微生物學實驗室常用試劑與培養(yǎng)基.doc

微生物學實驗室常用試劑與培養(yǎng)基 29第一節(jié) 常用試劑及其使用方法一、診斷用紙片 桿菌肽紙片（0.04U/片）：抑菌圈10mm為敏感。質控菌株: D群鏈球菌陰性, A群鏈球菌陽性。 SMZ紙片（1.25g/片、23.75g/片）：出現(xiàn)抑菌圈即為敏感。質控菌株：D群鏈球菌陽性， A群鏈球菌陰性。 新生霉素紙片（5.0g/片）：抑菌圈16mm為敏感。質控菌株：表皮葡萄球菌陽性， 腐生葡萄球菌陰性。 O129紙片、奧普托欣（Optochin）紙片：參見第五節(jié)生化試驗培養(yǎng)基。二、診斷用血清1.沙門菌屬診斷血清 A-F群O多價診斷血清。 特異O群因子診斷血清：常用的有O2，O4，O7，O9，O10診斷血清。 特異H因子診斷血清 常用的有Ha，Hb，Hc，Hd，Hgm，Hi，Hf、Vi因子診斷血清。 2.志賀菌屬診斷血清志賀菌屬4種多價血清：痢疾志賀菌、血清，福氏志賀菌多價血清及分型血清（16型），宋內志賀菌診斷血清，鮑氏志賀菌多價血清及分型血清。3.致病性大腸埃希菌診斷血清腸致病性大腸埃希菌（EPEC）診斷血清，產腸毒素大腸埃希菌（ETEC）診斷血清，腸侵襲性大腸埃希菌（EIEC）診斷血清，腸出血性大腸埃希菌（EHEC）診斷血清O157： H 7。 4.霍亂弧菌O1、O139混合多價診斷血清及稻葉、小川、彥島O139分型血清 5.腦膜炎奈瑟菌多價血清及分群血清 6.鏈球菌分類診斷血清 7.肺炎鏈球菌診斷血清8.耶爾森菌診斷血清三、常用染色液1.革蘭染色液 結晶紫溶液 A液：結晶紫 20g，95%乙醇20 ml； B液：草酸銨 0.8g，蒸餾水80 ml。染色前24h將A液、 B液混合,過濾后裝入試劑瓶內備用。 碘液:碘1g，碘化鉀2g，蒸餾水300ml。將碘與碘化鉀混合并研磨,加入幾毫升蒸餾水, 使其逐漸溶解,然后研磨,繼續(xù)加入少量蒸餾水至碘、碘化鉀完全溶解。最后補足水量。也可用少量蒸餾水將碘化鉀完全溶解,再加入碘片,待完全溶解后,加水至300ml。 脫色液：95%乙醇 復染液：沙黃2.5g，95%乙醇100ml為貯存液，取貯存液10ml，加蒸餾水90ml為應用液。2.抗酸染色液 堿性復紅染色液： 萋納石炭酸復紅溶液：堿性復紅乙醇飽和溶液10ml，5%石炭酸溶液90ml。 脫色液：濃鹽酸3ml，95%乙醇97ml。復染液(呂弗勒美藍液)：美藍乙醇飽和溶液30ml，100g/L氫氧化鉀溶液0.1ml，蒸餾水100ml。 金胺O-羅丹明B染色液： 羅丹明B液：羅丹明B 0.1g加蒸餾水100ml。1g/L金胺O液：金胺O液0.1g加蒸餾水95ml,再加入純石炭酸 5ml,混勻。3%鹽酸乙醇。稀釋美藍液：呂弗勒美藍液100ml,加蒸餾水90ml,混勻。3.鞭毛染色液(改良Ryu法)A液：5%石炭酸10ml，鞣酸2g，飽和硫酸鋁鉀溶液 10ml； B液：結晶紫乙醇飽和液。應用液A液10份,B液1份,混合,室溫存放備用。4.異染顆粒染色液甲液：甲苯胺藍 0.15g，孔雀綠 2g/L，95% 乙醇2.0ml，蒸餾水100ml。乙液：碘 2g，碘化鉀3g，蒸餾水300ml。 先將碘化鉀加入少許蒸餾水(約2ml),充分振搖,待完全溶解,再加入碘,使完全溶解后, 加蒸餾水至300ml。5.莢膜染色液 印度墨汁或50g/L黑色素水溶液 5g/L苯胺藍水溶液。第二節(jié) 基礎培養(yǎng)基一、液體基礎培養(yǎng)基1.蛋白胨水用途用于細菌靛基質試驗；一般細菌培養(yǎng)和傳代。 配法 蛋白胨（或胰蛋白胨）10g，氯化鈉 5g，蒸餾水1L。將上述成分溶于水中，校正pH 至7.2,分裝試管，每管23ml，置121滅菌15min備用。 質量控制大腸埃希菌生長良好，靛基質陽性；傷寒沙門菌生長良好，靛基質陰性。2.營養(yǎng)肉湯用途 一般細菌的增菌培養(yǎng)，加入1%的瓊脂粉亦可作營養(yǎng)瓊脂。配法 蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1L。 將上述成分稱量混合溶解于水中，校正pH至7.4，按用途不同分裝于燒瓶或試管內。經121滅菌15min，作無菌試驗后冷藏備用。 質量控制 金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、化膿性鏈球菌生長良好。保存 置冰箱3周內用完。 3.牛肉浸液培養(yǎng)基用途 細菌培養(yǎng)最基礎的培養(yǎng)基，除用于一般細菌的培養(yǎng)外，又可以作營養(yǎng)瓊脂及其它培養(yǎng)基的基礎。 配法 新鮮除脂牛肉 500g，氯化鈉5g蛋白胨10g，蒸餾水1L。 先將牛肉清洗，除脂肪、肌腱，并切塊絞碎。稱取500g置容器加入蒸餾水1L，攪勻后置冰箱過夜，次日煮沸加熱30min，并用玻棒不時攪拌用絨布或麻布進行粗過濾，再用脫脂棉過濾即成。在過濾中加入蛋白胨10g、氯化鈉5g溶解后，用氫氧化鈉溶液校正pH至7.67.8，并加熱煮沸10min，補充蒸餾水至1L，最后用濾紙過濾，呈清晰透明、淡黃色液體，經12115min滅菌備用。