生產(chǎn)管理知識(shí)_谷氨酸生產(chǎn)菌培訓(xùn)課件

任務(wù)1 2谷氨酸生產(chǎn)菌 1 2 3 4 谷氨酸生產(chǎn)菌 國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較 谷氨酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中的形態(tài)變化 谷氨酸發(fā)酵的代謝控制育種策略 5 6 菌種的擴(kuò)大培養(yǎng)及種子的質(zhì)量要求 菌種的保藏與復(fù)壯 一 谷氨酸生產(chǎn)菌種類與特征 一 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌的分類 現(xiàn)有谷氨酸生產(chǎn)菌主要是棒狀桿菌屬 短桿菌屬 小桿菌屬及節(jié)桿菌屬中的細(xì)菌 1 棒狀桿菌屬 Corynebacterium 直到微彎的桿菌 一端膨大呈棒狀 折斷分裂形成 八 字形或柵狀排列 葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸 G 2短桿菌屬 Brevibacterium 短的不分枝直桿菌 多數(shù)從葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸 不發(fā)酵乳糖 G 3小桿菌屬 Microbacterium 形態(tài)與棒狀桿菌相似 發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)酸弱 主要產(chǎn)乳酸 G 4節(jié)桿菌屬 Arthrobacterium 培養(yǎng)過程中 細(xì)胞形態(tài)變化較大球菌桿菌 桿菌球菌 G G G G 能液化明膠 從碳水化合物產(chǎn)酸極少或不產(chǎn)酸 二 谷氨酸生成菌的主要特征 1 細(xì)胞形態(tài)球形 棒狀以及短桿狀 2 G 無芽孢 無鞭毛 不能運(yùn)動(dòng) 3 需氧型 生物素缺陷型微生物 4 脲酶強(qiáng)陽性 5 不分解淀粉 纖維素 油脂 酪蛋白以及明膠 6 發(fā)酵中菌體發(fā)生明顯的形態(tài)變化 同時(shí)發(fā)生細(xì)胞膜滲透性的變化 7 CO2固定反應(yīng)酶系活力強(qiáng) 8 異檸檬酸裂解酶活力弱 乙醛酸循環(huán)弱 9 酮戊二酸氧化能力微弱 10 NADPH2進(jìn)入呼吸鏈能力弱 11 檸檬酸合成酶 烏頭酸梅 異檸檬酸脫氫酶以及谷氨酸脫氫酶活力強(qiáng) 12 能利用醋酸 不能利用石蠟 13 具有向環(huán)境中泄露谷氨酸的能力 14 不分解利用谷氨酸 并能耐高濃度的谷氨酸 產(chǎn)谷氨酸5 以上 二 國內(nèi)谷氨酸生產(chǎn)菌特性比較 1 形態(tài)特征短桿至小棒狀 有時(shí)微彎曲 兩端鈍圓 不分枝 呈多種形態(tài) 單個(gè) 成對及 V 字形排列 G 胞內(nèi)有橫隔 不運(yùn)動(dòng) 無芽孢 一 北京棒桿菌 AS1299 的形態(tài)和生理特征 2 培養(yǎng)特征 普通肉汁瓊脂平板 菌落圓形 24h白色 48h淡黃色 中央隆起 表面濕潤 光滑 有光澤 邊緣整齊且呈半透明狀 無黏性 不產(chǎn)生水溶性色素 3 生理特征 對氧的要求 好氧及兼性厭氧 與溫度的關(guān)系 菌株26 37 培養(yǎng)生長良好 不耐高溫 41 生長較弱 pH的影響 Ph5 10均能生長 最適pH6 7 5 還原硝酸鹽 