蟲草液體菌種制作及質(zhì)量檢驗(yàn)方法.doc

蟲草液體菌種制作及質(zhì)量檢驗(yàn)方法（上） 2010年4月13日 來(lái)源：食用菌市場(chǎng)2009年第六期字號(hào) 大 中 小 蟲草液體菌種制作及質(zhì)量檢驗(yàn)方法（上）井大鵬 王明輝/文摘要：液體菌種是指菌絲體的純培養(yǎng)完全在液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)而成的菌種。應(yīng)用液體菌種進(jìn)行蟲草生產(chǎn)能顯著提高產(chǎn)量和質(zhì)量，便于工廠化和標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)。本文綜述了蟲草液體菌種的優(yōu)勢(shì)，制作及質(zhì)量檢驗(yàn)方法。關(guān)鍵詞：蟲草 液體菌種 培養(yǎng)液 檢驗(yàn)方法隨著國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)對(duì)蟲草產(chǎn)品需求的增加，蟲草生產(chǎn)方式由小戶型、季節(jié)性生產(chǎn)的模式逐漸向工廠化、標(biāo)準(zhǔn)化、周年化、規(guī)?；a(chǎn)發(fā)展。伴隨新技術(shù)、新工藝、新設(shè)備的研發(fā)問(wèn)世，采用深層培養(yǎng)工藝制備蟲草液體菌種已應(yīng)用于生產(chǎn)中。由于液體菌種具有成本低、生產(chǎn)周期短、菌齡一致、接種簡(jiǎn)便快捷、便于管理等優(yōu)點(diǎn)，因而深受蟲草栽培者的歡迎。一、蟲草液體菌種的生產(chǎn)方式一般可分為電磁攪拌法、搖瓶機(jī)法、簡(jiǎn)易深層發(fā)酵（吹氧）法、發(fā)酵罐法。1、電磁攪拌法。設(shè)備技術(shù)比較簡(jiǎn)單，投資較少，但生產(chǎn)量小，生產(chǎn)的液體菌種是菌絲團(tuán)。2、搖瓶機(jī)法。搖瓶機(jī)培養(yǎng)投資少，設(shè)備技術(shù)簡(jiǎn)單，管理方便，適合一般菌種廠生產(chǎn)使用，生產(chǎn)出來(lái)的液體菌種是菌球。3、簡(jiǎn)易深層發(fā)酵（吹氧）法 。 制作工序繁瑣、配套設(shè)備要求較高、各部件必須在無(wú)菌條件下進(jìn)行組裝，生產(chǎn)的液體菌種是菌球。4、發(fā)酵罐法 。 需要一整套的發(fā)酵設(shè)備，投資大，技術(shù)要求嚴(yán)格，只適用于工廠化的大規(guī)模生產(chǎn)，生產(chǎn)出來(lái)的液體菌種是菌球。二、蟲草液體菌種的培養(yǎng)方法通常采用搖瓶機(jī)法和簡(jiǎn)易深層發(fā)酵（吹氧）法來(lái)生產(chǎn)培養(yǎng)液體菌種。若小規(guī)模生產(chǎn)，一般可采用搖瓶機(jī)法培養(yǎng)液體菌種。本文主要介紹搖瓶機(jī)振蕩培養(yǎng)技術(shù)。1、 液體培養(yǎng)基配方（1）土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。（2）土豆30%（煮汁）、蠶蛹粉2%、蔗糖%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。（3）土豆20%、葡萄糖2%、玉米粉2%、黃豆粉1%、酵母膏0.2%、磷酸二氫鉀0.15%、硫酸鎂0.05%、水1000ml、pH值自然。（4）葡萄糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0.l%、磷酸二氫鉀 0.1%、硫酸鎂 0.05%、生長(zhǎng)素5ml、水1000ml、pH值自然。（5）葡萄糖2%、蛋白胨0.2 %、磷酸二氫鉀0.046 %、硫酸鎂0.05 %、磷酸氫二鉀0.1 %、水1000ml、pH值自然。