用法根據用途不同可以制成營養(yǎng)肉湯，以此為基礎制成其它培養(yǎng)基。如制作固體培養(yǎng)基，加入瓊脂15 20g/L即可。質量控制 金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、傷寒沙門菌、痢疾志賀菌等均生長良好。保存 置4冰箱內可以使用較長時間。注:商品牛肉浸膏粉，一般使用量為35g/L。二、固體基礎培養(yǎng)基1.營養(yǎng)瓊脂用途 一般細菌和菌株的純化及傳種。 配法 蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，瓊脂粉（優(yōu)質）12g，蒸餾水1L。 將上述成分(除瓊脂外)溶于水中，校正pH 7.27.4后加入瓊脂，煮沸溶解，根據用途不同進行分裝，經121滅菌15min，傾注平板或制成斜面，冷藏備用。 質量控制 金黃色葡萄球菌菌落呈淺黃色； 痢疾志賀菌菌落無色；銅綠假單胞菌 菌落無色或淺綠色。保存 置4冰箱保存，2周內用完。2.血瓊脂培養(yǎng)基用途 一般病原菌的分離培養(yǎng)和溶血性鑒別及保存菌種。配法 pH 7.47.6牛肉浸液瓊脂 100ml，脫纖維羊血(或兔血) 510ml。 將血瓊脂基礎經121滅菌15min，待冷卻至50左右以無菌手續(xù)加入羊血，搖勻后立即傾注滅菌平皿內，待凝固后，經無菌實驗冷藏備用。 質量控制 化膿性鏈球菌ATCC 19615生長良好，-溶血；肺炎鏈球菌ATCC 6303生長良好，-溶血；表皮葡萄球菌ATCC 12228 生長良好,不溶血。保存 置4冰箱，1周內用完。 3.巧克力瓊脂培養(yǎng)基用途 主要用于嗜血桿菌的分離培養(yǎng)，亦可用于奈瑟菌的增殖培養(yǎng)。 配法 鮮牛肉浸出液1L， 蛋白胨10g,氯化鈉5g，瓊脂粉12g，無菌脫纖維羊血或兔血100ml。將上述成分（除兔血外）加熱溶解，調pH至7.2，置12115min高壓滅菌，待冷至約85，以無菌方式加入兔血，搖勻后置85水浴中，維持該溫度10min，使之成巧克力色。取出置室溫冷至約50，傾注平板或制成斜面?zhèn)溆谩?質量控制 流感嗜血桿菌ATCC 10211、肺炎鏈球菌ATCC 6305生長良好，菌落典型。保存 置4冰箱，1周內用完。 4.胱氨酸胰化酪蛋白瓊脂用途 常用于測定腦膜炎奈瑟菌和淋病奈瑟菌以及營養(yǎng)要求較高細菌的糖發(fā)酵試驗。 配法 胱氨酸0.5g, 胰化酪蛋白20g,氯化鈉5g，亞硫酸鈉0.3g，瓊脂3.5g，酚紅0.0175g，蒸餾水1L。將上述成分（酚紅除外）混合溶解，調pH至7.2，加入酚紅指示劑。分裝試管，115滅菌15min。用法用于測定糖發(fā)酵時，按需要加入各種糖溶液，將待檢標本直接種于培養(yǎng)基管內，置35孵箱，1824h觀察結果。培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色為陽性，不變色為陰性。第三節(jié) 保存和增菌培養(yǎng)基一、菌種保存培養(yǎng)基 配法 蛋白胨10g，牛肉膏5g，氯化鈉3g，磷酸氫二鈉2g，瓊脂粉4.5g，蒸餾水1L 。 將上述成分混合于水中，加熱溶解，調pH至7.47.6，分裝試管2/3左右高度，121高壓滅菌15min，成為半固體培養(yǎng)基，備用。 質量控制 培養(yǎng)基呈淡黃色半固體狀。大腸埃希菌(ATCC 25922)生長良好,動力陽性；福氏志賀菌(ATCC 12022)生長良好,動力陰性；金黃色葡萄球菌(ATCC 25923)生長良好,動力陰性。二、增菌培養(yǎng)基 1.葡萄糖肉湯用途 用于血液增菌。 配法 蛋白胨(或月示 胨)10g，氯化鈉5g，肉浸液（或心浸液）1L，葡萄糖3g，枸櫞酸鈉3g，5g/L對氨基苯甲酸水溶液10ml，1mol/L硫酸鎂溶液20ml，青霉素酶1000 U。 將蛋白胨、氯化鈉混合于肉浸液中加熱溶解，再加入葡萄糖、枸櫞酸鈉、對氨苯甲酸及硫酸鎂，繼續(xù)煮沸5min，并補足失水，調整pH至7.8。過濾分裝，每瓶50ml，高壓滅菌11520min后，每瓶加入青霉素酶50 U，經無菌試驗合格后，冷卻備用。 用法 將采取的血液標本，以無菌手續(xù)注入培養(yǎng)瓶中（血液1ml，培養(yǎng)液10ml），置35培養(yǎng)箱內，每天1次取出觀察結果。如有細菌生長，可出現(xiàn)數(shù)種不同的表現(xiàn)，應隨時作分離培養(yǎng)，可選用血瓊脂、伊紅美藍瓊脂及巧克力瓊脂平板等。無細菌生長表現(xiàn)的培養(yǎng)瓶，需連續(xù)觀察7d，仍無細菌生長方可棄去。在觀察的過程中，至少應作兩次分離培養(yǎng)。注: 枸櫞酸鈉為抗凝劑，可使血液加入培養(yǎng)基中不凝固。 對氨基苯甲酸主要中和血液中磺胺類藥物的抑菌作用。 硫酸鎂主要抑制血液中存在的四環(huán)素、金霉素、新霉素、多粘菌素及鏈霉素的抑菌作用。 本培養(yǎng)基近年來有許多改良配方，如加入0.3%0.5%酵母浸膏以增加營養(yǎng)；加0.2%核酸刺激細菌生長；加0.1%粘液素能被覆于細菌的表面，保護細菌免受抗體破壞；加入聚茴香腦磺酸鈉（SPS）能中和補體的抗藥作用從而提高檢出率。 