反映強(qiáng)烈 石蕊牛奶培養(yǎng) 7d后微產(chǎn)堿 不水解淀粉 不分解纖維素 對尿素的耐力 2 6 以上生長受抑制 脲酶試驗(yàn) 強(qiáng)陽性反應(yīng) 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麥芽糖迅速產(chǎn)酸 生長因素試驗(yàn) 生物素是必需生長因素 硫胺素明顯促生長 二 鈍齒棒桿菌 AS1542 的形態(tài)和生理特征 1 形態(tài)特征短桿至棒狀 有時(shí)微彎曲 兩端鈍圓 不分枝 單個(gè) 成對及 V 字形排列 折斷分裂 G 胞內(nèi)有橫隔 不運(yùn)動(dòng) 無芽孢 2 培養(yǎng)特征 普通肉汁瓊脂平板 菌落圓形 近草黃色 表面濕潤 光滑 無光澤 邊緣頓齒狀 較薄 半透明 無黏性 不產(chǎn)生水溶性色素 對氧的要求 兼性厭氧 與溫度的關(guān)系 菌株20 37 培養(yǎng)生長良好 不耐高溫 42 不生長 pH的影響 pH6 9生長良好 pH10生長微弱 pH4 5已不能生長 還原硝酸鹽 反映強(qiáng)烈 石蕊牛奶培養(yǎng) 7d后微產(chǎn)堿 水解淀粉 不分解纖維素 對尿素的耐力 2 6 以上生長受抑制 脲酶試驗(yàn) 強(qiáng)陽性反應(yīng) 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麥芽糖 水楊苷 七葉靈等迅速產(chǎn)酸 生長因素試驗(yàn) 生物素是必需生長因子 3 生理特征 三 天津短桿菌 T613 的形態(tài)和生理特征 典型的短桿狀 有時(shí)微彎曲 兩端稍鈍圓 不分枝 單個(gè) 成對及 V 字形排列 折斷分裂 G 不運(yùn)動(dòng) 無芽孢 1 形態(tài)特征 2 培養(yǎng)特征 普通肉汁瓊脂平板 菌落圓形 淺黃色 表面濕潤 光滑 隆起 邊緣整齊 較薄 半透明 無黏性 不產(chǎn)生水溶性色素 3 生理特征 對氧的要求 好氧及兼性厭氧 與溫度的關(guān)系 菌株26 37 培養(yǎng)生長良好 75 處理10min不再生長 pH的影響 pH6 10生長良好 pH5生長微弱 pH4和pH11已不能生長 還原硝酸鹽 反映強(qiáng)烈 不水解淀粉 不分解纖維素 對尿素的耐力 5 以上生長受抑制 脲酶試驗(yàn) 強(qiáng)陽性反應(yīng) 產(chǎn)酸物質(zhì)的測定 G 果糖 甘露糖 蔗糖 麥芽糖 水楊苷 七葉靈 生長因素試驗(yàn) 生物素是必需生長因子 硫胺素是促生長作用 四 北京棒桿菌 7338 與鈍齒棒桿菌 B9 的比較 后提取容易 收率較高 質(zhì)量較好 分泌色素較多 2 5天津短桿菌 T613 與鈍齒桿菌 B9 的比較 T613感染噬菌體時(shí) 不能換用B9 調(diào)換7338 三 谷氨酸生產(chǎn)菌的篩選 什么是篩選 如何篩選 1 采樣在哪采 如何采 2 分離分離什么 3 初篩鑒別 4 復(fù)篩產(chǎn)量 5 發(fā)酵實(shí)驗(yàn) 黃色短桿菌 北京棒桿菌 桿狀細(xì)菌 四 菌種選育谷氨酸菌體的選育方法主要有五種 自然選育 誘變選育 雜交選育 代謝控制選育和基因工程選育 一 自然選育 以基因自發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ) 有利于谷氨酸產(chǎn)生菌保持純系良種 使谷氨酸生產(chǎn)具有相對穩(wěn)定性 提高發(fā)酵水平 缺點(diǎn) 菌體自身存在著修復(fù)機(jī)制和某些酶的校正作用 