《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析》PPT課件.ppt

第五章蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析 人體基因數(shù)目?jī)H比低等生物線(xiàn)蟲(chóng)多兩倍 如此少的基因是如何創(chuàng)造出人體如此復(fù)雜的生命活動(dòng) 人體基因的主要功能是通過(guò)蛋白質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)的 蛋白質(zhì)扮演著構(gòu)筑生命大廈的主要角色 人體中大約有10萬(wàn)種蛋白質(zhì) 測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的意義 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析方法X 射線(xiàn)晶體衍射法 85 3 核磁共振波譜 14 7 電鏡三維重構(gòu) 各種光譜技術(shù) 顯微技術(shù)和計(jì)算機(jī)模擬 蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)解析過(guò)程 1895年11月8日 德國(guó)物理學(xué)家 50歲的倫琴在自己的實(shí)驗(yàn)室中偶然發(fā)現(xiàn)一種從陰極射線(xiàn)管中輻射出的新型射線(xiàn) 由于對(duì)管子發(fā)出的 東西 性質(zhì)不確定 倫琴就把這種射線(xiàn)命名為 X射線(xiàn) 圖片出處 倫琴實(shí)驗(yàn)室 第一節(jié)X 射線(xiàn)衍射測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 人類(lèi)第一張X光照片 圖片出處 倫琴妻子之手 1896年1月23日倫琴將這一重大發(fā)現(xiàn)在維爾茲堡物理醫(yī)學(xué)會(huì)上報(bào)告 Kolliker教授提議將該射線(xiàn)命名為 倫琴射線(xiàn) 但倫琴卻說(shuō) 我還沒(méi)有徹底解釋這種射線(xiàn)的發(fā)生現(xiàn)象 還是稱(chēng)它為X射線(xiàn)最恰當(dāng) 威廉 康拉德 倫琴WilhelmConradR ntgen 1901年第一屆諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)評(píng)選時(shí) 29封推薦信中就有17封集中推薦他 倫琴最終獲得了第一次諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)金 圖片出處 諾貝爾物理獎(jiǎng)獎(jiǎng)?wù)?X射線(xiàn)本質(zhì) X射線(xiàn)是一種短波長(zhǎng) 0 005 10nm 高能量 2 5 105 1 2 102eV 的電磁波 它是原子內(nèi)層電子在高速運(yùn)動(dòng)電子流沖擊下 產(chǎn)生躍遷而發(fā)射的電磁輻射 一般由高速電子撞擊金屬產(chǎn)生 如圖所示 是一種產(chǎn)生X射線(xiàn)的真空管 K是發(fā)射電子的熱陰極 A是由鉬 鎢或銅等金屬制成的陽(yáng)極 兩極之間加有數(shù)萬(wàn)伏特的高電壓 使電子流加速 向陽(yáng)極A撞擊而產(chǎn)生X射線(xiàn) A X射線(xiàn)衍射 1912年MaxvonLaue發(fā)現(xiàn)X射線(xiàn)具有衍射的現(xiàn)象 1914年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng) 圖片出處 勞厄的實(shí)驗(yàn)裝置 圖片出處 X 射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)分析基本原理 X射線(xiàn)衍射分析所依賴(lài)的基本原理是X射線(xiàn)衍射現(xiàn)象X射線(xiàn)衍射現(xiàn)象利用X射線(xiàn)的波長(zhǎng)和晶體中原子的大小及原子間距同數(shù)量級(jí)的特性來(lái)分析晶體結(jié)構(gòu) 當(dāng)X射線(xiàn)入射到樣品晶體分子上時(shí) 分子上的每個(gè)原子使X射線(xiàn)發(fā)生散射 這些散射波之間相互疊加形成衍射圖形 衍射圖形能給出樣品內(nèi)部結(jié)構(gòu)的許多資料 如原子間的距離 鍵角 分子的立體結(jié)構(gòu) 絕對(duì)構(gòu)型 原子和分子的堆積 有序或無(wú)序的排列等 X射線(xiàn)通過(guò)紅寶石晶體 a 和硅單晶體 b 所拍攝的勞厄斑 圖片出處 勞倫斯 布拉格 LawrenceBragg 亨利 布拉格 HenryBragg 因在用X射線(xiàn)研究晶體結(jié)構(gòu)方面所作出的杰出貢獻(xiàn) 亨利 布拉格 WilliamHenryBragg 和勞倫斯 布拉格 WilliamLawrenceBragg 父子分享了1915年的諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng) 圖片出處http 202 202 4 150 nobel nobel1 htm 