2.血液增菌培養(yǎng)基 用途 血液和骨髓液病原菌的增菌培養(yǎng)。 配法 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，葡萄糖1g，酵母膏粉3g，枸櫞酸鈉3g，磷酸氫二鉀2g，5g/L對氨基苯甲酸溶液5ml，1mol/L硫酸鎂溶液20ml， 4g/L酚紅溶液6ml，青霉素酶50 U，聚茴香腦磺酸鈉(SPS) 0.3g，蒸餾水1L。 將上述成分（除酚紅指示劑、青霉素酶外）混合加熱溶解，校正pH至7.4，再加酚紅，過濾分裝每瓶3050ml，經121滅菌15min和3524h無菌試驗備用。臨用時每瓶加入1.52.5 U青霉素酶。質量控制 傷寒沙門菌ATCC 50096、白色念珠菌ATCC 10231、化膿性鏈球菌ATCC 19615、肺炎鏈球菌ATCC 6305、金黃色葡萄菌ATCC 25923、銅綠假單胞菌ATCC 27853均生長良好。 3.亞硒酸鹽增菌培養(yǎng)基用途 沙門菌增菌培養(yǎng)。 配法 蛋白胨5g，乳糖4g，磷酸氫二鈉4.5g，磷酸二氫鈉5.5g，亞硒酸氫鈉4g，蒸餾水1L。 先將亞硒酸鹽加到200ml蒸餾水中，充分搖勻溶解。其它成分稱量混合，加入蒸餾水800ml，加熱溶解，待冷卻后兩液混合，充分搖勻，校正pH 7.07.1(通過調整磷酸鹽緩沖對的比例來校正pH值)。最后分裝于15150mm的試管內，每管10ml。置水浴隔水煮沸1015min，立即冷卻，置4冰箱保存?zhèn)溆?。用?取新鮮標本1g或棉拭子采樣直接種于該培養(yǎng)管內。搖動后置35培養(yǎng)過夜。如發(fā)現(xiàn)均勻混濁，管底有紅色沉淀物，表示細菌生長。然后取培養(yǎng)物分離在選擇性培養(yǎng)基上，如SS瓊脂、麥康凱瓊脂平板等，進行培養(yǎng)。質量控制培養(yǎng)基應呈淡黃色或無色，透明無沉淀物。增菌靈敏度：傷寒沙門菌110-5，鼠傷寒及副傷寒沙門菌110-7。保存4保存，1周內用完。注： 亞硒酸鹽，包括亞硒酸鈉、亞硒酸氫鈉均可使用，但以亞硒酸氫鈉效果為好。 磷酸鹽緩沖對中，兩者的用量比例與亞硒酸鹽及蛋白胨的品種有關。制備前應進行調試，其總量為10g/L。 在制備過程中，亞硒酸鹽不能直接加熱。隔水煮沸時間亦不能超過規(guī)定時間，否則亞硒酸鹽會變質，生成紅色沉淀物。 培養(yǎng)基應呈淡黃色，有紅色沉淀物出現(xiàn)時不可再用。 4.SS增菌液 用途 用于沙門、志賀菌的增菌。 配法月示 胨 2g，蛋白胨8g，牛肉膏3.5g，酵母膏2g，葡萄糖2g，枸櫞酸鐵10g，硫代硫酸鈉10g，亞硫酸鈉0.7g，膽鹽5.5g，磷酸氫二鈉4g，磷酸二氫鉀0.1g，去氧膽酸鈉(進口) 1.5g，煌綠0.005g，蒸餾水1L。 將上述成分加熱溶于水中，調pH至7.1，分裝試管（15150mm），每管57ml，隔水煮沸5min備用。用法 取糞便標本1g直接種于增菌液內，351618h培養(yǎng)，取出轉種于分離培養(yǎng)基即可。 質量控制 培養(yǎng)基應呈淡黃色或略呈淡綠色。傷寒沙門菌ATCC 50096、福氏志賀菌ATCC 12022 生長良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑制。注： 切勿高壓，隔水煮沸時間不超過5min。 煌綠用量應根據不同產品批號酌情增減。 5.堿性蛋白胨水用途 霍亂弧菌增菌培養(yǎng)。 配法 蛋白胨 20g，氯化鈉5g，蒸餾水100ml。 將上述成分溶解于水中,校正pH 至8.6，分裝于試管810ml，經121滅菌15min備用。用法 將待檢標本接種到堿性胨水中，置35培養(yǎng)68h，霍亂弧菌呈均勻混濁生長，表面有菌膜出現(xiàn)。取表面菌液一白金環(huán)移種到堿性瓊脂、慶大瓊脂或TCBS瓊脂平板上。必要時做第二次增菌。質量控制 有條件的實驗室可用標準菌株，一般臨床實驗室可用非01群弧菌，培養(yǎng)后生長良好者方可使用?；魜y弧菌E1-Tor生物型和副溶血弧菌生長良好（6h）；大腸埃希菌ATCC 25922不生長（6h）。保存 置4冰箱，2周內用完。注：若在每升堿性胨水中加入1%亞碲酸鉀溶液0.51.0 ml，則成為亞碲酸鉀堿性胨水，其增菌效果更為理想。第四節(jié) 分離培養(yǎng)基 一、革蘭陽性桿菌分離培養(yǎng)基 1.羅-琴改良培養(yǎng)基用途 用于結核分枝桿菌培養(yǎng)。 配法 磷酸二氫鉀2.4g，硫酸鎂0.24g，枸櫞酸鎂(或枸櫞酸鈉) 0.6g，天門冬素3.6g，甘油12ml，蒸餾水600ml，馬鈴薯淀粉30g，新鮮雞卵液1L，2%孔雀綠水溶液20ml。先將磷酸鹽、硫酸鎂、枸櫞酸鎂、天門冬素及甘油，加熱溶解于600ml蒸餾水中。再添放馬鈴薯粉，邊放邊攪，并繼續(xù)置沸水中加熱30min，待冷卻至60左右時，加入雞卵液1L及孔雀綠溶液20ml，充分混勻后，用無菌操作分裝于滅菌試管，每支56ml，塞緊橡皮塞（最好是翻口塞），置于血清凝固器內制成斜面，經851h間歇滅菌2次(或高壓滅菌11520min)，待凝固后經無菌試驗，4冷藏備用。