使得自發(fā)突變率極低 導(dǎo)致選育耗時(shí)長 工作量大 效率低 也稱自然分離 是指對微生物細(xì)胞群體不經(jīng)過人工處理而直接進(jìn)行篩選的育種方法 二 誘變選育 物理因素 紫外線 60Co X射線 射線 快中子 射線 射線 超聲波 He Ne激光輻照 離子束等 化學(xué)因素 氮芥 亞硝基胍 硫酸二乙酯 甲基磺酸乙酯 亞硝基甲基脲 亞硝酸 5 氟尿嘧啶 5 溴尿嘧啶等 其它因素 生物誘導(dǎo)因子 如噬菌體誘發(fā)抗性突變等 例 王歲樓 張一震 李志 谷氨酸高產(chǎn)菌TZ 310的誘變選育及其發(fā)酵的研究 中國調(diào)味品 1997年09期 摘要 以天津短桿菌 為出發(fā)菌株 經(jīng) 射線 紫外線和硫酸二乙酯復(fù)合誘變并經(jīng)高溫馴化 獲得一株琥珀酸和生物素雙營養(yǎng)缺陷型突變株 該菌株具有耐高糖 耐高谷氨酸 不分解利用 及耐高溫 的優(yōu)點(diǎn) 原生質(zhì)體融合就是將兩個(gè)親株的細(xì)胞壁分別通過酶解作用加以剝除 制得原生質(zhì)體或原生質(zhì)球 在高滲條件下混合 由聚乙二醇 PEG 助融 促使原生質(zhì)體凝集 融合 兩個(gè)基因組之間接觸 交換 遺傳重組 在再生細(xì)胞中獲得重組體 三 雜交育種 雜交育種 常規(guī)雜交 原生質(zhì)體融合 谷氨酸產(chǎn)生菌的前處理因?yàn)槠溆兄厥獾募?xì)胞壁結(jié)構(gòu) 對溶菌酶一般不敏感 方法 加入EDTA 乙二胺四乙酸 甘氨酸 青霉素和D 環(huán)絲氨酸等 這些物質(zhì)可以使細(xì)胞壁變得疏松 便于溶菌酶處理 如 李蒲興等將6株谷氨酸產(chǎn)生菌以甘氨酸 青霉素和溶菌酶的不同組合處理 對其原生質(zhì)體形成進(jìn)行比較 在最佳條件下 原生質(zhì)體形成率可達(dá)95 100 張蓓等以谷氨酸產(chǎn)生菌天津短桿菌T6 13為出發(fā)菌株 獲得了具有目的遺傳標(biāo)記寡霉素抗性 Orm 和氟乙酸抗性 FEAr 的突變株TN63和TN115 然后 分別以TN63和TN115為親株 通過原生質(zhì)體融合 獲得了具有Orm FEAr標(biāo)記的融合子FTN9108 其原生質(zhì)體融合頻率為2 6 10 3 Orm FEAr Orm FEAr OrmFEAr 四 代謝控制選育 以誘變育種為基礎(chǔ) 獲得各種解除或繞過微生物正常代謝途徑的突變株 從而人為地使有用產(chǎn)物選擇性地大量生成積累 Glu產(chǎn)生菌 誘變育種 突變株 代謝控制發(fā)酵 大量積累Glu 1 選育耐高糖 高谷氨酸的菌株 如選育在含20 30 葡萄糖的平板上生長良好的耐高糖突變株 在含15 20 味精的平板上生長良好的耐高谷氨酸突變株 在20 的葡萄糖加15 味精的平板上生長良好的耐高糖 耐高谷氨酸的菌株 2 選育能強(qiáng)化谷氨酸合成代謝 削弱或阻斷支路代謝的菌株 1 選育不分解利用谷氨酸的突變株 選育在以谷氨酸為唯一碳源培養(yǎng)基上不長或生長微弱的突變株 谷氨酸 谷氨酰胺 鳥氨酸 瓜氨酸 精氨酸 2 選育強(qiáng)化CO2固定反應(yīng)的突變株 a 選育以琥珀酸或蘋果酸為唯一碳源 生長良好的菌株 因?yàn)榧?xì)胞內(nèi)碳代謝必須走四碳二羧酸的脫羧反應(yīng) 該反應(yīng)與C02固定反應(yīng)是相同酶所催化 C02固定反應(yīng)相應(yīng)地加強(qiáng) b 選育氟丙酮酸敏感突變株 因?yàn)榉崾潜崦摎涿傅囊种苿?