實驗1 培養(yǎng)基的制備技術(shù)(講稿).doc

實驗1 培養(yǎng)基的制備與微生物接種技術(shù)一、實驗?zāi)康?1、掌握基礎(chǔ)培養(yǎng)基的制造方法和過程。2、了解人工培養(yǎng)基的主要成分及一般制備原則。3、了解各種培養(yǎng)基的特點。二、實驗原理 培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。培養(yǎng)基要具備以下條件：要有適宜的營養(yǎng)物質(zhì)和水分；具有適宜的PH值；配制后應(yīng)經(jīng)滅菌呈無菌狀態(tài)。 培養(yǎng)基按物理狀態(tài)可分液體培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。常用瓊脂作凝固劑。 培養(yǎng)基制備的基本程序：配料、溶化、測定及矯正PH、過濾、分裝、滅菌、無菌檢驗三、儀器設(shè)備 試管、刻度吸管、紗布、濾紙、三角瓶、培養(yǎng)皿、量筒、漏斗、棉塞、電爐、天平、包裝紙、棉線、ph試紙、玻棒。試劑：牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、瓊脂條、0.1mol/L和1mol/L氫氧化鈉、0.1mol/L和1mol/L的鹽酸溶液、蒸餾水等。四、配制原則和種類 （一）培養(yǎng)基配制原則 1、培養(yǎng)基：培養(yǎng)基是提供食用菌等生物生長發(fā)育所需的營養(yǎng)與特定環(huán)境條件的基質(zhì)，如蘑菇菌是有機營養(yǎng)型中的草腐生菌。制備培養(yǎng)基不僅要考慮它所需要的含碳化合物、含氮化合物、礦物鹽類、生長因子，還要考慮水與pH環(huán)境，同時還應(yīng)考慮它們培養(yǎng)方式是固體培養(yǎng)還是液體培養(yǎng)。因此，可以把按菌類生長發(fā)育需要比例配制的滅菌營養(yǎng)基質(zhì)，稱為培養(yǎng)基。換言之，培養(yǎng)基必須具備三個條件：含有菌株生長發(fā)育所需要的營養(yǎng)物質(zhì)；具有菌類生長環(huán)境條件；經(jīng)過滅菌，并保持無菌狀態(tài)。 2、培養(yǎng)基的選擇：在整菌種制備過程中，從母種到原種、栽培種，各個階段的目的要求有所不同，所選用的培養(yǎng)基的配比也應(yīng)有所區(qū)別。一般母種初生菌絲較嫩弱，分解養(yǎng)分能力差，要求營養(yǎng)豐富、完全，氮源、維生素的比例應(yīng)高。須選用易于被菌絲吸收利用的物質(zhì)，如葡萄糖、蔗糖、馬鈴薯、蛋白胨、無機鹽類及生長素等為等而原種、栽培種所需數(shù)量較多，且菌絲分解能力強，可利用大量農(nóng)作物秸稈、糞草、棉籽殼、麩皮、米糠等原料作為培養(yǎng)基。 （二）培養(yǎng)基的種類 1、根據(jù)營養(yǎng)物質(zhì)的來源，可以把培養(yǎng)基分為天然培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。 （1）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基是指用化學(xué)成分還不清楚或化學(xué)成分不恒定天然有機物配制而成的培養(yǎng)基，如各種農(nóng)副產(chǎn)品及其下腳料小麥、大豆、玉米粉、麩皮、米糠、作物秸稈、木屑、棉籽殼、甘蔗渣等，以及動植物組織的浸出液牛肉膏、肉湯、馬鈴薯汁、麥芽汁、豆芽汁等都可以用來配制天然培養(yǎng)基，這種培養(yǎng)基來源廣，成本低，營養(yǎng)豐富，適合于在生產(chǎn)上大規(guī)模培養(yǎng)菌類使用，但這些天然有機物質(zhì)因產(chǎn)地、品種、生長期的不同，化學(xué)成分不能宣。每批成分也不穩(wěn)定，不宜用來做精細的科學(xué)實驗。以分離馴化食用菌培養(yǎng)基 （2）半合成培養(yǎng)基為了促進食用菌菌絲的生長發(fā)育，常在天然培養(yǎng)基中添加適量的無機鹽類，或在合成培養(yǎng)基中添加適量的某些天然有機物，就成為半合成培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基種類繁多，應(yīng)用廣泛，也是生長菌種和實際栽培最常用的培養(yǎng)基。 （3）合成培養(yǎng)基是指采用化學(xué)成分已知的有機物（碳水化合物、含氮化合物、有機酸類）或無機物配制而成的培養(yǎng)基。這類培養(yǎng)基組成和含量明確，價格較貴，一般用于在實驗室范圍內(nèi)做有關(guān)營養(yǎng)、代謝、菌種鑒定等有關(guān)于食用菌的生理生化研究。 2、根據(jù)培養(yǎng)基制成后的物理狀態(tài)，可將培養(yǎng)基分為液體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和固體培養(yǎng)基。 （1）液體培養(yǎng)基根據(jù)食用菌所需的營養(yǎng)物質(zhì)，掃一定比例配成營養(yǎng)液，叫液體培養(yǎng)基。