用法 取晨咳痰或其它體液標本，經消化處理和離心沉淀的濃縮液0.1ml（約2滴）滴種于培養(yǎng)基的斜面上，盡量搖晃，置355%10%二氧化碳溫箱內培養(yǎng)14周，觀察結果。凡在1周內發(fā)現(xiàn)生長的菌落，一般不可能是結核分枝桿菌；在2周后生長的菌落，奶油狀，略呈黃色，粗糙突起，不透明，即取菌進行涂片染色鏡檢及鑒定。質量控制用結核分枝桿菌菌株作陽性培養(yǎng)試驗。保存置4冰箱內24周有效。注： 本培養(yǎng)基由Lowenstein-Jenden設計的基礎上改良。（2）本培養(yǎng)基pH約為6.0左右，一般無須校正。 （3）間歇滅菌的溫度不宜超過90。 2.血清斜面培養(yǎng)基(呂氏血清斜面)用途 用于白喉棒狀桿菌培養(yǎng)。配法1%葡萄糖肉湯(pH 7.6)100ml，無菌動物血清(牛、羊、豬、兔) 300ml。將上述成分混合后，分裝于試管內，每管約45ml。斜插在血清凝固器內（或蒸籠）加熱808530min，使血清凝固成斜面，冷卻后放4冰箱內。取出后采用間歇滅菌法，85滅菌30min，連續(xù)3天，經無菌試驗證明無雜菌生長即可應用。用法 將喉拭子直接接種于上述斜面上，置35培養(yǎng)1624h。白喉桿菌在上述培養(yǎng)基上，菌落呈圓形，表面光滑、完整，9g/L氯化鈉溶液中易乳化，用阿爾培脫染色，兩極異染顆粒明顯。注： 所用血清不能含有防腐劑。 該培養(yǎng)基不能高熱滅菌，以防破壞其中營養(yǎng)成分。 配制時所有器皿、棉塞等均應高壓滅菌。 3.亞碲酸鉀血瓊脂用途 用于分離白喉桿菌。 配法 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，葡萄糖2g，胱氨酸0.05g，1%亞碲酸鉀45ml，脫纖維羊血100ml，瓊脂2g，蒸餾水900ml。 先將蛋白胨、氯化鈉、牛肉浸膏、葡萄糖和胱氨酸加水加熱溶解，調pH至7.6，加入瓊脂，高壓滅菌11515min備用。待冷至50左右，用無菌操作加入已滅菌的亞碲酸鉀溶液及羊血，混勻傾注平板。用法將標本直接接種于亞碲酸鉀平板上。置35孵箱，經2448h培養(yǎng)，觀察結果。白喉桿菌能使亞碲酸鉀還原成金屬碲而形成黑色和灰黑色的菌落。 二、革蘭陰性桿菌分離培養(yǎng)基 (一)弧菌分離培養(yǎng)基 1.堿性瓊脂用途 用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉膏3g，脂20g，蒸餾水1L。 將前4種成分混合于水中，加熱溶解，校正pH至 8.4，分裝后121滅菌15min，傾注平板。用法 凡急性患有水樣便標本做增菌培養(yǎng)的同時，應直接取標本接種到堿性瓊脂平板或亞碲酸鉀瓊脂平板上。置35培養(yǎng)1216h，觀察結果?；魜y弧菌生長較快，菌落大而扁平，呈青灰色，半透明，光滑濕潤。在亞碲酸鉀瓊脂上菌落呈灰黑色。質量控制 各實驗室凡自配培養(yǎng)基或商品培養(yǎng)基,在使用前可用標準菌株生長對照，臨床實驗室可送防疫部門所設立的專門檢驗機構進行目的菌監(jiān)測,質量可靠者方可使用。EL-Tor弧菌生長良好；大腸埃希菌ATCC 25922 生長抑制。保存 置4冰箱，1周內用完。2.堿性膽鹽瓊脂 用途 用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。 配法蛋白胨10g，牛肉膏 5g， 氯化納5g10g，瓊脂 20g，膽鹽（牛、豬）2.5g，蒸餾水1L。將上述成分稱量混合于水中加熱溶解，校正pH至8.4，分裝121滅菌15min，傾注平板。用法 取糞便標本或增菌培養(yǎng)物1接種環(huán)接種平板，置35溫箱培養(yǎng)1618h。霍亂弧菌迅速生長，其它細菌生長較緩慢。在1618h后，霍亂弧菌的菌落，直徑可達2mm左右，呈扁平，青灰色，半透明，光滑濕潤，易挑起。其它細菌菌落小而凸起，不透明，或有色素。質量控制 同堿性瓊脂。保存 置冰箱，1周內用完。 3.慶大霉素瓊脂用途 用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。 配法蛋白胨10g，牛肉浸膏3g，氯化鈉5g，枸櫞酸鈉10g，無水亞硫酸鈉3g，蔗糖(或白糖)10g，瓊脂1520g，慶大霉素、多粘菌素B“雙抗液”2ml，蒸餾水1L。 將上述成分(除“雙抗液”外)稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH至8.4，分裝滅菌12115min，待冷卻至50后，每100ml內加“雙抗液”0.2ml，另加5g/L亞碲酸鉀溶液0.1ml，再傾注平板。最后每毫升培養(yǎng)基內含有慶大霉素0.5 U，多粘菌素B6 U。用法 將糞便標本或增菌培養(yǎng)物劃線接種到該平板上，置35培養(yǎng)1618h。 由于該培養(yǎng)基抑制性強，其它非弧菌科細菌被抑制，而霍亂弧菌生長迅速，16h菌落可達2mm，菌落青灰色，半透明，扁平，光滑濕潤。若培養(yǎng)時間長，菌落略黃色、隆起，中心厚而不透明。