登革熱檢測方法.doc

附件1：免疫熒光法（IFA）檢測IgG抗體試驗(yàn)材料：（1）DV14型抗原片：DV標(biāo)準(zhǔn)毒株感染C6/36或BHK21細(xì)胞制備，低溫干燥保存；（2）對照：登革熱患者恢復(fù)期血清（陽性對照），非登革熱患者血清陰性對照）；（3）羊抗人（或兔抗人）IgG熒光素標(biāo)記抗體；（4）常用稀釋液：pH7.27.4PBS、伊文思蘭等；（5）熒光顯微鏡。檢測步驟：（1）用pH7.4，0.02mol/LPBS稀釋待檢血清，從1：20開始做4倍連續(xù)稀釋至需要的稀釋度。（2）取出抗原片，用蒸餾水漂洗后，冷風(fēng)吹干。（3）用加樣器依次從高稀釋度到低稀釋度逐個(gè)加入已稀釋的待檢血清，加入量以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)（若為雙份血清，最好上排為急性期血清，下排為恢復(fù)期血清），在37水浴箱濕盒孵育30分鐘（每次試驗(yàn)設(shè)陽、陰性對照）。（4）用PBS震蕩洗滌3次，每次5分鐘，再用蒸餾水洗滌1次脫鹽，冷風(fēng)吹干。（5）用含1：3萬的伊文思蘭PBS按工作濃度稀釋熒光結(jié)合物，滴加各孔（以覆蓋細(xì)胞抗原面為準(zhǔn)），在37水浴箱濕盒孵育30分鐘，然后同（4）洗滌、漂洗、吹干。（6）熒光顯微鏡觀察結(jié)果。 結(jié)果判斷：細(xì)胞內(nèi)病毒特異性熒光為黃綠色顆粒，分布在感染細(xì)胞的胞漿內(nèi)。根據(jù)特異性熒光顆粒多少、熒光亮度、陽性細(xì)胞在細(xì)胞總數(shù)中所占比例，可將免疫熒光反應(yīng)大致區(qū)分為14個(gè)“”。檢測抗體滴度時(shí)，以能觀察到明顯特異性熒光反應(yīng)（“”）最高血清稀釋度的倒數(shù)表示。意義：陽性結(jié)果，表明曾受到DV感染，1：80有診斷參考意義；恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診。附件2：酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測單份和/或雙份血清IgG抗體試驗(yàn)材料：（1）抗原：陽性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對照。（2）辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG抗體；（3）緩沖液：包被液：pH9.6碳酸緩沖液；稀釋液：pH7.4PBS（含5%脫脂奶）洗滌液：pH7.4PBST（0.05吐溫20）；（4）顯色液：A/B液（5）終止液：4NH2SO4（6）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。檢測步驟：（1）用包被液按工作濃度稀釋抗原，100l/孔，4過夜；（2）棄去包被液，用PBS-T重復(fù)洗滌35次，甩干；（3）將待檢血清用稀釋液從1：100開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入抗原孔，100l/孔，同時(shí)設(shè)陰、陽性對照，37水浴1小時(shí)；（4）棄去血清，用洗滌液洗滌56次；（5）加酶結(jié)合物，用稀釋液按工作濃度稀釋，100l/孔，37水浴1小時(shí)；（6）棄去酶標(biāo)抗體，用洗滌液洗滌6次，甩干；（7）加顯色液：于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；（8）加終止液于每反應(yīng)孔，100l/孔。結(jié)果判斷：于450nm（TMB）陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N2.1，對照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對照孔OD比值2.1，則標(biāo)本為登革熱IgG抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）意義：陽性結(jié)果，表明曾受到DV感染，1：100有診斷參考意義；恢復(fù)期血清抗體滴度比急性期抗體滴度有4倍或4倍以上升高則可確診。