（6）葡萄糖2%、蛋白胨0.4%、牛肉膏0.4%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05 %、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。（7）葡萄糖3%?、豆 粉2%、玉米粉1%、硫酸鎂？0.05%、磷酸二氫鉀0.1%、酵母粉0.5%、水1000ml、pH值自然。（8）葡萄糖2%、蛋白胨1%、酵母粉0.5%、玉米粉2%、磷酸二氫鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、水1000ml、pH值自然。（9）葡萄糖2%、黃豆粉1%、磷酸二氫鉀0.3%、硫酸鎂0.04%、氯化鈉（食鹽）0.03%、味精0.01%、維生素微量、水1000ml、 pH值自然。（10）蔗糖3%、天門冬酰胺0.1 %、磷酸二氫鉀0.125 %、硫酸鎂0.03 %、氯化鈉（食鹽）0.05 %、水1000ml、pH值自然。2、液體培養(yǎng)基的制作（1）按配比精確稱取各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。（2）配制溶液。為避免發(fā)生沉淀，可將各種營(yíng)養(yǎng)成分單獨(dú)溶解分別制成母液，加入的順序一般是先加緩沖化合物，溶解后加入主要元素，然后是微量元素，再加入維生素等。最好是每種成分完全溶解后，再加入第二種營(yíng)養(yǎng)成分。若各種成分均不發(fā)生沉淀，也可以一起加入。若用馬鈴薯、玉米粉、黃豆粉等原料時(shí)，應(yīng)先制取這些原料煮汁，然后再把煮汁與其它成分混合。例如：配方一液體培養(yǎng)基的配制。 土豆20%（煮汁）、葡萄糖2%、酵母膏0.5%、磷酸二氫鉀0.05%、硫酸鎂 0.05%、維生素B1 2片、水1000ml、pH值自然。（3）將新鮮土豆洗凈去皮、挖掉芽眼的土豆切成小塊放入小鍋或大燒杯中，加入一定量的水，用文火煮沸30分鐘左右，至土豆軟而不爛時(shí)，用68層布過(guò)濾，取濾汁于鍋中。（4）補(bǔ)水。 加水至10001200 ml。（5）按配方順序加入需加的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，文火煮510分鐘。（6）充分?jǐn)嚢杈鶆?，并調(diào)PH。一般用10HCl或10NaOH調(diào)pH，用pH試紙（或pH檢測(cè)儀）進(jìn)行測(cè)試。（7）沉淀分裝。 培養(yǎng)液配制好后，沉淀1小時(shí)取上清液，分裝入500mL容量的三角燒瓶中，每瓶裝量為100mL;750mL的瓶裝量為200mL;1000mL的瓶裝量為300mL，在配制培養(yǎng)液時(shí)，可加入0.02%的植物油或0.06%的泡敵（聚環(huán)氧丙烷甘油醚）作為消泡劑消泡，防止在培養(yǎng)過(guò)程中培養(yǎng)液產(chǎn)生氣泡。為了擊碎菌絲每瓶?jī)?nèi)加入510粒小玻璃珠。（8）塞棉塞 。棉塞松緊適度，不宜過(guò)緊。加棉塞后再包扎牛皮紙封口，這樣既可過(guò)濾空氣，避免雜菌侵入，又可減緩培養(yǎng)基水分的蒸發(fā)。（9）用記號(hào)筆注明培養(yǎng)液的名稱和日期。（10）滅菌 首先將內(nèi)層滅菌筒取出，再向外層鍋加入適量的水，使水面與三角擱架相平為宜。 放回滅菌桶，將包扎好的三角瓶直立放入滅菌桶內(nèi)，蓋上牛皮紙，三角瓶不要與桶壁接觸，以免冷凝水淋濕包口的紙而透入棉塞。加蓋，將蓋上的排氣軟管插入內(nèi)層滅菌桶的排氣槽內(nèi)。再以兩兩對(duì)稱的方式同時(shí)旋緊相對(duì)的兩個(gè)螺栓。 通電加熱，并同時(shí)打開排氣閥，使水沸騰排除鍋內(nèi)的冷空氣。