第二章2 鑒別 薄層色譜法PPT課件.ppt

第二章中藥制劑的鑒別第二節(jié)理化鑒別三 色譜法 薄層色譜法 1 薄層色譜法在中藥制劑的定性鑒別中得到廣泛的應(yīng)用 這主要是由于其具有分離分析雙重功能 大大提高了鑒別工作的靈敏度和專屬性 成為中藥鑒別的重要方法和鮮明特色 薄層色譜法還可用于藥品的雜質(zhì)檢查和含量測(cè)定 中國藥典大多數(shù)品種采用硅膠薄層色譜法 少數(shù)使用聚酰胺薄層色譜法和氧化鋁色譜法 2 1 薄層色譜法定性的基礎(chǔ)基于相同物質(zhì)在同一色譜條件下 表現(xiàn)出相同的色譜行為這一基本規(guī)律 在同一塊薄層板上點(diǎn)加供試品和對(duì)照物 在相同條件下展開 顯色檢出色譜斑點(diǎn)后 將所得供試品與對(duì)照物的色譜圖進(jìn)行對(duì)比分析 從而對(duì)藥品進(jìn)行定性鑒別 3 2 特點(diǎn)簡(jiǎn)便 快速 易普及 具有分離和分析雙重功能 且采用共薄層對(duì)照分析法 故專屬性亦較強(qiáng) 三 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 05版藥典新增 1 檢測(cè)靈敏度主要用于限量檢查 采用供試品溶液和對(duì)照品溶液與稀釋若干倍 10倍 的對(duì)照品溶液在規(guī)定的色譜條件下 于同一塊薄層板上點(diǎn)樣 展開 檢視 后者應(yīng)顯示清晰的斑點(diǎn) 2 分離度用于鑒別時(shí) 對(duì)照品溶液與供試品溶液中相應(yīng)的主斑點(diǎn) 應(yīng)顯示兩個(gè)清晰分離的斑點(diǎn) 用于限量檢查和含量測(cè)定時(shí) 要求定量峰與相鄰峰之間有較好的分離度 除另有規(guī)定外 分離度應(yīng)大于1 0 4 分離度 R 的計(jì)算公式為 R 2 d2 d1 W1 W2式中d1為相鄰兩峰中后一峰與原點(diǎn)的距離 d2為相鄰兩峰中前一峰與原點(diǎn)的距離 W1及W2為相鄰兩峰各自的峰寬 5 3 重復(fù)性主要用于含量測(cè)定 即同一供試品溶液在同一塊薄層板上平行點(diǎn)樣的待測(cè)成分的峰面積測(cè)量值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差 RSD 應(yīng)不大于3 0 需顯色后測(cè)量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)不大于5 0 四 對(duì)照物的選擇對(duì)照物分為對(duì)照品 主要為有效成分和特征性成分的單體 也包括對(duì)照提取物 和對(duì)照藥材兩種 對(duì)照物的設(shè)置有以下四種方式 1 對(duì)照品對(duì)照 用已知中藥制劑某一種有效成分或特征性成分對(duì)照品制成對(duì)照液 與樣品在同一條件下層析 比較相同位置有無同一顏色 或熒光 的斑點(diǎn) 來檢測(cè)是否含有某原料藥材 可設(shè)置一種或數(shù)種對(duì)照品 2 對(duì)照藥材對(duì)照 缺乏對(duì)照品的情況下使用 6 四 對(duì)照物的選擇3 對(duì)照品和對(duì)照藥材同時(shí)對(duì)照 