附件3：IgM捕捉ELISA法（MacELISA）檢測登革熱IgM抗體試驗(yàn)材料：（1）抗原：陽性抗原：采用C6/36細(xì)胞感染登革病毒培養(yǎng)物為陽性抗原。陰性抗原：未接種病毒的正常C6/36細(xì)胞為陰性抗原對照。（2）抗人IgM（鏈）單克隆抗體或多克隆抗體；（3）登革病毒IgM陽性、陰性對照血清；（4）辣根過氧化物酶標(biāo)記登革病毒單克隆抗體；（5）緩沖液：洗滌液：pH7.4PBST（0.05吐溫20）；稀釋液：pH7.4PBS（5牛血清）；封閉液：pH9.6碳酸緩沖液（1牛血清白蛋白）；（6）顯色液：A/B液（7）終止液：4NH2SO4（8）酶標(biāo)板、酶標(biāo)儀。檢測步驟：（1）用稀釋液按效價(jià)稀釋抗人鏈單克隆抗體，100l/孔，加蓋，4過夜；（2）棄去抗人鏈，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加封閉液，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；（3）棄封閉液，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干。（4）將待檢血清用稀釋液從1：10開始作2或4倍連續(xù)稀釋，加入酶標(biāo)板孔中，100l/孔，同時(shí)加入已1：10稀釋的陽性血清、陰性血清對照各4孔，100l/孔，置37水浴孵育2小時(shí)；（5）棄去血清，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，分別加4個(gè)型DV抗原及陰性抗原對照，100l/孔，4過夜；（6）棄抗原，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，加用稀釋液稀釋至工作濃度的相應(yīng)的登革熱酶標(biāo)單克隆抗體，正常抗原加4個(gè)型混合的酶標(biāo)單克隆抗體，100l/孔，37水浴2小時(shí)；（7）棄去標(biāo)記物，用洗滌液重復(fù)洗3次，甩干，于各反應(yīng)孔內(nèi)加A/B液各一滴，37，避光35分鐘；（8）加終止液于每反應(yīng)孔，一滴/孔。結(jié)果判斷：（1）目測方法：陽性對照孔呈明顯藍(lán)色，陰性對照孔呈無色，對照成立；若待檢血清孔呈明顯淡藍(lán)色或深藍(lán)色（TMB），則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽性，反之陰性。（2）酶聯(lián)免疫檢測儀檢測：于450nm（TMB）陽性對照孔OD值/陰性對照孔OD值，即P/N2.1，對照成立；若待檢血清孔OD值與陰性對照孔OD比值2.1，則標(biāo)本為登革熱IgM抗體陽性，反之陰性。（陰性對照孔OD值小于0.05按0.05記，若大于0.05按實(shí)際數(shù)值計(jì)算）意義：陽性結(jié)果，表明患者新近DV感染，用于登革熱早期診斷。附件4：C6/36（或BHK21）細(xì)胞分離登革熱病毒標(biāo)本：（1）患者血清：無菌采集發(fā)病后5日內(nèi)登革患者靜脈血3ml，分離血清，接種細(xì)胞培養(yǎng)；不能及時(shí)接種細(xì)胞者可置-70保存。污染的血清要加雙抗（青霉素、鏈霉素，終濃度各1000U/ml），42小時(shí)處理后接種細(xì)胞。（2）尸檢材料：腦、肝等。（3）蚊：采集吸過血的伊蚊或其它可疑媒介蚊，用0.5mol/L（10）葡萄糖液喂養(yǎng)，至胃血完全消化后置-70保存，死后按蚊種及捕獲地點(diǎn)分組，510只/組，生理鹽水沖洗數(shù)次后，用研磨器研碎，每組加0.5mlHanks液，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘，取上清加雙抗（青霉素、鏈霉素，終濃度各1000U/ml），4過夜，備用。