圖片出處http nobelprize org physics laureates 1915 wl bragg bio html 20世紀(jì)60年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)可以獲得諾貝爾獎(jiǎng) 20世紀(jì)70年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可成為轟動(dòng)世界的新聞 20世紀(jì)80年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)則可申請(qǐng)到教授的職位 20世紀(jì)90年代解析一個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)通?？梢垣@得博士學(xué)位 今天 一個(gè)博士研究生也許就可解析多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 但如果沒(méi)有深入研究其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 往往不能畢業(yè) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)解析的發(fā)展 饒子和院士 HIV基質(zhì)蛋白 SARS 射線(xiàn)衍射用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的測(cè)定 1954年伯納爾 Bernal 獲得第一張胃蛋白酶晶體 衍射圖片 1957年肯特羅 Kendrew 完成肌紅蛋白的0 6nm分辨率的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu) 圖片出處 http www drg de data wuerdigungen Nobelpreise RoenNobel htm 圖片出處 http www2 mrcmb cam ac uk archive gal source kendrew html 肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu) 肌紅蛋白的三維結(jié)構(gòu)模型 圖片出處 圖片出處 http www2 mrc lmb cam ac uk archive Kendrew62 html 1959年佩魯茨 Perute 完成血紅蛋白0 55分辨率的晶體結(jié)構(gòu) 圖片出處 http www hsgq pudong 血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)模型 圖片出處 血紅蛋白分子就是由二個(gè)由141個(gè)氨基酸殘基組成的 亞基和二個(gè)由146個(gè)氨基酸殘基組成的 亞基按特定的接觸和排列組成的一個(gè)球狀蛋白質(zhì)分子 每個(gè)亞基中各有一個(gè)含亞鐵離子的血紅素輔基 四個(gè)亞基間靠氫鍵和八個(gè)鹽鍵維系著血紅蛋白分子嚴(yán)密的空間構(gòu)象 由于測(cè)定出蛋白質(zhì)的精細(xì)結(jié)構(gòu) 兩位英國(guó)科學(xué)家M F 佩魯茨和J C 肯德魯獲得1962年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 圖片出處 1997年 核小體八組蛋白結(jié)構(gòu)2004年 菠菜捕光復(fù)合物L(fēng)HC II 2005年 線(xiàn)粒體膜蛋白復(fù)合物2精細(xì)結(jié)構(gòu) X射線(xiàn)衍射測(cè)定蛋白和核酸精細(xì)結(jié)構(gòu) 為新藥設(shè)計(jì)提供了全新方向 中國(guó)科學(xué)家研制抗癌新藥首獲瑞典愛(ài)明諾夫獎(jiǎng) 施一公抗癌抗乙肝病毒新藥Birinapant 進(jìn)入臨床二期 蛋白質(zhì)X射線(xiàn)晶體結(jié)構(gòu)測(cè)定程序 1 樣品制備2 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng)3 衍射數(shù)據(jù)收集和處理4 位相求解5 模型建立和修正 1 樣品制備 大量表達(dá) 分離和純化目標(biāo)蛋白 一般要求純度大于97 濃度達(dá)到5mg ml以上 2 蛋白質(zhì)結(jié)晶和晶體生長(zhǎng) 蛋白質(zhì)結(jié)晶原理與小分子結(jié)晶一樣 蛋白質(zhì)在溶液中處于過(guò)飽和狀態(tài)時(shí) 分子間可以規(guī)則的方式堆積起來(lái)形成晶體析出 蛋白質(zhì)晶體生長(zhǎng)的影響因素 物理因素 溫度 重力 壓力 震動(dòng) 時(shí)間 電場(chǎng)磁場(chǎng) 介質(zhì)的電解質(zhì)性質(zhì)和粘度 均相或非均相成核等化學(xué)因素 pH值 沉淀劑類(lèi)型和濃度 添加劑 離子種類(lèi) 離子強(qiáng)度 過(guò)飽和度 氧化還原環(huán)境 蛋白質(zhì)濃度等生化因素 蛋白質(zhì)純度 配合體 抑制劑 化學(xué)修飾 遺傳修飾 蛋白質(zhì)的聚集狀態(tài) 蛋白質(zhì)水解 蛋白質(zhì)自身的對(duì)稱(chēng)性 蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性和等電點(diǎn)等 蛋白質(zhì)結(jié)晶方法 1 批量結(jié)晶法 Batchcrystallization 2 透析法 Dialysis 3 液相擴(kuò)散法 Liquiddiffusion 4 氣相擴(kuò)散法 Vapourdiffusion 5 蛋白質(zhì)結(jié)晶新方法 1 批量結(jié)晶法 Batchcrystallization 通過(guò)在待測(cè)結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液的體積 濃度和組成固定的條件下 直接將不同量的飽和沉淀劑加入未飽和的蛋白質(zhì)溶液以產(chǎn)生一個(gè)濃度梯度而使蛋白質(zhì)在不同的過(guò)飽和溶液中結(jié)晶 2 透析法 Dialysis 利用半透膜允許小分子透過(guò)而大分子不能透過(guò)的性質(zhì)來(lái)調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)溶液的沉淀劑濃度 pH或離子強(qiáng)度 從而使蛋白質(zhì)溶液緩慢形成過(guò)飽和狀態(tài)以形成晶核 該法是培養(yǎng)蛋白質(zhì)晶體的常用方法 3 液相擴(kuò)散法 Liquiddiffusion 利用液相平衡原理而設(shè)計(jì)的 由于蛋白質(zhì)在不同溶液中的溶解度不同 把待結(jié)晶蛋白質(zhì)溶液緩慢加入溶解性差異大的溶劑中 在界面處形成沉淀劑濃度梯度在局部達(dá)到瞬間過(guò)飽和 從而促使晶核形成 4 氣相擴(kuò)散法 Vapourdiffusion 把待結(jié)晶蛋白質(zhì) 高于此蛋白質(zhì)結(jié)晶所需鹽濃度的溶液和低于這種濃度的鹽溶液放在一個(gè)密閉體系內(nèi) 兩種濃度不同的溶液由于發(fā)生蒸汽擴(kuò)散最后達(dá)到平衡 隨著溶液中沉淀劑濃度的增加蛋白質(zhì)溶解性降低 從而蛋白質(zhì)達(dá)到過(guò)飽和而析出晶體 5 結(jié)晶新方法Nucleant生物玻璃 晶體初步鑒定偏光顯微鏡觀(guān)察 染色 電泳等 3 衍射數(shù)據(jù)收集和處理 第三代同步輻射光源的應(yīng)用使得用20 40um大小的晶體解析高分辨率結(jié)構(gòu)已經(jīng)成為現(xiàn)實(shí)目前世界上比較著名的同步輻射工作站有多個(gè) APS USA ESRF France SPring 8 Japan 上海同步輻射中心 同步輻射光源 晶體收集和儲(chǔ)存 液氮?dú)饫浼夹g(shù) 4 位相求解 1 分子置換法 MR 2 多對(duì)同晶型置換法 MIR 3 多波長(zhǎng)反常散射法 MAD 實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常聯(lián)合使用 分子置換法 MR 分子置換法就是把已知結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)分子放到待測(cè)蛋白質(zhì)晶體的晶胞中建立起初始結(jié)構(gòu)模型并借助此模型計(jì)算待測(cè)蛋白質(zhì)晶體各個(gè)衍射點(diǎn)的相角的方法 多對(duì)同晶型置換法 MIR 在蛋白質(zhì)晶體中引入散射能力強(qiáng)的重金屬原子如Pb和Hg等作為標(biāo)志原子 制備出重原子的衍生物 然后求出這些重原子在晶胞中的坐標(biāo) 根據(jù)坐標(biāo)計(jì)算出重原子散射波在各個(gè)衍射點(diǎn)的相角 最后推測(cè)出蛋白質(zhì)分子在各個(gè)衍射中的位相 多波長(zhǎng)反常散射法 MAD 利用同步輻射波長(zhǎng)連續(xù)可變的特點(diǎn) 使用一個(gè)重原子衍生物作為母體 用一個(gè)晶體就可以收集到重原子反常散射吸收邊兩側(cè)的多套數(shù)據(jù) 并解出結(jié)構(gòu) 5 模型建立和修正 晶體學(xué)R因子一般要求達(dá)到0 2以下鍵長(zhǎng)偏差大約為0 015 鍵角偏差約為3 二面角構(gòu)象分布要求除了甘氨酸的二面角構(gòu)象是隨機(jī)的外 其他殘基的二面角構(gòu)象分布受到立體化學(xué)的限制 X Ray晶體衍射目前仍然是蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要方法優(yōu)點(diǎn) 分辨率高 能精確確定生物大分子中各原子的坐標(biāo) 鍵長(zhǎng) 鍵角 給出生物大分子的分子結(jié)構(gòu)和構(gòu)型 確定活性中心的位置和結(jié)構(gòu)缺點(diǎn) 只能測(cè)定單晶 反映靜態(tài)結(jié)構(gòu)信息 無(wú)法測(cè)定溶液中的信息 成為推廣速度和發(fā)展速度都居首位的一種結(jié)構(gòu)分析方法 核磁共振可以方便地在溶液中研究分子結(jié)構(gòu)并且是唯一可以使試樣不經(jīng)受任何破壞的結(jié)構(gòu)分析方法 目前核磁共振成象技術(shù)已能以活人為觀(guān)察對(duì)象 掃描身體中任何器官或組織的任何一個(gè)斷面的核磁共振參數(shù) 成為一種引人注目的癌癥早期診斷技術(shù) 