待冷空氣完全排盡后，關(guān)上排氣閥，讓鍋內(nèi)的溫度隨蒸汽壓力增加而逐漸上升，在1.01.1kg/cm2壓力下，滅菌30分鐘。當(dāng)鍋內(nèi)壓力升到所需壓力時(shí)，控制熱源，維持壓力至所需時(shí)間。 滅菌所需時(shí)間到后，切斷電源，讓滅菌鍋內(nèi)溫度自然下降，當(dāng)壓力表的壓力降至0時(shí)，緩慢打開排氣閥，旋松螺栓，打開蓋子，取出滅菌物品。如果壓力未降到0時(shí)，打開排氣閥，就會(huì)因鍋內(nèi)壓力突然下降，使容器內(nèi)的培養(yǎng)液由于內(nèi)外壓力不平衡而沖出三角瓶，造成棉塞沾染培養(yǎng)液而發(fā)生污染。三、搖瓶機(jī)振蕩培養(yǎng)技術(shù)滅菌結(jié)束后，取出培養(yǎng)液冷卻到30以下時(shí)，在無(wú)菌條件下接入一塊約2厘米的斜面菌種，菌絲面向上懸浮于培養(yǎng)液液面。在2022條件下避光靜置培養(yǎng)48小時(shí)，再置往復(fù)式搖瓶機(jī)上振蕩培養(yǎng)，振蕩頻率為80120次/分，振幅6厘米10厘米。如果用旋轉(zhuǎn)式搖瓶機(jī)，振蕩頻率為200220轉(zhuǎn)分。搖瓶機(jī)室溫控制在2225，冬季室內(nèi)溫度低，可將搖瓶機(jī)放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間一般是在57天左右。四、蟲草液體菌種的檢驗(yàn)方法蟲草液體菌種進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)可采用感官檢查、顯微鏡檢查、空白培養(yǎng)基檢查和取樣測(cè)驗(yàn)等方法。采用電磁攪拌法培養(yǎng)或搖瓶機(jī)法培養(yǎng)液體菌種，終止培養(yǎng)后，常用目測(cè)法檢驗(yàn)，將三角瓶搖晃靜止后，如菌絲球均勻地分布于三角瓶中，培養(yǎng)液清澈、無(wú)異味，液體中懸浮著大量均勻的小菌絲球，并伴有蛹蟲草特有的香味，表示符合質(zhì)量要求。簡(jiǎn)易深層發(fā)酵（吹氧）法或發(fā)酵罐法大量生產(chǎn)液體菌種，為了更好地控制培養(yǎng)條件，達(dá)到優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的目的，就需要對(duì)培養(yǎng)液中的污染情況、菌絲活力、菌絲體含量、菌絲球數(shù)量、PH值、總糖及還原糖、氨基酸、溶氧系數(shù)等的變化進(jìn)行檢測(cè)?，F(xiàn)將有關(guān)的檢測(cè)方法介紹如下。（一） 感官檢查?？刹捎谩翱础⑿?、嗅”的步驟進(jìn)行檢查?？矗簩悠缝o置桌上觀察。一看菌液顏色和透明度，正常發(fā)酵醪液（培養(yǎng)液）一般呈白色或黃褐色，清澈透明，菌絲顏色因菌種的不同或菌種見(jiàn)光程度而異，老化后顏色變深；染雜菌的醪液則混濁不透明。醪液變混，有兩種可能性，一是細(xì)菌污染應(yīng)予以淘汰；二是由于菌絲生長(zhǎng)粘稠過(guò)大所致。若難以判斷，可進(jìn)行鏡檢。二看菌絲形態(tài)和大小，正常的菌絲大小一致，呈球狀、片狀、絮狀，菌絲粗壯，線條分明；而染雜菌后，菌絲纖細(xì)，輪廓不清。三看上清液與沉淀的比例，菌絲體占比例越大越好，較好的液體菌種，在瓶中所占比例可達(dá)80%左右。四看pH值指標(biāo)是否變色，在培養(yǎng)液中加入甲基紅或復(fù)合指標(biāo)劑，經(jīng)35天顏色改變，說(shuō)明培養(yǎng)液pH值到達(dá)5.0左右，為發(fā)酵點(diǎn)；如果在24小時(shí)內(nèi)即變色，說(shuō)明因雜菌快速生長(zhǎng)而使培養(yǎng)液酸度劇變。五看有無(wú)酵母線，如果在培養(yǎng)液與空氣交界處的瓶壁上有灰色條狀附著物，說(shuō)明為酵母菌污