雙對(duì)照 為了準(zhǔn)確檢驗(yàn)制劑投料的真實(shí)性 有時(shí)僅用對(duì)照品無法鑒別出來 這時(shí)可增加原藥材作為對(duì)照藥材 例如含有黃連 黃柏的制劑 單用小檗堿對(duì)照品來鑒別是不足足以說明的 此時(shí)應(yīng)增加黃連作為對(duì)照藥材進(jìn)行檢視 要求樣品色譜圖中的主要斑點(diǎn)應(yīng)與對(duì)照品和對(duì)照藥材色譜圖中的有關(guān)斑點(diǎn)相一致 從而大大提高了薄層色譜鑒別法的專屬性和整體性 可有效地檢出藥品是否使用了假冒藥材 7 4 陰陽對(duì)照由于中藥制劑中許多化學(xué)成分和有效成分不明確 或有效成分雖已明確但又無對(duì)照品 此時(shí)可采用陰陽對(duì)照法進(jìn)行鑒別 陽性對(duì)照液制備 把制劑中要鑒別的某味原藥材 按制劑的制法處理后 以制劑相同的比例 條件 方法提取 制成該味藥的陽性對(duì)照液 陰性對(duì)照液制備 從制劑處方中除去要鑒別的該味藥材 剩下各味藥則按制劑方法出理后 以制劑相同的比例 條件 方法提取 制成該味藥的陰性對(duì)照液 通過樣品和對(duì)照品的陽性對(duì)照液 陰性對(duì)照液在同一條件下的色譜圖可判斷樣品中有無該味藥材 并可觀察陰性對(duì)照液中有無干擾來確定該鑒別的專屬性 實(shí)例 枳實(shí)導(dǎo)滯丸中黃連的薄層鑒別P19 8 五 影響薄層色譜鑒別的主要因素影響因素較多 例如供試液的凈化程度 吸附劑的性能和薄層板的質(zhì)量 點(diǎn)樣 原點(diǎn) 的質(zhì)量 展開劑的組成和飽和情況 對(duì)照品的純度 展開的距離 相對(duì)濕度和溫度等 主要的有以下四個(gè)方面 1 樣品的預(yù)處理及供試液的制備中藥的成分復(fù)雜 未知成分多 在制劑中往往各種成分盡可能多的提取出來 其中既有欲測(cè)成分也有 雜質(zhì) 常常由于相互干擾或背景污染而難以得到滿意的分離效果 甚至難以辨認(rèn) 因此供試液的凈化程度就很關(guān)鍵 為了得到較清晰的色譜圖 供試液的制備要求 被測(cè)成分盡可能多的提取出來 雜質(zhì)要盡可能多的除去 9 2 薄層色譜的點(diǎn)樣點(diǎn)樣是關(guān)鍵的一步 既關(guān)系到能否得到可重現(xiàn)的薄層色譜 也關(guān)系到定量結(jié)果的準(zhǔn)確與否 不良的點(diǎn)樣是測(cè)定誤差的主要來源 3 吸附劑的活性與相對(duì)濕度的影響硅膠為親水性吸附劑 其含水量越高 吸附活性越弱 自點(diǎn)樣開始直展開前 薄層板都是暴露在空氣中 其活性取決于空氣的相對(duì)濕度 薄層板在不同的相對(duì)濕度條件下 其吸附活性亦不同 致使薄層色譜重現(xiàn)性較差 實(shí)驗(yàn)室可用適當(dāng)濃度的硫酸溶液來控制展開時(shí)的相對(duì)濕度 硫酸溶液的濃度越高其吸濕性越大 使得展開室中的相對(duì)濕度越小 反之 則越大 10 4 溫度的影響在其他條件相同時(shí) 展開時(shí)的溫差較大會(huì)導(dǎo)致斑點(diǎn)擴(kuò)散及被分離物質(zhì)的Rf值和物質(zhì)的相互分離度不一致 影響薄層色譜的重現(xiàn)性 六 儀器與材料 