第二節(jié)NMR測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu) 核磁共振技術(shù) NMR 1946年美國(guó)斯坦福大學(xué)的F Bloch和哈佛大學(xué)的E M Purcell兩個(gè)研究小組首次獨(dú)立觀(guān)察到核磁共振現(xiàn)象 為此他們兩人獲1952年諾貝爾物理獎(jiǎng) 1983年 瑞士科學(xué)家KurtW thrich教授實(shí)驗(yàn)室首次運(yùn)用核磁共振方法解析了胰高血糖素 glucagon 多肽的溶液構(gòu)象 發(fā)明了利用核磁共振 NMR 技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)的方法獲得了2002年度諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 74歲的美國(guó)科學(xué)家保羅 勞特布爾和70歲的英國(guó)科學(xué)家彼得 曼斯菲爾德為2003諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)的得主 NMR基本原理 核磁共振 NuclearMagneticResonance 就是處于某個(gè)靜磁場(chǎng)中的自旋核系統(tǒng)受到相應(yīng)頻率的射頻磁場(chǎng)作用時(shí) 共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過(guò)程 核磁共振波譜儀 核磁共振波譜是測(cè)量原子核對(duì)射頻輻射 約4 600MHz 的吸收 這種吸收只有在高磁場(chǎng)中才能產(chǎn)生 15 核磁共振波譜儀 核磁共振波譜儀 1 永久磁鐵 提供外磁場(chǎng) 要求穩(wěn)定性好 均勻 不均勻性小于六千萬(wàn)分之一 掃場(chǎng)線(xiàn)圈 2 射頻振蕩器 線(xiàn)圈垂直于外磁場(chǎng) 發(fā)射一定頻率的電磁輻射信號(hào) 60MHz或100MHz 3 射頻信號(hào)接受器 檢測(cè)器 當(dāng)質(zhì)子的進(jìn)動(dòng)頻率與輻射頻率相匹配時(shí) 發(fā)生能級(jí)躍遷 吸收能量 在感應(yīng)線(xiàn)圈中產(chǎn)生毫伏級(jí)信號(hào) 4 樣品管 外徑5mm的玻璃管 測(cè)量過(guò)程中旋轉(zhuǎn) 磁場(chǎng)作用均勻 如果一個(gè)人知道了一間房子的所有尺寸 就可以畫(huà)出房子的三維圖形 同樣 如圖所示 通過(guò)測(cè)量蛋白質(zhì)中的大量的短距離 就可以畫(huà)出其結(jié)構(gòu)的三維圖像 瑞士科學(xué)家?guī)鞝柼?維特里希則發(fā)明了 利用核磁共振技術(shù)測(cè)定溶液中生物大分子三維結(jié)構(gòu)法 這種方法的優(yōu)點(diǎn)是可對(duì)溶液中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析 進(jìn)而可對(duì)活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析 能獲得 活 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 其意義非常重大 這種方法的原理可以用測(cè)繪房屋的結(jié)構(gòu)來(lái)比喻首先選定一座房屋的所有拐角作為測(cè)量對(duì)象 然后測(cè)量所有相鄰拐角間的距離和方位 據(jù)此就可以推知房屋的結(jié)構(gòu) 維特里希選擇生物大分子中的質(zhì)子 氫原子核 作為測(cè)量對(duì)象 連續(xù)測(cè)定所有相鄰的2個(gè)質(zhì)子之間的距離和方位 這些數(shù)據(jù)經(jīng)計(jì)算機(jī)處理后就可形成生物大分子的三維結(jié)構(gòu)圖 核磁共振法中幾個(gè)常用的參數(shù) 化學(xué)位移耦合常數(shù)NOE 核歐沃豪斯效應(yīng) 信號(hào)強(qiáng)度譜峰面積弛豫時(shí)間 1 化學(xué)位移 值越大 表示屏蔽作用越小 吸收峰出現(xiàn)在低場(chǎng) 值越小 表示屏蔽作用越大 吸收峰出現(xiàn)在高場(chǎng) 2 耦合常數(shù) 核與核之間以?xún)r(jià)電子為媒介相互耦合引起譜線(xiàn)分裂的現(xiàn)象稱(chēng)為自旋裂分 由于自旋裂分形成的多重峰中相鄰兩峰之間的距離被稱(chēng)為自旋 自旋耦合常數(shù) 用J表示 耦合常數(shù)用來(lái)表征兩核之間耦合作用的大小 J耦合常數(shù)大小主要與連接兩個(gè)核的化學(xué)鍵數(shù)目有關(guān) 與影響標(biāo)量耦合核之間電子云分布的因素有關(guān) 3 NOE信號(hào)強(qiáng)度 當(dāng)分子內(nèi)有兩個(gè)空間距離小于0 5nm的原子核時(shí) 如果用雙共振法照射其中一個(gè)核 使干擾場(chǎng)的強(qiáng)度增加到剛使被干擾的譜線(xiàn)達(dá)到飽和 則另一個(gè)靠近的原子核的共振信號(hào)就會(huì)增加 這種現(xiàn)象稱(chēng)核歐沃豪斯效應(yīng) NOE 4 譜峰面積 譜峰面積和分子中同一化學(xué)環(huán)境的原子核數(shù)目的多少成正比 因此峰面積的積分值可用來(lái)做定量分析的基礎(chǔ) 5 弛豫時(shí)間 原子核從激化的狀態(tài)回復(fù)到平衡排列狀態(tài)的過(guò)程叫弛豫過(guò)程 它所需的時(shí)間叫弛豫時(shí)間 自旋晶格弛豫 處于高能態(tài)的氫核 把能量轉(zhuǎn)給周?chē)姆肿?