病毒分離：將培養(yǎng)好的單層細(xì)胞上清棄掉，用Hanks液洗滌2遍，接種用Hanks液稀釋成10-1的患者血清0.1ml或組織懸液或蚊懸液0.2ml。C6/36細(xì)胞在28吸附1小時(shí)，BHK21細(xì)胞在37吸附1小時(shí)，補(bǔ)加維持液，C6/36細(xì)胞在28培養(yǎng)，BHK21細(xì)胞在37培養(yǎng)。第二天開始觀察細(xì)胞病變情況。一般BHK21細(xì)胞4天左右出現(xiàn)病變，C6/36細(xì)胞需要在28培養(yǎng)7天。如果沒有細(xì)胞病變，則盲傳3代（每次取細(xì)胞懸液0.1ml）接種細(xì)胞傳代。按附件6進(jìn)行鑒定。附件5：乳鼠分離登革熱病毒標(biāo)本：同附件4。病毒分離：（1）每一檢材接種一窩12日齡乳鼠，腦內(nèi)接種0.01ml/只。接種后48小時(shí)內(nèi)死亡者按非特異性死亡處理，棄去。（2）存活者觀察10天，若仍未發(fā)病，則解剖其中2只，取腦，用pH8.0肉湯制成10懸液，盲傳一窩12日齡乳鼠，存活鼠和盲傳鼠均觀察到第4周，未發(fā)病為陰性結(jié)果；（3）在觀察期內(nèi)發(fā)病（活動(dòng)力降低、站立不穩(wěn)、肢體抽搐、不全麻痹等癥狀）者，解剖，取半邊腦，按盲傳法制成10懸液，接種一窩12日齡乳鼠，并作無菌試驗(yàn)；另半邊腦置5.43mol/L（50%）甘油緩沖液中低溫保存。無菌試驗(yàn)陰性而重復(fù)以上癥狀者作為可以毒種傳代、保存，并按附件6進(jìn)行鑒定。附件6：免疫熒光法檢測DV抗原材料：（1）細(xì)胞抗原片的制備：出現(xiàn)“”細(xì)胞病變的C6/36細(xì)胞或BHK21細(xì)胞倒去維持液（若盲傳無細(xì)胞病變出現(xiàn)，仍然按此方法制備），用pH7.2PBS洗滌2次，加PBS用滴管把細(xì)胞從管壁上吹下，吹散，2000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去PBS，沉渣用0.2mlPBS吹散，滴加在抗原片上，吹干，冷丙酮固定10分鐘，PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干，-20保存?zhèn)溆茫唬?）腦、肝組織片：冷凍切片機(jī)切片，吹干，冷丙酮固定10分鐘，PBS沖洗2次，蒸餾水漂洗1次，吹干，-20保存?zhèn)溆?；?）熒光標(biāo)記單克隆抗體；（4）熒光顯微鏡。方法：（1）制備的抗原片或組織片，吹干，按順序滴加4個(gè)型的熒光標(biāo)記單克隆抗體，2孔/型，對照2孔（加PBS），置濕盒內(nèi)37水浴30分鐘；（2）取出，用PBS沖洗3次，蒸餾水漂洗1次，吹干；（3）熒光顯微鏡觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：特異性免疫熒光呈黃綠色顆粒，分布在胞漿中，正常組織細(xì)胞呈橙紅色或暗紅。意義：從病人血清、組織或蚊媒中分離出DV或查到抗原，可確診DV感染和病毒型別。附件7：RT-PCR檢測DV基因及分型材料：（1）附件6和分離的DV（2）引物：（供參考）引物 序列（53） 靶序列（基因）片段（bp）14通用引物）GTGCACACATTGACAGAACANS1 539 ）CTTTCTATCCAATAACCCAT型特異性引物 DEN-1）GGACTGCGTATGGAGTTTTG E-NS1490 ）ATGGGTTGTGGCCTAATCAG DEN-2）GTTCCTCTGCAAACACTCCA E230 ）GTGTTATTTTGAGTTTCCTTG DEN-3）GTGCTTACACAGCCCTGTTT E-NS1320 ）TCCATTCTCCCAATCTCCTG DEN-4）CCATTATGGCTGTGTTGTTT NS2a-NS2b398 ）CTTCATCCTGCTTCACTTCT方法：（1）病毒RNA的提?。翰捎肨RIzol按說明提取，制備模板RNA；（2）逆轉(zhuǎn)錄、合成cDNA：采用Super Scrip TMII或AMV逆轉(zhuǎn)錄酶，按說明書進(jìn)行；（3）PCR擴(kuò)增：反應(yīng)條件為95預(yù)