質量控制霍亂弧菌(小川、稻葉)生長良好，培養(yǎng)1824h菌落直徑2.53.0mm；大腸埃希菌和變形桿菌生長抑制。保存 置4冰箱內，1周內用完。注： 該培養(yǎng)基國內有商品出售，多數(shù)產品已加入慶大霉素，使用時，應詳閱說明書?！半p抗液”配制：98ml滅菌蒸餾水中加慶大霉素(25 000 U/ml)1ml,多粘菌B或抗敵E(300 000 U/ml)1ml。4冰箱保存，1月用完。 4.四號瓊脂用途用于霍亂弧菌分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨10g，氯化鈉5g，牛肉浸膏3g，亞硫酸鈉(無水)3g，枸櫞酸鈉10g，豬膽汁粉5g，十二烷硫酸鈉20g，利凡諾（雷佛奴爾）3g，瓊脂粉12g，慶大霉素亞碲酸鉀混合液 1ml，蒸餾水1L。將前8種成分放入玻璃或搪瓷容器內(嚴禁用鋁制容器等金屬容器)，加入蒸餾水，加熱溶解混合后，調整至pH8.0,然后按1.2%加入瓊脂，煮沸至瓊脂溶化后，冷至60左右，按每100ml瓊脂加入慶大霉素亞碲酸鉀混合液(1ml 40 000 U慶大霉素加79ml蒸餾水混合后，加入0.8g亞碲酸鉀溶解混合即成，每毫升含500 U慶大霉素和10g/L亞碲酸鉀)0.1ml，搖勻，傾注平板。用法 取待檢標本劃線接種平板，置35培養(yǎng)過夜。 8h后即可初步觀察結果。24h培養(yǎng)后，霍亂弧菌呈中心黑色、較大而扁平的菌落。質量控制 配成的培養(yǎng)基呈亮黃色透明；EL-Tor弧菌稻葉型生長良好；EL-Tor弧菌小川型生長良好；大腸埃希菌ATCC25922抑制生長。注： 慶大和亞碲酸鉀混合液應新鮮配制并置冰箱保存。 雷佛奴爾應避光保存，而且每批均應預試后方可使用。成品培養(yǎng)基應避光保存。(二)腸桿菌分離培養(yǎng)基 1.中國藍瓊脂用途分離腸道菌的弱選擇性培養(yǎng)基。 配法肉膏湯瓊脂(pH7.4)1L，10g/L中國藍溶液(滅菌)10ml，乳糖10g，10g/L薔薇紅酸乙醇溶液10ml。取乳糖10g置于已滅菌的肉膏湯瓊脂瓶內，加熱溶解瓊脂并混勻。待冷卻至50左右，加入中國藍、薔薇紅酸乙醇溶液混勻，立即傾注平板，凝固后備用。用法 將標本接種平板，置351824h。分解乳糖產酸的細菌，其菌落呈藍色；不分解乳糖的細菌，菌落為淡紅色的透明菌落。 質量控制大腸埃希菌ATCC 25922菌落呈藍色；痢疾志賀菌型ATCC 13313和鼠傷寒沙門菌ATCC 13311菌落呈淡紅色。保存 4冰箱保存，1周內用完。注：(1)中國藍溶液需煮沸或115滅菌15min后應用。薔薇紅酸乙醇溶液無需滅菌，但加熱時應避開火焰。 (2)薔薇紅酸能抑制革蘭陽性細菌生長，但對大腸埃希菌沒有抑制作用，標本接種量不宜太多。(3)此培養(yǎng)基pH 7.4，應呈淡紅色。若過堿呈鮮紅色，過酸則呈藍色，均不適用。 2.木糖、賴氨酸、去氧膽酸鹽(XLD)培養(yǎng)基用途 為腸道菌選擇性培養(yǎng)基。 配法 酵母浸膏3g,L-賴氨酸5g,氯化鈉5g,D-木糖3.75g,乳糖7.5g,蔗糖7.5g,去氧膽酸鈉2.5g,硫代硫酸鈉6.8g,枸櫞酸鐵銨0.8g,瓊脂13.5g,1%酚紅溶液8ml,蒸餾水1L。將上述成分(酚紅除外)混合，加熱溶解，校正pH至7.2,再加入酚紅溶液混勻。121高壓滅菌15min，傾注平板備用。用法 將標本劃線接種平板，置35培養(yǎng)1824h。大腸埃希菌、腸桿菌屬、克雷伯菌屬、枸櫞酸桿菌屬細菌可形成黃色、不透明菌落；大多數(shù)沙門菌屬細菌因不利用糖類，為半透明紅色或無色菌落。質量控制大腸埃希菌呈黃色菌落；宋內志賀菌呈無色菌落；傷寒沙門菌 呈紅色菌落有黑心；金黃色葡萄球菌 抑制生長。保存 貯存于4有效期5天。 3.SS瓊脂用途沙門菌屬和志賀菌屬(Salmonella-Shigella)的分離培養(yǎng)。 配法 月示胨 5g，牛肉膏5g，乳糖10g，瓊脂1520g，膽鹽(No.3)3.5g，枸櫞酸鈉8.5g，硫代硫酸鈉8.5g，枸櫞酸鐵1g，1% 中性紅溶液2.5ml，0.1% 煌綠溶液0.33ml，蒸餾水1L。將上述成分(除中性紅、煌綠外)混合于水中，加熱煮沸溶解，校正pH至7.07.1，然后加入中性紅和煌綠溶液，充分混勻冷卻至50時傾注平板。用法 將標本接種平板，置35培養(yǎng)1824h。沙門菌屬菌落呈無色半透明，產生硫化氫者菌落中心呈黑色；志賀菌屬的菌落呈無色半透明；大腸菌屬呈紅色渾濁；宋內志賀菌能延緩發(fā)酵乳糖，培養(yǎng)24h后可以出現(xiàn)紅色菌落。腸道致病菌的菌落直徑均可達1.5mm以上。 質量控制大腸埃希菌菌落呈紅色；痢疾志賀型、福氏志賀菌和傷寒沙門菌 生長良好，菌落無色；腸炎或豬霍亂沙門菌菌落呈黑色；糞腸球菌、金黃色葡萄球菌不生長。保存 避光，3天內用完。注：煌綠要新配，中性紅要優(yōu)質。 4.麥康凱瓊脂用途 麥康凱瓊脂(Maconkey agar)用于腸道致病菌的分離培養(yǎng)和非發(fā)酵細菌鑒別。 配法 蛋白胨20g，氯化鈉5g，膽鹽(豬、牛、羊)5g，乳糖10g，瓊脂1520g，1%中性紅溶液5ml，蒸餾水1L。