回到低能態(tài) 自旋 自旋弛豫 兩個(gè)進(jìn)動(dòng)頻率相同 進(jìn)動(dòng)取向不同的磁性核 在一定距離內(nèi)時(shí) 它們相互交換能量 改變進(jìn)動(dòng)方向 二維核磁共振 2DNMR NMR可獲得分子內(nèi)各核的化學(xué)環(huán)境 核間的耦合關(guān)系 空間構(gòu)象等信息 但是當(dāng)分子較大的時(shí)候 由于裂分譜線(xiàn)間的重疊 因此在測(cè)定了同一種核的一維譜之后 需要了解兩種或三種不同核之間的聯(lián)系關(guān)系 如C H N H等就需要用到2DNMR 它是2個(gè)頻率變量的函數(shù) 吸收峰對(duì)2個(gè)頻率變量作圖 1H 1HCOSY 1H 15NHSQC 多維核磁共振 1H 13C 15N核之間的化學(xué)鍵連接來(lái)得到核磁共振相關(guān)信號(hào) CBCANH HNCO HCCH COSY 核磁共振本身不能展示樣體的內(nèi)部結(jié)構(gòu) 要得到內(nèi)部的圖像 就要將不同梯度的磁場(chǎng)加以結(jié)合 即改變穿過(guò)樣本的磁場(chǎng)強(qiáng)度 這樣就有無(wú)數(shù)二維的圖像 彼此重疊后就得到樣本內(nèi)部空間的三維圖像 核磁共振技術(shù)的應(yīng)用 早期核磁共振主要用于對(duì)核結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的研究 如測(cè)量核磁矩 電四極距 及核自旋等后來(lái)廣泛應(yīng)用于分子組成和結(jié)構(gòu)分析 生物組織與活體組織分析 病理分析 醫(yī)療診斷 產(chǎn)品無(wú)損監(jiān)測(cè)等方面 1985年 維特里希等人公布了第一次利用NMR法測(cè)定的溶液中蛋白質(zhì) 蛋白酶抑制劑IIA proteinaseinhibitorIIA 的結(jié)構(gòu) NMR圖譜得到的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu) from 廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 NMR的非破壞性使得NMR譜圖可以確定完整生物大分子中某成分的存在和濃度從而與X Ray晶體衍射互為補(bǔ)充 核磁共振成像 基本原理 是將人體置于特殊的磁場(chǎng)中 用無(wú)線(xiàn)電射頻脈沖激發(fā)人體內(nèi)氫原子核 引起氫原子核共振 并吸收能量 在停止射頻脈沖后 氫原子核按特定頻率發(fā)出射電信號(hào) 并將吸收的能量釋放出來(lái) 被體外的接受器收錄 經(jīng)電子計(jì)算機(jī)處理獲得圖像 核磁共振測(cè)深 核磁共振測(cè)深是MRI技術(shù)在地質(zhì)勘探領(lǐng)域的延伸 通過(guò)對(duì)地層中水分布信息的探測(cè) 可以確定某一地層下是否有地下水存在 地下水位的高度 含水層的含水量和孔隙率等地層結(jié)構(gòu)信息 優(yōu)缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 可以在水溶液或有機(jī)相中研究生物大分子結(jié)構(gòu) 研究溶液條件的改變對(duì)生物大分子三維結(jié)構(gòu)的影響以及生物大分子內(nèi)部動(dòng)力學(xué)的特點(diǎn) 缺點(diǎn) 分辨率不高 目前 NMR只能用于測(cè)定小分子和中型蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) from 廈門(mén)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 NMR法測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的基本實(shí)驗(yàn)步驟 1 樣品制備 一般應(yīng)采用液態(tài)樣品 CCl4溶解2 一維NMR實(shí)驗(yàn)3 二維NMR實(shí)驗(yàn)4 三維NMR實(shí)驗(yàn)5 有的還要做四維NMR實(shí)驗(yàn) X 射線(xiàn)晶體衍射法 核磁共振波譜的關(guān)系NMR法一般只能解析相對(duì)較小的蛋白質(zhì) X 射線(xiàn)晶體衍射法適用于研究各種大小的蛋白質(zhì) 有些蛋白質(zhì)水溶性很差 卻很容易培養(yǎng)成晶體 另一些蛋白質(zhì)則水溶性很好 培養(yǎng)成晶體很困難 第三節(jié)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)測(cè)定的其他方法 