即抑制丙酮酸向乙酰CoA轉(zhuǎn)化 相應(yīng)地CO2固定反應(yīng)加強(qiáng) 突變株對氟丙酮酸越敏感 效果越理想 c 選育減弱乙醛酸循環(huán)的突變株 乙醛酸循環(huán)減弱不僅能使C02固定反應(yīng)比例增大 而且異檸檬酸也能高效率地轉(zhuǎn)化為 酮戊二酸 再生成谷氨酸 常見的該突變株有琥珀酸敏感型突變株和不分解利用乙酸的突變株 3 選育解除谷氨酸對谷氨酸脫氫酶反饋調(diào)節(jié)的突變株 有酮基丙二酸抗性突變株 谷氨酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株和谷氨酰胺抗性突變株 草酰乙酸 谷氨酸轉(zhuǎn)氨酶 天冬氨酸 酮戊二酸 谷氨酸 酮戊二酸NH3 谷氨酸脫氫酶 4 選育強(qiáng)化能量代謝的突變株 原因 使TCA循環(huán)前一段代謝加強(qiáng) 谷氨酸合成速率加快 a 選育呼吸鏈抑制劑抗性突變株如可選育丙二酸 氧化丙二酸 氰化鉀 氰化鈉抗性突變株來實(shí)現(xiàn) b 選育ADP磷酸化抑制劑抗性突變株如可選育2 4 二硝基酚 羥胺 砷 胍等抗性突變株來實(shí)現(xiàn) c 選育抑制能量代謝的抗生素的抗性突變株如可選育纈氨霉素 寡霉素等抗性突變株來實(shí)現(xiàn) 5 其它遺傳標(biāo)記 選育莽草酸缺陷型 抗嘌呤嘧啶類似物 抗核苷酸類抗生素 異亮氨酸缺陷 蛋氨酸缺陷 苯丙氨酸缺陷 AEC抗性 AHV抗性 棕櫚酰谷氨酸等突變株 都可以不同程度地提高谷氨酸產(chǎn)量 3 選育能提高谷氨酸通透性的菌株 1 選育生物素缺陷型菌株 2 選育油酸缺陷型菌株 3 選育甘油缺陷型菌株 4 選育溫度敏感型突變株 突變位置發(fā)生在決定與谷氨酸分泌有密切關(guān)系的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的基因上 發(fā)生堿基的轉(zhuǎn)換或顛換 一個(gè)堿基為另一個(gè)堿基所置換 這樣為基因所控制的酶在高溫下失活 導(dǎo)致細(xì)胞膜某些結(jié)構(gòu)的改變 另一個(gè)特點(diǎn)是在生物素豐富的培養(yǎng)基上也能分泌出谷氨酸 5 其它突變型菌株抗藥性 溶菌酶敏感型 二氨基庚二酸缺陷型 乙酸缺陷型 棕櫚酰谷氨酸敏感型突變株等 都能增強(qiáng)谷氨酸的通透性 五 基因工程選育 基因工程育種是指利用基因工程方法對產(chǎn)生菌株進(jìn)行改造而獲得高產(chǎn)工程菌 或者是通過微生物間的轉(zhuǎn)基因而獲得新菌種的育種方法 載體系統(tǒng) 一般以質(zhì)粒 噬菌體或轉(zhuǎn)座子作為載體 尤以質(zhì)粒為多 受體系統(tǒng) 受體菌選用短桿菌屬和棒桿菌屬的野生菌或變異株 供體菌株 供體菌株選擇短桿菌屬及棒桿菌屬的野生菌或變異株 工具酶 切割供體DNA和載體DNA的工具酶 限制性內(nèi)切核酸酶有許多種 Hind BclI XbaI和XamI效果最好 載體系統(tǒng)受體系統(tǒng)供體菌株工具酶 谷氨酸產(chǎn)生菌的許多關(guān)鍵酶的基因已被克隆 Ozaki等克隆了谷氨酸棒桿菌的分枝酸變位酶和預(yù)苯酸脫水酶基因 通過質(zhì)粒載體導(dǎo)回谷氨酸棒桿菌 產(chǎn)量提高了50 周盛等從大腸桿菌E colik 12中通過PCR克隆出磷酸果糖激酶編碼基因 pfkA 將其連到表達(dá)載體 連接構(gòu)建成重組質(zhì)粒pKu 1 轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌B4 