液體培養(yǎng)基可進行營養(yǎng)源的篩選實驗，以及生理生化方面如酶活力等研究，應(yīng)用液體培養(yǎng)基生產(chǎn)的菌種也可在生產(chǎn)中進行使用。 （2）固化培養(yǎng)基將各種營養(yǎng)成份按比例配制成營養(yǎng)液后，加入適量固化劑，如瓊脂，即可配成固化培養(yǎng)基。利用這種斜面試管可保藏及擴大菌種，同時亦可制成各種平皿固化培養(yǎng)基分離菌種。 （3）固體培養(yǎng)基利用各種富含纖維素和木質(zhì)素的農(nóng)林廢棄物如木屑、棉籽殼、秸稈、玉米蕊等作為主要原料，再加入適量的米糠或麩皮和無機鹽類制成固體培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基可作為二、三、級菌種生產(chǎn)用的培養(yǎng)基，也可以用它制成發(fā)酵草粉保藏菌種用的培養(yǎng)基。五、實驗步驟 （一）制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基 1、配方：牛肉膏35g、蛋白胨10g、氯化鈉5g、瓊脂2030g、蒸餾水1000mL。PH值7.47.6。 2、步驟： （1）稱量：根據(jù)用量按比例依次稱取各種成分，牛肉膏常用玻璃棒挑取，放在小燒杯或表面皿中稱量，用熱水融化后到入燒杯，蛋白胨易吸濕，稱量時要迅速。 （2）溶解：在燒杯中加入少于所需的水量，加熱，逐一加入各成分，使其溶解，瓊脂在溶液煮沸后加入，融化過程需不斷攪拌。加熱時應(yīng)注意火力，勿使培養(yǎng)基燒焦或溢出。溶好后，補足所需水分。 （3）調(diào)pH值：若PH值不適宜，可用1mol/L NaOH或1mol/LHCl把pH值調(diào)至所需范圍。 （4）過濾：趁熱用濾紙或多層紗布過濾，以利于某些實驗結(jié)果的觀察，如無特殊要求時可省去此步驟。 （5）分裝：按照實驗要求，可將配制的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)或三角瓶內(nèi)，分裝時注意，勿使培養(yǎng)基沾染在容器口上，以免沾污棉塞引起污染。 液體分裝：分裝高度以試管高度的1/4左右為宜，分裝三角瓶的量則根據(jù)需要而定，一般以不超過三角瓶容積的1/2為宜。 固體分裝：分裝試管時其裝入量不超過試管高度的1/5，滅菌后制成斜面，斜面長度不超過管長的1/2。分裝三角瓶，以不超過容積的1/2為宜。 半固體分裝：裝入量以試管高度的1/3為宜，滅菌后垂直待凝。 （6）加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。 （7）包扎：棉塞上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。 （8）滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。 （9）擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。 （10）無菌檢驗：滅菌后的培養(yǎng)基放入37恒溫箱中培養(yǎng)24h，以檢驗滅菌效果，無污染方可使用。 （二）制備馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基 1、配方：馬鈴薯（去皮）200g、蔗糖1520g、瓊脂2030g、蒸餾水1000mL。PH自然。 2、步驟： （1）將馬鈴薯洗凈，去皮，切成大小約為13的小塊，稱200g，放入1000mL水中煮沸2030分鐘，用雙層沙布過濾，取其液濾。 （2）定容：加水補足至1000mL。 （3）加入蔗糖至全部溶化。 （4）加瓊脂.至全部溶化。 （5）趁熱分裝試管及三角瓶。 （6）加棉塞：分裝完畢后，在試管口或三角瓶口塞上棉花，以阻止外界微生物進入培養(yǎng)基而造成污染，并保證有良好的通氣性能。 （7）包扎：棉塞上包一層牛皮紙，扎緊，即可進行滅菌。 （8）滅菌：將上述培養(yǎng)基以0.1Mpa，121，高壓蒸汽滅菌20min。 （9）擱置斜面：將滅菌的試管培養(yǎng)基管口端擱在玻璃棒或其他合適高度的器具上，擱置的斜面長度以不超過試管總長度的一半為宜。 （10）無菌檢驗：滅菌后的培養(yǎng)基放入28恒溫箱中培養(yǎng)24h，以檢驗滅菌效果，無污染方可使用。 注：第（8）（9）（10）步需在實驗二進行。六、實驗報告要求 1、根據(jù)實驗要求，在實驗時間內(nèi)到實驗室進行實驗時，一邊測量，一邊記錄實驗數(shù)據(jù)。報告要求準確、美觀。 2、 在實驗中，如果發(fā)生實驗測量數(shù)據(jù)與事先的計算數(shù)值不符，甚至相差過大，此時應(yīng)該找出原因，不能不了了之。同時要把通過實驗所測量的數(shù)據(jù)與計算值加以比較，如果誤差一般5以下。 3、在報告的最后要完成指導(dǎo)書上要求解答的思考題。七、思考題1、寫出制備牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基的步驟。 