生物技術(shù)制藥課件.ppt

生物技術(shù)制藥BiotechnologicalPharmaceutics 生物工程系徐銳Tel mail 175912981 一 課程內(nèi)容 第一章緒論第二章基因工程制藥第三章動(dòng)物細(xì)胞工程制藥第四章抗體制藥第五章植物細(xì)胞工程制藥第六章酶工程制藥第七章發(fā)酵工程制藥 Chapter1緒論 第一節(jié)生物技術(shù)的發(fā)展史 一 生物技術(shù) biotechnology 生物技術(shù) 以生命科學(xué)為基礎(chǔ) 利用生物體 或生物組織 細(xì)胞及其組分 的特性和功能 設(shè)計(jì)構(gòu)建具有預(yù)期性狀的新物種或新品系 并與工程相結(jié)合 利用這樣的新物種 或品系 進(jìn)行加工生產(chǎn) 為社會提供商品和服務(wù)的一個(gè)綜合性的技術(shù)體系 包括基因工程 細(xì)胞工程 發(fā)酵工程 酶工程 生化工程以及后來衍生出來的第二代 第三代的蛋白質(zhì)工程 抗體工程 糖鏈工程和海洋生物技術(shù)等 不可取代性 育種 制藥 快速 精確 單克隆抗體檢測妊娠 低耗 高效 生物酶催化 化學(xué)催化 副產(chǎn)物少 副作用小 安全性好 高附加值性 符合生態(tài)型的經(jīng)濟(jì)技術(shù)發(fā)展體系 生物技術(shù)的優(yōu)越性 現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ)學(xué)科和分支 分子生物學(xué)微生物學(xué)生物化學(xué)遺傳學(xué)細(xì)胞生物學(xué)化學(xué)工程 現(xiàn)代生物技術(shù) 醫(yī)藥生物技術(shù) 生物技術(shù)疫苗 生物技術(shù)診斷 農(nóng)業(yè)生物技術(shù) 家畜生物技術(shù) 海洋生物技術(shù) 二 生物技術(shù)發(fā)展簡史 傳統(tǒng)生物技術(shù)的技術(shù)特征是釀造技術(shù)公元前6000年古代巴比倫人釀造啤酒公元前4000年埃及人發(fā)酵面包我國殷朝制醬周朝制醋特點(diǎn) 自然發(fā)酵 全憑經(jīng)驗(yàn) 傳統(tǒng)生物技術(shù)階段 近代生物技術(shù)的技術(shù)特征是微生物發(fā)酵技術(shù)1674年荷蘭布商列文虎克自制了高倍顯微鏡 300倍左右 觀察到了微生物 1865年法國科學(xué)家巴斯德證明了發(fā)酵原理 1928年英國Fleming發(fā)現(xiàn)青霉素1940年英國弗洛里 錢恩分離出青霉素 近代生物技術(shù)階段 近代生物技術(shù)時(shí)期的特點(diǎn) 1 產(chǎn)品類型多初級 氨基酸 酶 有機(jī)酸 次級 抗生素 生物轉(zhuǎn)化 甾體 等 2 生物技術(shù)要求高 純種 無菌 通氣 產(chǎn)品質(zhì)量要求也高 3 生產(chǎn)設(shè)備規(guī)模巨大500立方米 2000立方米 4 技術(shù)發(fā)展速度快 青霉素初期發(fā)酵效價(jià)為200U ml 現(xiàn)在為80000U ml 現(xiàn)代生物技術(shù)的技術(shù)特征就是以基因工程為首要標(biāo)志1953年Watson Crick提出DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)1973年建立DNA重組技術(shù) Boyer Cohen 美國 1975年建立單克隆抗體技術(shù) 雜交瘤細(xì)胞 1978年大腸桿菌表達(dá)出胰島素1997年英國克隆多利羊 現(xiàn)代生物技術(shù) 現(xiàn)代生物技術(shù)包括 重組DNA技術(shù) 細(xì)胞和原生質(zhì)體融合技術(shù) 酶和細(xì)胞的固定化技術(shù) 植物脫毒和快速繁殖技術(shù) 動(dòng)物和植物細(xì)胞的大量培養(yǎng)技術(shù) 