并得到表達(dá) 酶活性測定表明pf kA基因表達(dá)活力為128 6 o 86u g的蛋白 同時(shí) 轉(zhuǎn)化子菌株對糖轉(zhuǎn)化率比B4高10 64 產(chǎn)酸率比B4高17 1 五 菌種保藏與復(fù)壯 保藏原理 挑選優(yōu)良品種 抑制微生物的代謝活性 創(chuàng)造休眠環(huán)境 保藏要求 保持菌種優(yōu)良特性 經(jīng)濟(jì)方便 保藏后使用前需再次檢測和確定保藏菌種的形態(tài)學(xué)和生化特征 如代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生 酶活力 遺傳特征及生化指標(biāo) 一 保藏方法 1 低溫冷凍保藏 2 轉(zhuǎn)接培養(yǎng)或斜面?zhèn)鞔２?3 礦物油保藏 4 土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏 1 低溫冷凍保藏 20 以下冷凍 使微生物代謝活動(dòng)停止 分類 普通冷凍保藏 20 超低溫冷凍保藏 60一 80 凍干保藏液氮冷凍保藏特點(diǎn) 簡單有效培養(yǎng)物運(yùn)輸較困難 超低溫冷凍保藏 60 80 超低溫冰箱的冷凍速度一般控制在1 2 min 一些細(xì)菌和真菌菌種可保藏5年而活力不受影響 凍干保藏是通過在減壓條件下使凍結(jié)的細(xì)胞懸液中的水分升華 使培養(yǎng)物干燥 此法是微生物菌種長期保藏的最為有效的方法之一 特點(diǎn) 凍干狀態(tài)下一般可保藏10年不喪失活力 凍干后的菌株可常溫保存 便于運(yùn)輸 必須使用冷凍保護(hù)劑 常用脫脂乳 蔗糖等 液氮冷凍保藏 此法除適宜于一般微生物的保藏外 對一些用冷凍干燥法都難以保存的微生物如支原體 衣原體 氫細(xì)菌 難以形成孢子的霉菌 噬菌體及動(dòng)物細(xì)胞均可長期保藏 而且性狀不變異 缺點(diǎn)是需要特殊設(shè)備 2 傳代保藏 斜面培養(yǎng)基 平行傳代 普通冰箱 三個(gè)月以下保存 供試驗(yàn)用 3 礦物油保藏 將瓊脂斜面培養(yǎng)物直立浸入礦物油中于4 6 下保藏 簡便有效 可用于絲狀真菌 酵母 細(xì)菌和放線菌的保藏 特別用于難以冷凍干燥的絲狀真菌和難以在固體培養(yǎng)基上形成孢子的擔(dān)子菌 保存時(shí)間1 2年 4 載體保藏 麥殼 砂土滅菌后可用作載體 培養(yǎng)好的微生物細(xì)胞或孢子用無菌水制成懸浮液 注入滅菌的沙土管中混合均勻 或直接將成熟孢子刮下接種于滅菌的沙土管中 使微生物細(xì)胞或孢子吸附在沙土載體上 將管中水分抽干后熔封管口或置干燥器中于4 6 或室溫進(jìn)行保存的一種菌種保藏方法 多用于產(chǎn)抗生素菌種 保藏時(shí)間2 10年 二 菌種衰退 衰退 菌種在培養(yǎng)或保藏過程中 由于自發(fā)突變的存在 出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化 遺傳標(biāo)記的丟失等現(xiàn)象 稱為菌種的衰退 衰退的表現(xiàn) 生長 代謝 產(chǎn)品 衰退的原因 保藏不妥 連續(xù)傳代 回復(fù)突變等防止衰退的方法 合理培養(yǎng)條件 減少傳代次數(shù)復(fù)壯 使衰退的菌種回復(fù)原來的性狀 純種分離 平板劃線 稀釋平板法 涂布法通過寄主體內(nèi)生長進(jìn)行復(fù)壯 對寄生性菌株淘汰已衰退個(gè)體 不良理化條件