將上述成分(除中性紅外)稱量加入水中，加熱溶解，校正pH至7.2，加入中性紅溶液，分裝滅菌11520min，冷卻至50左右時傾注平板。用法 取標本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)1824h。不發(fā)酵乳糖的腸道細菌呈無色菌落，直徑約2.0mm左右，光滑半透明。質量控制大腸埃希菌菌落呈桃紅色；痢疾志賀菌菌落呈無色；傷寒沙門菌菌落 無色；金黃色葡萄球菌不生長。保存 置4冰箱(避光)，1周內用完。注：非發(fā)酵細菌在該平板上是否生長，是臨床鑒定某些非發(fā)酵細菌的指標之一。 5.伊紅美藍瓊脂用途 用于腸道致病菌及大腸菌群分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨10g，乳糖10g，磷酸氫二鉀2g，20g/L伊紅Y溶液20ml，6.5g/L美藍溶液10ml，瓊脂17g，蒸餾水1L。將蛋白胨、磷酸鹽、瓊脂稱量混合于水中，并加熱煮沸溶解，校正pH至 7.1，分裝121滅菌15min備用。臨用時加熱溶化瓊脂加入乳糖，冷至5055時加入伊紅和美藍溶液，搖勻傾注平板。用法 取糞便標本或增菌培養(yǎng)物接種平板，置35培養(yǎng)1824h。根據檢驗目的不同，挑取無色菌落或挑選紫紅色及有金屬光澤的菌落轉種克氏雙糖或三糖鐵瓊脂進行鑒定。質量控制 大腸埃希菌菌落呈紫紅色，有時有金屬光澤，直徑2.3mm；傷寒沙門菌菌落呈灰白色，直徑1.8mm；金黃色葡萄球菌不生長。保存 置4冰箱，1周內用完。 6.克氏雙糖鐵瓊脂用途克氏雙糖鐵瓊脂(Kliger iron agar)用于腸桿菌科細菌的初步鑒定。 配法 蛋白胨20g,牛肉膏3g,酵母膏3g,乳糖10g,葡萄糖1g,氯化鈉50g,枸櫞酸鐵銨0.5g,硫代硫酸鈉0.5g,0.2%酚紅溶液5ml,瓊脂12ml,蒸餾水1L。將前8種成分稱量混合于水中，加熱溶解，校正pH至7.5，再加入瓊脂和酚紅溶液，煮沸溶解分裝試管，每管4ml，經115滅菌20min，立即制成高層斜面，待凝固后經無菌試驗備用。用法 取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35培養(yǎng)1824h，觀察結果。斜面變黃，底層變黃，產氣者或不產氣者多屬大腸埃希菌群及發(fā)酵乳糖的菌株。斜面變紅，底層變黃，為不發(fā)酵乳糖菌株。產硫化氫菌株可使底層或全管產生黑色反應。質量控制奇異變形桿菌 K/A 硫化氫陽性；大腸埃希菌 A/A；志賀痢疾桿菌 K/A；傷寒沙門菌 K/A 硫化氫陽性；銅綠假單胞菌 K/K。保存 置4冰箱，2周內用完。注:該培養(yǎng)基pH值尤為重要，pH7.5時使用效果最佳。 7.三糖鐵瓊脂用途 用于腸桿菌科細菌初步生化鑒定。 配法 蛋白胨15g，月示胨5g，牛肉膏3g，酵母膏3g，乳糖10g，蔗糖10g，葡萄糖1g，氯化鈉5g硫酸亞鐵2g/L，硫代硫酸鈉0.3g，0.2%酚紅溶液5ml，瓊脂12g，蒸餾水1L。將前10種成分稱量混合于水中，加熱溶解后校正pH至7.4，再加瓊脂及酚紅溶液，加熱煮沸溶解。分裝試管，每管4ml，經115滅菌20min，立即置高層斜面，待凝固后，經無菌試驗備用。用法 取待檢菌純培養(yǎng)物，用接種針作底層穿刺和斜面劃線接種，置35培養(yǎng)1824h觀察結果。發(fā)酵乳糖或蔗糖的菌可使斜面及底層均變黃色。不發(fā)酵乳糖和蔗糖的細菌僅發(fā)酵葡萄糖時使底層變黃，斜面變紅。產生硫化氫的菌株可使底層或整個培養(yǎng)基呈黑色。分解乳糖或蔗糖后產氣時有些菌株還能使培養(yǎng)基斷裂。質量控制 傷寒沙門菌K/A， 硫化氫陽性；副傷寒沙門菌K/A， 硫化氫陽性；痢疾志賀菌K/A；大腸埃希菌A/A；普通變形桿菌A/A， 硫化氫陽性；銅綠假單胞菌 K/K。 保存 置4冰箱，2周內用完。注：該培養(yǎng)基pH 7.5時使用效果最佳。 8.山梨醇麥康凱瓊脂 用途 用于致病性、侵襲性和產毒性大腸埃希菌分離培養(yǎng)。 配法 蛋白胨5g，月示胨3g，氯化鈉5g，膽鹽（豬、牛、羊）5g，山梨醇10g，瓊脂粉12g，0.1g/L結晶紫溶液1ml，5g/L中性紅溶液5ml，蒸餾水1L將前4種成分混合于水中，加熱溶解，校正pH至7.2，再加入瓊脂粉加熱煮沸溶解。分裝三角燒瓶100ml。經12115min滅菌備用。臨用時，加熱溶解，再加山梨醇、結晶紫及中性紅溶液，搖勻傾注平板。用法 將標本或增菌液接種平板，置35培養(yǎng)1824h。與麥康凱瓊脂不同之處是挑取致病性大腸埃希菌菌落時，以無色菌落為主，同時兼取紅色菌落，如EPEC遲緩分解山梨醇，菌落呈紅色。EHEC O157H7菌落無色。質量控制 參照麥康凱瓊脂。保存 置4冰箱，1周內用完。 (三)非發(fā)酵細菌用培養(yǎng)基 1.金氏培養(yǎng)基(甲)用途 金氏培養(yǎng)基(Kings Medium)用于檢測假單胞菌產生的青膿素。 配法 蛋白胨20g，無水氯化鎂1.4g，無水硫酸鉀10g，瓊脂15g，甘油10ml，蒸餾水1L。將上述成分加熱、溶解，調pH至7.2，分裝試管，118121滅菌15min，制成斜面和高層備用。