2、說明制備培養(yǎng)基應(yīng)注意哪些問題？八、實驗成績評定辦法 本門實驗課程考核成績占課程總成績的30，考核分實驗預(yù)習(xí)、實驗過程操作、實驗報告和實驗技能等四個方面，其成績計算為預(yù)習(xí)實驗（包括資料搜集）占10%、實驗過程操作（包括實驗流程、調(diào)試過程）占25、實驗報告（包括原理描述、數(shù)據(jù)記錄、實驗結(jié)果和效果）占25、實驗技能考核（包括解決問題的能力）或考試占40。凡考核不及格者，應(yīng)參加補考或重修。微生物接種技術(shù)一、實驗?zāi)康?1、初步掌握微生物的分離、培養(yǎng)和菌種的基本方法。 2、練習(xí)微生物接種、移植和培養(yǎng)的基本技術(shù)，掌握無菌操作技術(shù)。二、實驗原理 土壤是微生物生活的大本營，為了獲得某種微生物的純培養(yǎng)，一般是根據(jù)該微生物對營養(yǎng)、酸堿度、氧等條件要求不同，而供給它適宜的培養(yǎng)條件，或加入某種抑制劑，淘汰其他一些不需要的微生物，再用各種方法分離、純化該微生物，直至得到純菌株。三、儀器設(shè)備 樣品：新鮮土壤。 培養(yǎng)基：滅菌的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基、高氏一號培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖培養(yǎng)基。 無菌水：帶有玻璃珠裝有45mL無菌水三角瓶、裝有9mL無菌水的試管。 其它：無菌培養(yǎng)皿、無菌吸管、無菌三角玻棒、電子天平、記號筆、接種環(huán)、酒精燈、火柴。 試劑：1萬U/mL鏈霉素液、10苯酚四、相關(guān)知識點 接種方法：常用的有斜面接種法、平板接種法、液體接種法、試管深層固體培養(yǎng)基的穿刺接種法。 接種工具：常用的有接種針、接種環(huán)、接種鉤、接種圈、接種鏟或接種鋤、玻璃涂棒等。五、實驗步驟 （一）實驗程序1 制備土壤稀釋液：(無菌操作過程見教師示范） 1、稱取土壤5g，放入45mL無菌水的三角瓶中，振蕩10min，即為稀釋101的土壤懸液。 2、 另取裝有9mL無菌水試管5支，用記號筆編上102、103、104、105、106。取已稀釋成101的土壤液，振蕩后靜止0.5min，用無菌吸管吸取1mL土壤懸液加入102的無菌水的試管中，并在試管內(nèi)輕輕吹吸數(shù)次，使之充分混勻，即成102土壤稀釋液。同法依次連續(xù)稀釋至104、105 、106土壤稀釋液。 吸取稀釋液 取一吸管，以無菌操作法分別吸取104、105、 106土壤稀釋液0.1mL，加在已制好的平板培養(yǎng)基上。 涂板 用玻璃刮鏟將稀釋液在培養(yǎng)機上充分混勻鋪平，倒置于恒溫箱培養(yǎng)。 計算出每克土壤中細菌的數(shù)量。 即用某一培養(yǎng)皿內(nèi)真菌的菌落數(shù)乘以該培養(yǎng)皿接種液的稀釋倍數(shù)即得。 挑取單個菌落，進行劃線分離。 （二）實驗程序2 制平板 吸取稀釋液： 取一吸管，以無菌操作法分別吸取104、105 、 106土壤稀釋液0.1mL，加在空培養(yǎng)皿中。 混菌： 水平輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使菌液、培養(yǎng)基充分混勻鋪平，放在平坦的桌面上，凝固后倒置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)。 計算出每克土壤中放線菌的數(shù)量。 挑取單個菌落，進行劃線分離。 （三）實驗程序3 制成平板。 凝固后，用接種環(huán)取相應(yīng)的菌液一環(huán)（101）在平板上劃線。 1、連續(xù)劃線法：將挑取有樣品的接種環(huán)在平板培養(yǎng)基表面作連續(xù)劃線。完畢后，倒置于28300C溫室培養(yǎng)。 2、分區(qū)劃線法：用接種環(huán)以無菌操作挑取土壤稀釋液1環(huán)，先在培養(yǎng)基的一邊作第一次平行劃線34條，再轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿約600C角，并將接種環(huán)上剩余物燒掉，待冷卻后通過第一次劃線部分作第二次劃線會，同法依次作第三次和第四次劃線。劃線完畢，蓋上皿蓋，倒置于溫室培養(yǎng)。 挑取單個菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，如果不純，再移植純化，最后得到純培養(yǎng)。六、實驗報告要求 1、根據(jù)實驗要求，在實驗時間內(nèi)到實驗室進行實驗時，一邊測量，一邊記錄實驗數(shù)據(jù)。報告要求準確、美觀。 2、 在實驗中，如果發(fā)生實驗測量數(shù)據(jù)與事先的計算數(shù)值不符，甚至相差過大，此時應(yīng)該找出原因，不能不了了之。同時要把通過實驗所測量的數(shù)據(jù)與計算值加以比較，如果誤差一般5以下。 3、在報告的最后要