X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)和核磁共振技術(shù)是當(dāng)前蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)測(cè)定的主要方法 但它們都存在一些不足 X射線(xiàn)晶體衍射技術(shù)要求蛋白質(zhì)是晶體存在狀態(tài) 而對(duì)一些柔性的 結(jié)構(gòu)復(fù)雜的生物大分子蛋白質(zhì)來(lái)說(shuō) 比較難以得到所需的晶體結(jié)構(gòu) 核磁共振技術(shù)能測(cè)出溶液狀態(tài)下分子量較小蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 但對(duì)分子量較大的蛋白質(zhì)的數(shù)據(jù)處理顯得比較復(fù)雜 因此 下面介紹一些其他測(cè)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的方法 現(xiàn)代光譜技術(shù)三維電鏡衍射技術(shù)動(dòng)力學(xué)全精研究技術(shù) 一 現(xiàn)代光譜技術(shù) 除傳統(tǒng)的紫外 可見(jiàn)差光譜法和熒光光譜法外 圓二色譜 激光拉曼光譜以及質(zhì)譜也在測(cè)定蛋白質(zhì)溶液構(gòu)象方面發(fā)揮著重要的作用 圓二色譜 CircularDichroism CD 圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的一種簡(jiǎn)單 快速而又較準(zhǔn)確的方法 圓二色譜是利用不對(duì)稱(chēng)分子對(duì)左 右圓偏振光吸光率的不同來(lái)分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu) 1969年 Greenfield用圓二色光譜數(shù)據(jù)估計(jì)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu) 此后 關(guān)于利用圓二色譜研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的報(bào)道逐漸增多 平面偏振光 圓偏振光和橢圓偏振光 平面偏振光 指振動(dòng)方向在同一平面內(nèi)的電磁波 圓偏振光 當(dāng)兩束振幅相等 互相垂直的偏振光位相相差1 4波長(zhǎng) 90 時(shí) 其合成矢量繞光傳播方向旋轉(zhuǎn)前進(jìn) 朝著光源方向觀(guān)察時(shí) 電場(chǎng)矢量E末端軌跡為圓形 所以稱(chēng)之為圓偏振光 電場(chǎng)矢量方向順時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)的稱(chēng)為右圓偏振光 逆時(shí)針?lè)较蛐D(zhuǎn)的則稱(chēng)左圓偏振光 橢圓偏振光 振幅不等的左 右圓偏振光合成 圓二色性和圓二色譜 圓二色性 當(dāng)左 右圓偏振光進(jìn)入物質(zhì)時(shí) 光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)它們的吸收不一樣 它們的差值就是圓二色性光學(xué)活性物質(zhì)分子對(duì)左 右圓偏振光的吸收不一樣 這種吸收差造成矢量振幅差 從介質(zhì)出來(lái)的光成為橢圓偏振光 用橢圓度或吸收差表示圓二色譜 指橢圓度 或比橢圓度等 與波長(zhǎng)的關(guān)系 它在本質(zhì)上與旋光色散譜是一樣的 圓二色譜的應(yīng)用 在分子生物學(xué)中 圓二色儀主要應(yīng)用于測(cè)定生物大分子的空間結(jié)構(gòu) 生物大分子很多是不對(duì)稱(chēng)的 即光學(xué)活性分子 通過(guò)圓二色譜測(cè)定和計(jì)算能夠了解生物大分子在溶液狀態(tài)下的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)或多肽是由氨基酸通過(guò)肽鍵連接而成的具有特定結(jié)構(gòu)的生物大分子 主要的光學(xué)活性生色基團(tuán)是肽鏈骨架中的肽鍵 芳香氨基酸殘基及二硫鍵 另外 有的蛋白質(zhì)輔基對(duì)蛋白質(zhì)的圓二色性有影響 肽鍵的不對(duì)稱(chēng)性使得它總有光活性 蛋白質(zhì)的圓二色性主要由活性生色基團(tuán)及折疊結(jié)構(gòu)兩方面圓二色性的總和 根據(jù)電子躍遷能級(jí)能量的大小 蛋白質(zhì)的CD光譜分為三個(gè)波長(zhǎng)范圍 1 250nm以下的遠(yuǎn)紫外光譜區(qū) 圓二色性主要由肽鍵的n 電子躍遷引起 遠(yuǎn)紫外CD主要應(yīng)用于蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的解析2 250 300nm的近紫外光譜區(qū) 主要由側(cè)鏈芳香基團(tuán)的 電子躍遷引起 近紫外CD主要揭示蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)信息3 300 700nm的紫外 可見(jiàn)光光譜區(qū) 主要由蛋白質(zhì)輔基等外在生色基團(tuán)引起 紫外 可見(jiàn)光CD主要用于輔基的偶合分析 