用法取待檢菌劃種于上述斜面上，35培養(yǎng)過夜。觀察斜面上產色素情況。 2.氧化-發(fā)酵試驗培養(yǎng)基用途 用于檢測細菌代謝類型。 配法 （1）Hugh-Leifson培養(yǎng)基(革蘭陰性桿菌用)：蛋白胨2g，葡萄糖10g，磷酸氫二鉀 0.3g，氯化鈉5g，溴麝香草酚藍（BTB）0.03g，瓊脂 2.5g，蒸餾水1L。 （2）葡萄球菌O/F(葡萄球菌和微球菌鑒別用)：胰蛋白胨10g，酵母浸膏10g，瓊脂20g，溴甲酚紫0.001g，蒸餾水1L，葡萄糖10g。將上述成分混合加熱溶解，調pH至7.1，分裝于試管中，每支試管5ml，高壓滅菌12115min，使成瓊脂高層，備用。用法 從斜面上挑取少許培養(yǎng)物，同時穿刺接種兩支培養(yǎng)基，其中一支接種后，滴加液體石蠟于培養(yǎng)基表面，高度約1cm。置35孵箱培養(yǎng)2448h。培養(yǎng)基變黃表示細菌分解葡萄糖而產酸，顏色不變?yōu)椴环纸馄咸烟恰?質量控制金黃色葡萄球菌ATCC2 5923、大腸埃希菌ATCC 25922發(fā)酵型；銅綠假單胞菌ATCC 27853氧化型；易變微球菌、糞產堿桿菌不利用。注：(1)有些細菌不能在上述培養(yǎng)基上生長，需在該培養(yǎng)基中加入2%血清或10g/L酵母浸膏，重做試驗。(2)指示劑不能用乙醇配制，因有些細菌可使乙醇產酸，導致發(fā)酵或氧化反應影響結果判斷。（四）其它革蘭陰性桿菌用培養(yǎng)基1.軍團菌培養(yǎng)基緩沖活性炭酵母瓊脂培養(yǎng)基（BCYE）用途 用于嗜肺軍團菌的分離培養(yǎng)。配法酵母浸液10g，活性（NoritSG）2g，L-半胱氨酸鹽酸鹽0.4g，可溶性焦磷酸鐵鹽0.25g，瓊脂17g，N-2-乙酰氨基-乙氨基乙醇磺酸（ACES）10g,蒸餾水80ml。上述成分除半胱氨酸及焦磷酸鐵外，其余成分混合加熱溶解，經12115min 滅菌，放水浴中冷卻到50。另外分別配新鮮L-半胱氨酸溶液（10ml蒸餾水中含0.4g）及焦磷酸鐵溶液（10ml含0.25g），分別過濾除菌，再加入已滅菌瓊脂中， 加入1mol/L 氫氧化鉀溶液45ml使培養(yǎng)基的最終pH為6.97.0，可用1mol/L 鹽酸溶液校正，傾注平板，冷卻后置4冰箱備用，亦可制成斜面，用于保存菌種。該培養(yǎng)基為黑色。用法液體標本可直接接種培養(yǎng)基， 肺、肝、脾等固體標本須制成100g/L懸液后再接種培養(yǎng)基，接種后的培養(yǎng)基置35需氧環(huán)境培養(yǎng)，培養(yǎng)箱需保持一定的濕度。每天用解剖鏡檢查平板培養(yǎng)物，用略大于100角的斜射光源照明。在BCYE平板上，培養(yǎng)45 天，菌落直徑約12mm，并出現(xiàn)亮藍和切削玻璃樣的構造；繼續(xù)培養(yǎng)后菌落增大呈黃綠色，較光滑。保存 在室溫、暗室中可保存1周2.彎曲菌選擇性培養(yǎng)基（1）Skirrows培養(yǎng)基用途 用于空彎及幽門螺桿菌分離培養(yǎng)。配法 蛋白胨5g，胰蛋白胨5g，酵母膏5g，氯化鈉5g，瓊脂粉12g，萬古霉素10ml，多粘菌素B 2500U，TMP 5mg，脫纖維羊血70ml，蒸餾水930ml。除血和抗生素外，其余成分混合于水中，加熱溶解，調pH至7.2，121滅菌15min。待冷至50時加入羊血7ml和多抗液0.5ml，搖勻，傾注無菌平板。用法將標本接種平板，置25或43微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h，菌落直徑達12mm，為不溶血的菌落。質量控制 大腸埃希菌ATCC 25922和糞腸球菌ATCC 33186不生長；空腸彎曲菌胎兒亞種ATCC 29424生長良好。注：1）多抗液的配制：乳酸62mg(約2滴)加入100ml滅菌水中，然后加入TMP100 mg，混合加熱100滅菌。取液5ml，再加萬古霉素100mg和多粘菌素B 0.38mg，搖勻后即可。 2）彎曲菌屬系微需氧菌，培養(yǎng)時可提供5%氧氣及10% 二氧化碳。高濃度氧不利于細菌生長，尤其是幽門螺桿菌。因此標本采集后，應盡快接種培養(yǎng)，或置運送培養(yǎng)基中運送。3）彎曲菌運送可用布氏菌湯培養(yǎng)基。 Campy-BAP培養(yǎng)基用途 用于分離培養(yǎng)彎曲菌。配法蛋白胨10g，胰胨10g，葡萄糖10g，酵母浸膏3g，氯化鈉5g，重亞硫酸鈉0.1g，蒸餾水900ml，脫纖維羊血100ml，萬古霉素10mg，多粘菌素B 2 500 U，TMP 5mg，兩性霉素B 2mg。將上述成分（除羊血和抗菌補充劑外），加入900ml蒸餾水，加熱溶解，調pH至7.2后分裝，121滅菌15min，加入羊血和抗菌藥物添加劑，充分混勻后傾注于無菌平皿內。用法取標本接種于平板，置25或43微需氧環(huán)境中培養(yǎng)48h，菌落直徑達12 mm，不溶血。質量控制 大腸埃希菌ATCC 25922不生長；糞腸球菌ATCC 33186不生長；空腸彎曲菌胎兒亞種ATCC 29424生長良好。