略 七 操作步驟一般操作步驟為 供試液的制備 制備薄層板 制板 點(diǎn)樣 展開 顯色與檢視1 供試液制備 包括提取和凈化 除去雜質(zhì) 消除干擾 常用的預(yù)處理方法有 溶劑提取法 包括冷浸 回流 超聲提取 萃取法 升華法 蒸餾法小型層析柱的柱色譜法 離子交換法等 11 2 制備薄層板 略 3 點(diǎn)樣定量點(diǎn)樣 展開距離 點(diǎn)樣位置 12 4 展開 略 5 顯色與檢視顏色較深的成分可直接在日光下檢視其斑點(diǎn) 無色或淺色的成分多用噴霧法或浸漬法以適宜的顯色劑顯色 或再加熱使之顯色 有熒光的物質(zhì)或遇某些試劑可激發(fā)熒光的物質(zhì)可在紫外燈 365nm 下觀察熒光色譜 有的成分可用試劑的蒸氣 如碘蒸氣 氨蒸氣 熏蒸顯色 無色有紫外吸收且不產(chǎn)生熒光的成分可用熒光淬滅法顯色 即在含有熒光劑的硅膠板 如硅膠GF254板 在紫外光燈 254nm 下觀察板面上該成分形成的熒光淬滅色譜 13 6 記錄薄層色譜圖象可采用攝像設(shè)備拍照 以光學(xué)照片或電子圖象的形式保存 也可以用掃描儀記錄相應(yīng)的色譜圖 7 結(jié)果判斷供試品色譜中 在與對(duì)照品 對(duì)照藥材或?qū)φ仗崛∥锷V的相應(yīng)的位置上 顯相同顏色或熒光的斑點(diǎn) 則判斷為符合定 薄層色譜數(shù)碼相機(jī)成像系統(tǒng) 14 八 應(yīng)用實(shí)例黃連 黃柏及含黃連 黃柏的成藥1 供試液制備取各品種藥粉適量 加甲醇5ml 置水浴回流15min 過濾 濾液濃縮至1ml 2 對(duì)照液制備取鹽酸香檳酒小檗堿 硫酸黃連堿 硫酸表小檗堿 非洲防己堿 藥根堿 鹽酸巴馬汀對(duì)照品 加甲醇制成每0 5mg ml的溶液 作為對(duì)照品溶液 3 薄層板硅膠G自制板 厚度 500um4 點(diǎn)樣分別點(diǎn)樣1 2ul5 展開劑苯 醋酸乙酯 甲醇 異丙醇 濃氨試液 6 3 1 5 1 5 0 5 另槽中加入與展開劑等體積濃氨試液 15 6 展開方式展開室預(yù)平衡15分鐘 上行展開 展距 8cm7 顯色置紫外光燈 365nm 下檢視 8 色譜識(shí)別中國藥典黃連項(xiàng)下收載有味連 雅連 云連三種 總體分析黃連可見4 5個(gè)主要的黃色熒光斑點(diǎn) 自下而上 分別為l 非洲防己堿 藥根堿 量少 2 巴馬汀 3 小檗堿 4 表小檗堿 云連不含 雅連含量低 5 黃連堿 味連含量高 黃柏主要檢出巴馬汀及小檗堿 可與黃連區(qū)別 16 1234567891011121314151617181 黃連 味連 7 小兒化毒散13 非洲防己堿2 黃連8 萬應(yīng)錠14 藥根堿3 黃連 雅連 9 大補(bǔ)陰丸15 巴馬汀4 黃連 云連 10 木香檳榔丸16 小檗堿5 黃連 野連 11 香連丸17 表小檗堿6 黃連 日本黃連 12 黃柏18 黃連堿 17 六味地黃丸中牡丹皮的鑒別 1 12 一捻金 13 人參二醇 人參三醇 1 丹皮酚 2 5 六味地黃丸 一捻金中人參的鑒別 18 牛黃解毒片中大黃的鑒別 12345 1 大黃素2 大黃對(duì)照藥材3 5 樣品 萬氏牛黃清心丸中黃連的鑒別 1 5 萬氏牛黃清心丸 6 黃連對(duì)照藥材 7 小檗堿 19 思考題1 什么是薄層色譜鑒別法