肽鍵是高度有規(guī)律排列的 其排列的方向性決定了肽鍵能級(jí)躍遷的分裂情況 具有不同二級(jí)結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)或多肽所產(chǎn)生CD譜帶的位置 吸收的強(qiáng)弱都不相同 因此 根據(jù)所測(cè)得蛋白質(zhì)或多肽的遠(yuǎn)紫外CD譜 能反映出蛋白質(zhì)或多肽鏈二級(jí)結(jié)構(gòu)的信息 從而揭示蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu) 螺旋結(jié)構(gòu)在靠近192nm有一正的譜帶 在222和208nm處表現(xiàn)出兩個(gè)負(fù)的特征肩峰譜帶 折疊的CD光譜在216nm有一負(fù)譜帶 在185 200nm有一正譜帶 轉(zhuǎn)角在206nm附近有一正CD譜帶 而左手螺旋P2結(jié)構(gòu)在相應(yīng)的位置有負(fù)的CD譜帶 如上圖和表所示 CD數(shù)據(jù)擬合計(jì)算蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)的方法基本原理是假設(shè)蛋白質(zhì)在波長(zhǎng) 處的CD信號(hào) 是蛋白質(zhì)中或多肽各種二級(jí)結(jié)構(gòu)組分及由芳香基團(tuán)引起的噪音的線(xiàn)性加 fi i noise i是第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的CD信號(hào)值 fi為第i個(gè)二級(jí)結(jié)構(gòu)成分的含量分?jǐn)?shù) fi規(guī)定值為1 通過(guò)已知蛋白 或稱(chēng)參考蛋白 二級(jí)結(jié)構(gòu)的圓二色數(shù)據(jù)庫(kù) 曲線(xiàn)擬合未知蛋白或多肽的圓二色數(shù)據(jù) 估算未知蛋白或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)或多肽的二級(jí)結(jié)構(gòu)擬合計(jì)算方法中 主要采用多聚氨基酸為參考多肽 Greenfield等采用多聚L lys作參考多肽 建立 螺旋 折疊及無(wú)規(guī)卷曲等二級(jí)結(jié)構(gòu)參考CD光譜曲線(xiàn) 采用單一波長(zhǎng)法 208nm 計(jì)算出 螺旋含量后 然后假設(shè)不同的 折疊含量 X 值 并假設(shè)CD值是 螺旋含量 XH 折疊含量 X 無(wú)規(guī)卷曲 XR 三者貢獻(xiàn)值的加和 即 XH X XR 1 通過(guò)計(jì)算得到不同波長(zhǎng)的 得出計(jì)算曲線(xiàn) 假設(shè)一些不同的X 值 分別求出它們相應(yīng)的計(jì)算曲線(xiàn) 找出與實(shí)驗(yàn)曲線(xiàn)最接近的曲線(xiàn) 相應(yīng)于該最接近曲線(xiàn)的X 及XR即認(rèn)為是該蛋白質(zhì)的相應(yīng)結(jié)構(gòu)含量 Examplefit myoglobin 肌紅蛋白 Inthiscase qt xaqa xbqb xcqcfitsbestwithxa 80 xb 0 xc 20 agreeswellwithstructure78 helix 22 coil 激光拉曼光譜 激光拉曼光譜法是研究生物大分子結(jié)構(gòu) 動(dòng)力學(xué)及功能的重要手段 它在物理 化學(xué) 醫(yī)學(xué)及生物學(xué)等領(lǐng)域都有著十分重要的應(yīng)用價(jià)值 在蛋白質(zhì)等結(jié)構(gòu)研究方面 拉曼光譜分析可以提供大量的信息 促進(jìn)蛋白質(zhì)等生物大分子研究進(jìn)展 1928年 印度物理學(xué)家拉曼 Raman 發(fā)現(xiàn)了拉曼光譜 同時(shí)期的蘇聯(lián)物理學(xué)家蘭斯伯格 G Landsberg 也獨(dú)立地發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象 從那時(shí)起 拉曼光譜逐漸發(fā)展成為一個(gè)分析物質(zhì)結(jié)構(gòu)的有力工具 然而由于拉曼光譜技術(shù)強(qiáng)度很弱 時(shí)間較長(zhǎng) 測(cè)定有色物質(zhì)和發(fā)光樣品存在困難等缺陷 給其應(yīng)用帶來(lái)了很大困難 故在后來(lái)很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)發(fā)展比較緩慢 曾一度有被紅外光譜取代的趨勢(shì) 直到1960年激光出現(xiàn)以后 由于激光具有高亮度 單色性和方向性好以及高偏振度等特點(diǎn) 非常適合作為拉曼光譜的激發(fā)光源 因而迅速為科研工作者所利用 質(zhì)譜 massspectrometry MS 自美國(guó)科學(xué)家JohnB Fenn和日本學(xué)者田中耕一 Koichi Tanaka 發(fā)明了對(duì)生物大分子進(jìn)行確認(rèn)和結(jié)構(gòu)分析的質(zhì)譜分析法以來(lái) 隨著生命科學(xué)及生物技術(shù)的迅速發(fā)展 