第五節(jié) 生化試驗培養(yǎng)基一、糖發(fā)酵試驗培養(yǎng)基 1.糖醇發(fā)酵試驗培養(yǎng)基用途 檢查細菌對不同糖(醇)類的發(fā)酵能力，達到鑒定細菌的目的。 配法 蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉 5g，安德烈(Andrade)指示劑10ml，蒸餾水1L，各種糖(醇)類 510g。 將上述成分混合后，加熱溶解。矯正pH至7.2。根據需要，分別再加相應的糖和醇。分裝于13mm100mm的試管，每管約3ml，115滅菌15min。如需觀察產氣，可在試管內加小倒管1只。將分離的純菌接種到糖（醇）發(fā)酵管中，置35培養(yǎng)1824h。接種菌若能分解培養(yǎng)基中的糖（醇）類而生成酸，使指示劑呈酸性反應，若產生氣體，則可使液體培養(yǎng)基中的倒管(Durham管)內出現(xiàn)氣泡；若接種菌不分解糖（醇）則無反應。 2.血清菊糖試驗培養(yǎng)基用途 用于肺炎鏈球菌與其它鏈球菌鑒別。 配法 血清(兔血清或牛血清)25ml，1g/L酚紅溶液2ml，菊糖1g，蒸餾水75ml。先取血清25ml、蒸餾水75ml混合，置阿諾滅菌器內加熱15min，以破壞血清內的淀粉酶。調pH至7.4，然后加入菊糖1.0g、1g/L酚紅溶液2ml搖勻。分裝于13mm100mm的試管，每管2ml。用間歇滅菌法滅菌，每天1次，連續(xù)3天，每次20min。用法 將被檢菌接種培養(yǎng)基，置35培養(yǎng)1824h。分解菊糖的菌株使培養(yǎng)基變黃；不分解菊糖的菌株，培養(yǎng)基不變色。 質量控制 肺炎鏈球菌ATCC 10015陽性；化膿性鏈球菌ATCC 19615陰性。 3.膽汁七葉苷試驗培養(yǎng)基配法 蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，牛膽汁40g，七葉苷1g，枸櫞酸鐵0.5g，瓊脂15g，蒸餾水1L。將上述成分混合加熱溶解，調pH至7.2，分裝試管，115滅菌15min。將待測菌種接種到七葉苷培養(yǎng)基的斜面上，置35孵育1824h，觀察結果。培養(yǎng)基變?yōu)楹谏蜃厣邽殛栃裕徊蛔兩邽殛幮浴?質量控制糞腸球菌 ATCC 29212 陽性；化膿性鏈球菌ATCC 19615 陰性。保存 置4冰箱，2周內用完。二、酶類測定培養(yǎng)基和試劑 1.氨基酸脫羧酶試驗培養(yǎng)基 用途 檢查細菌使氨基酸脫羧基形成胺使培養(yǎng)基變堿的能力。常用的氨基酸有賴氨酸、鳥氨酸和精氨酸。 配法 蛋白胨5g,牛肉浸膏5g,溴甲酚紫0.1g,甲酚紅0.005g,吡多醛(VB6)0.005g,葡萄糖0.5g,蒸餾水1L。加熱慢慢溶解，按10g/L濃度加入所需要的氨基酸，調pH至6.0，呈深亮紫色。分裝每支2ml，同時配對照管(不加氨基酸)，高壓滅菌12115min,冷卻后4冷藏備用。用法 將試驗菌接種培養(yǎng)基，同時接種對照管1支。并用滅菌的液體石蠟覆蓋，置35培養(yǎng)1824h。陽性菌初期由于細菌發(fā)酵葡萄糖產酸呈黃色，若繼續(xù)孵育，氨基酸經脫羧產生胺類使培養(yǎng)基變堿，指示劑改變顏色，呈紫色或紫紅色。陰性呈黃色或不變色。 質量控制賴氨酸脫羧酶:遲緩愛德華菌陽性，弗勞地枸櫞酸菌陰性；鳥氨酸脫羧酶:產氣腸桿菌陽性，弗勞地枸櫞酸菌陰性;精氨酸脫羧酶:鼠傷寒沙門菌陽性，普通變形桿菌陰性。 2.耐熱DNA酶培養(yǎng)基用途 用于檢測細菌所產生的耐熱脫氧核糖核酸酶。 配法 胰蛋白胨1.5g,植物蛋白胨0.5g,氯化鈉0.5g,DNA 2g/L,瓊脂1.5g,蒸餾水100ml,2g/L甲苯胺藍溶液 0.25ml。將前6種成分徐徐加熱溶解后，調pH至7.4，加入甲苯胺藍溶液，分裝試管， 121滅菌15min后備用。用法 上述瓊脂傾注于載玻片上，凝固后，打孔，孔徑2cm，孔內加入經10015min隔水加熱處理后的肉湯培養(yǎng)物。將載玻片孵育于35濕盒內4h,取出觀察結果。陽性反應在孔周圍出現(xiàn)不小于4mm直徑粉紅色圈，陰性反應培養(yǎng)基的顏色無改變。 質量控制 金黃色葡萄球ATCC 25923 陽性；表皮葡萄球菌ATCC 12990 陰性。 3.DNA酶試驗培養(yǎng)基用途 供細菌DNA酶測定用。配法DNA 2g，胰酪胨15g，大豆胨5g，氯化鈉5g，瓊脂20g，蒸餾水1L。將5種成分混合于蒸餾水中，加熱溶解，校正pH至7.27.4，分裝三角燒瓶，經115滅菌15min，傾注滅菌平皿，4冷藏備用。用法 將待檢菌作點狀穿種在平板上，置35培養(yǎng)24h。待細菌生長成集落菌苔后，在其菌苔上及周圍滴加0.1mol/L鹽酸溶液數(shù)毫升，待片刻后，如待檢菌DNA酶陽性，可在菌苔的周圍出現(xiàn)明顯的透明圈；而陰性者則無透明圈出現(xiàn)。 質量控制 金黃色葡萄球菌ATCC 25923和粘質沙雷菌 ATCC 274陽性;表皮葡萄球菌ATCC 14990和大腸埃希菌ATCC 25922陰性。 保存 置4冰箱1周內用完。4.氧化酶試驗用途區(qū)別