動(dòng)物胚胎工程技術(shù) 現(xiàn)代生物反應(yīng)工程和分離工程技術(shù) 蛋白質(zhì)工程技術(shù) 海洋生物技術(shù) 現(xiàn)代微生物發(fā)酵技術(shù) 不能忘記的人 JDWatsonFHCCrick 1953年4月25日 英國 自然 雜志發(fā)表了沃森和克立克的文章 核酸的分子結(jié)構(gòu) DNA的一個(gè)結(jié)構(gòu)模型 標(biāo)志著DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的建立 從此 遺傳學(xué)和生物學(xué)的歷史從細(xì)胞階段進(jìn)入了分子階段 不能忘記的人 FSangerWGilbert Sanger 英國化學(xué)家 最早測定胰島素的氨基酸順序獲得1958年諾貝爾化獎(jiǎng) 22年后 他因測定了一種噬菌體的一級結(jié)構(gòu)獲1980年的諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) Gilbert在DNA測序領(lǐng)域 因其卓越的工作獲得1980年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng) 不能忘記的人 PaulBerg Berg 美國生物化學(xué)家 通過把兩個(gè)不同來源的DNA連結(jié)在一起并發(fā)揮其應(yīng)有的生物學(xué)功能 證明了完全可以在體外對基因進(jìn)行操作 他作為 重組DNA技術(shù)之父 于1980年獲諾貝爾化獎(jiǎng) 不能忘記的人 KaryBMullis 1985年穆利斯發(fā)明了高效復(fù)制DNA片段的聚和酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) PCR 技術(shù) 利用該技術(shù)可從極其微量的樣品中大量生產(chǎn)DNA分子 使基因工程獲得了革命性發(fā)展 第二節(jié)生物技術(shù)藥物 生物技術(shù)制藥 生物技術(shù)藥物 生物藥物 采用現(xiàn)代生物技術(shù) 按照人的設(shè)想 借助動(dòng)植物微生物來生產(chǎn)所需的醫(yī)藥品 一般來說 采用DNA重組技術(shù)或其他生物新技術(shù)研制的蛋白質(zhì)或核酸類藥物 生物技術(shù)藥物 生化藥物 微生物藥物 海洋藥物 生物制品的統(tǒng)稱 生物技術(shù)藥物分類 治療性藥物預(yù)防藥物診斷藥物 干擾素 生長激素 胰島素 集落刺激因子等 各類疫苗 甲肝疫苗 乙肝疫苗 卡介苗等 免疫診斷試劑 酶診斷試劑 單抗診斷試劑 基因診斷試劑等 生物技術(shù)藥物的特性 1 分子結(jié)構(gòu)復(fù)雜2 具有種屬特異性3 治療針對性強(qiáng) 療效高4 穩(wěn)定性差5 基因穩(wěn)定性6 免疫原性7 體內(nèi)的半衰期短8 受體效應(yīng)9 多效性和網(wǎng)絡(luò)性效應(yīng)10 檢驗(yàn)的特殊性 第三節(jié)生物技術(shù)制藥 一 生物技術(shù)制藥的特征 高技術(shù)高知識層次的人才和高新的技術(shù)手段高投入一個(gè)新的生物醫(yī)藥的平均費(fèi)用為1 3億美元 有的高達(dá)6億 長周期新藥開發(fā)周期8 10年 高風(fēng)險(xiǎn)成功率為5 10 研制時(shí)間卻需8 10年 高收益利潤率回報(bào)可高達(dá)10倍 上市后2 3年便可收回投資 生長激素釋放抑制素 別名為生長抑素 施他寧藥理作用 抑制胃酸分泌 顯著減少內(nèi)臟血流 減少肝臟血流量 適應(yīng)癥 適用于肝硬化所致的食管靜脈出血 急性胃潰瘍出血 糜爛和出血性胃炎所致的出血等 傳統(tǒng)生產(chǎn)方法 從羊的下丘腦中提取10萬只羊1mg基因工程技術(shù)生產(chǎn) 