生物質(zhì)譜目前已成為有機(jī)質(zhì)譜中最活躍 最富生命力的前沿研究領(lǐng)域之一 生物質(zhì)譜的發(fā)展使人類(lèi)基因組計(jì)劃及其后基因組計(jì)劃得以提前完成 對(duì)其實(shí)施也起著重要的推動(dòng)作用 質(zhì)譜分析法在研究生物大分子特別是蛋白質(zhì)方面已發(fā)展成為主要的技術(shù)手段之一 在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中占據(jù)著十分重要的地位 質(zhì)譜分析基本原理 質(zhì)譜分析是將樣品轉(zhuǎn)化為運(yùn)動(dòng)的氣態(tài)帶電離子 于磁場(chǎng)中按質(zhì)荷比 m z 大小分離并記錄的分析方法 其過(guò)程可簡(jiǎn)單描述為 離子源轟擊樣品 帶電荷的碎片離子 電場(chǎng)加速 zeU 獲得動(dòng)能 mv2 磁場(chǎng)分離 檢測(cè)器記錄其中 z為電荷數(shù) e為電子電荷 U為加速電壓 m為碎片質(zhì)量 v為電子運(yùn)動(dòng)速度 質(zhì)譜分析 MS 的特點(diǎn) MS用于生物大分子的研究具有以下優(yōu)點(diǎn) 高靈敏度易操作性準(zhǔn)確性快速性很好的普適性高靈敏度能為亞微克級(jí)試樣提供信息 可以有效地與色譜聯(lián)用 適用于復(fù)雜體系中痕量物質(zhì)的鑒定或結(jié)構(gòu)測(cè)定 質(zhì)譜分析的方法 近年來(lái)出現(xiàn)的較成功地用于生物大分子質(zhì)譜分析的軟電離技術(shù)主要有下列幾種 電噴霧電離質(zhì)譜基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)譜快原子轟擊質(zhì)譜離子噴霧電離質(zhì)譜大氣壓電離質(zhì)譜在這些技術(shù)中 以前面三種近年來(lái)研究得最多 應(yīng)用得也最廣泛 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析 質(zhì)譜分析目前主要測(cè)定一級(jí)結(jié)構(gòu) 包括分子量 肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置 肽和蛋白的質(zhì)譜測(cè)序具有速度快 用量少 易操作等優(yōu)點(diǎn) 使它非常適合現(xiàn)代科研工作的要求 蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析原理為 通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為氣相離子 然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng) 磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值 M Z值 的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái) 經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子 確定離子的M Z值 分析鑒定未知蛋白質(zhì) 蛋白質(zhì)的質(zhì)譜分析方法 MS用于多肽和蛋白質(zhì)測(cè)序可分為三種方法 第一種方法稱(chēng)為蛋白圖譜 proteinmapping 它是使用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白切成小的片段 然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽的分子量 將所得肽譜數(shù)據(jù)輸入數(shù)據(jù)庫(kù) 搜索與之相對(duì)應(yīng)的已知蛋白 從而獲取待測(cè)蛋白序列 第二種方法是利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)離子 通過(guò)分析相鄰?fù)M類(lèi)型峰的質(zhì)量差 識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基 第三種方法稱(chēng)為梯狀測(cè)序 laddersequencing 是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從 端或 端逐一降解下氨基酸殘基 形成相互間差一個(gè)氨基酸殘基的系列肽 再經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè) 由相鄰峰的質(zhì)量差可知相應(yīng)氨基酸殘基 質(zhì)譜中主要出現(xiàn)的離子有四種 即分子離子 碎片離子 同位素離子和亞穩(wěn)離子 分子離子分子在離子源中失去一個(gè)電子形成的離子 在質(zhì)譜圖中 分子離子對(duì)應(yīng)的峰稱(chēng)分子離子峰 特點(diǎn) 分子離子含奇數(shù)個(gè)電子 分子離子峰出現(xiàn)在質(zhì)譜圖的最右側(cè) 作用 根據(jù)分子離子的質(zhì)荷比可確定分子量及分子式 碎片離子 分子離子中的某個(gè)化學(xué)鍵斷裂而形成的離子 有些碎片離子獲得能