèi)通過卵殼孔而進(jìn)行的。雞胚孵育至第3天即出現(xiàn)尿囊，為直腸腹側(cè)部分的膨出物，尿囊腔是胚胎的排泄器官，內(nèi)含尿囊液，初為透明液體，是單純生理鹽水溶液，以后尿囊液中尿酸鹽迅速增加，胚胎發(fā)育到第1213天，尿囊液開始變得渾濁，若將其冷卻即可見有沉淀物形成，主要是尿酸鹽類。因此，在制備流感病毒抗原時，通常用鹽水將尿液加以稀釋后放4備用，這樣可減少尿酸鹽的沉淀，尿液量在雞胚發(fā)育的第11至13天最高，平均為66.5毫升。羊膜為胚胎最內(nèi)層包被，系由外胚層組成，羊膜腔盛有羊水，胎體浸泡于其中，羊水在起初是單純的生理鹽水，后來則蛋白質(zhì)含量增加，羊水量平均為1毫升左右。卵黃囊附著于胚胎，卵黃囊膜系由內(nèi)胚層的細(xì)胞組成，對培養(yǎng)病毒有重要作用，內(nèi)包有卵黃，為胚胎之養(yǎng)料，卵白位于卵之銳端，為胚胎發(fā)育晚期之養(yǎng)料。2Hanks溶液配制，先配成下列甲、乙兩種原液。原液甲：NaCl160克 KCl8克 加入800毫升雙蒸水MgSO47H2O2克MgCl2H2O2克CaCl2 2.8克溶于100毫升雙蒸水將上述二溶液混合后加雙蒸水至1000毫升，加2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4冰箱。原液乙：Na2HPO412H2O304克KH2PO41.2克 加入800毫升雙蒸水葡萄糖20克04酚紅液 100毫升加入雙蒸水使成1000毫升，加入2毫升氯仿作為防腐劑，保存于4冰箱，使用前按以下比例配成。原液甲1份原液乙1份雙蒸水18份以9磅10分鐘滅菌，此溶液存于4冰箱，可使用1個月。3營養(yǎng)液的配制Hanks液1000毫升水解乳白蛋白5克配制成0.5之水解乳白蛋白溶液，分裝小瓶以9磅10分鐘滅菌，使用前再加入510無菌牛血清，并調(diào)整pH（用NaHCO3溶液校正）。40.25胰蛋白酶溶液配制胰酶2.5克Hanks使用液1000毫升青霉素10毫升（最終濃度100單位/毫升）鏈霉素10毫升（最終濃度100單位/毫升）加胰酶和抗生素于Hanks液中，震蕩使其溶解，加壓過濾除菌，分裝，20低溫備用，一瓶最好用一次，不宜反復(fù)凍融。3流感病毒的分離和鑒定過程：【材料】患者早期漱口液（用大管肉湯收集）、910日齡雞胚、1毫升注射器及針頭（16號）、抗生素（每毫升含青霉素2萬單位及2萬微克鏈霉素）、無菌小試管、吸管、0.5雞紅細(xì)胞、已知各型流感免疫血清?！痉椒ā?病人急性期的漱口液 （抗生素處理） 活雞胚培養(yǎng)（羊膜腔