基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)10L大腸桿菌發(fā)酵液1mg低成本 0 3美元 mg多種基因工程藥物在臨床上大顯神威 促紅細(xì)胞生成素 EPO 粒細(xì)胞集落刺激因子 G CSF 等銷售額超過10億 二 生物技術(shù)在制藥中的應(yīng)用 1 基因工程制藥 1 基因工程藥物品種的開發(fā) 2 基因工程疫苗 3 基因工程抗體 4 基因診斷與基因治療 重組乙肝疫苗 CHO細(xì)胞 重組乙肝疫苗 漢遜酵母 5 應(yīng)用基因工程技術(shù)建立新藥的篩選模型 6 應(yīng)用基因工程技術(shù)改良菌種 產(chǎn)生新的微生物藥物 7 利用轉(zhuǎn)基因動(dòng) 植物生產(chǎn)蛋白質(zhì)類藥物人體蛋白AAT 抗胰蛋白酶 10萬美元 g 轉(zhuǎn)基因羊羊奶中20g L 8 基因工程技術(shù)在改進(jìn)藥物生產(chǎn)工藝中的應(yīng)用 增加關(guān)鍵酶的劑量 提高酶活 抑制非必要表達(dá) 集中細(xì)胞內(nèi)資源表達(dá)主要產(chǎn)物 克隆血紅蛋白基因 提高菌體呼吸強(qiáng)度 2 細(xì)胞工程制藥 1 單克隆抗體技術(shù) 2 動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng) 3 植物細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)次生代謝產(chǎn)物紅豆杉細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)紫杉醇 紅豆杉 紫杉醇結(jié)構(gòu) 3 酶工程制藥4 發(fā)酵工程制藥工藝改進(jìn) 新藥研制和菌種改造 青霉素?；?三 我國生物技術(shù)制藥現(xiàn)狀和發(fā)展前景 開始于20世紀(jì)70年代初 先是進(jìn)行固定化酶的研究 以后固定化酶和固定化細(xì)胞的研究與應(yīng)用得到發(fā)展 70年代后期 開始跟蹤國外基因工程技術(shù)的某些基礎(chǔ)性工作 80年代初期 開始乙型肝炎基因工程疫苗 基因工程干擾素的研究 生物技術(shù)方面的項(xiàng)目得到了國家的支持 其中 1b型干擾素為我國首創(chuàng) 目前我國生物制藥技術(shù)申報(bào)貌似 活躍 實(shí)際上都是在圍繞僅有的幾個(gè)老品種進(jìn)行改進(jìn)或改制 完全創(chuàng)新技術(shù)很少 與發(fā)達(dá)國家相比 我國生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)差距不大 但在產(chǎn)業(yè)化方面與世界的差距正在逐漸加大 當(dāng)今世界有20多種暢銷生物藥時(shí) 我國能生產(chǎn)10種 而現(xiàn)在世界上有140多種時(shí) 我國卻只能生產(chǎn)20多種 由于我國醫(yī)藥生物技術(shù)成果缺乏自主知識產(chǎn)權(quán) 而目前我國生物制藥公司中技術(shù)和產(chǎn)業(yè)發(fā)展比較成熟的也僅有北京天壇生物 深圳康泰生物 深圳科興 長春金賽等少數(shù)幾家企業(yè) 產(chǎn)業(yè)規(guī)模較小 而一些傳統(tǒng)型的制藥企業(yè)由于受技術(shù)條件等影響而難以迅速進(jìn)入生物制藥領(lǐng)域 醫(yī)藥生物技術(shù)發(fā)展展望 21世紀(jì)是醫(yī)藥生物技術(shù)快速發(fā)展的時(shí)期 生物制藥 化學(xué)藥物 中藥形成三足鼎立 有效的為人類健康服務(wù) 1 利用新發(fā)現(xiàn)的人類基因開發(fā)新型藥物 人類基因組計(jì)劃已完成 1986年美國科學(xué)家達(dá)爾貝科提出的人類基因組計(jì)劃 1990年啟動(dòng)該計(jì)劃 23對染色體30億對堿基 3 5萬個(gè)基因進(jìn)行測序 美國承擔(dān)54 英33 日7 法2 8 德2 2 中國1 1999年中國加入人類基因組計(jì)劃 投資3億元 負(fù)責(zé)測定3號染色體3000萬對堿基 2000年4月完成 2 新型疫苗的研制艾滋病疫苗和基因型癌疫苗等 3 基因工程活性肽的生產(chǎn)基因藥物 淋巴因子 生長因子 激素和酶4 其它醫(yī)藥業(yè)將得到不斷改造和發(fā)展轉(zhuǎn)基因藥材 利用轉(zhuǎn)基因的煙草來生產(chǎn)人造血漿將成為現(xiàn)實(shí) 5 新型生物反應(yīng)器和新型生物技術(shù)不斷出現(xiàn) 新型生物反應(yīng)器有 氣升式生物反應(yīng)器流化床式生物反應(yīng)器固定床式生物反應(yīng)器袋式或膜式生物反應(yīng)器中空纖維生物反應(yīng)器等 四 我國的醫(yī)藥生物技術(shù) 已上市的基因工程藥物和疫苗1995年白細(xì)胞介素 21996年 1b 干擾素 2a 干擾素 2b 干擾素1997年粒細(xì)胞集落因子紅細(xì)胞生成素1992年乙型肝炎疫苗 作業(yè) 1 生物技術(shù)制藥的概念 2 生物技術(shù)藥物分為哪些類型 3 生物技術(shù)制藥有哪些特征 Chapter2基因工程制藥 用途 主要用于癌癥 人類免疫缺陷病毒性疾病 心血管疾病 糖尿病 貧血和許多遺傳疾病的治療 獲取方式 生化提取基因工程表達(dá) 成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證 成本低產(chǎn)量高活性強(qiáng)性質(zhì)優(yōu) 實(shí)例 人生長激素 侏儒癥 50具新鮮尸體腦下垂體中提取 采用基因工程從1 2升細(xì)菌培養(yǎng)液中提取獲得 1982年世界上第一個(gè)基因工程藥物 重組人胰島素獲準(zhǔn)生產(chǎn)銷售 至今已有100多個(gè)生物技術(shù)藥物上市 促紅細(xì)胞生成素 EPO 以全球銷售額38億美元的業(yè)績 居全球最暢銷10種藥物的第6名 美國是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地 一直穩(wěn)居生物技術(shù)藥物研發(fā)榜首 其2002年產(chǎn)值和銷售額已超過200億美元 1989年我國第一個(gè)擁有自主知識產(chǎn)權(quán)的基因工程藥物 重組人干擾素 IFN 1b 上市以來 目前 世界上銷售額排前10位的生物技術(shù)藥物我國已能生產(chǎn)8種 國際生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展動(dòng)態(tài) 第一節(jié)概述 生物技術(shù)的核心就是基因工程 20世紀(jì)70年代基因工程誕生 最先應(yīng)用在醫(yī)藥科學(xué)領(lǐng)域 傳統(tǒng)生物藥物由于來源及制備上的困難 價(jià)格等因素的影響 此外在制備過程可能受到的病毒 衣原體 支原體等的感染等問題 促使人們尋求安全 實(shí)用 療效可靠的新方法來制備生物藥物 如 生長激素抑制素1mg傳統(tǒng)法 10萬只羊的下丘腦 現(xiàn) 10L大腸桿菌培養(yǎng)液 0 3美元 mg 尿激酶從男性尿中提取 胎盤丙種球蛋白從胎盤中提取 應(yīng)用基因工程技術(shù)可十分方便且有效地解決傳統(tǒng)生物制藥所遇到的問題 從量 質(zhì)上都可以得到改進(jìn) 且可以創(chuàng)造全新物質(zhì) 如今 癌癥 病毒性疾病 心血管疾病以及內(nèi)分泌等方面的預(yù)防 治療和診斷已可通過基因工程技術(shù)獲得 利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn) 1 可以大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性蛋白和多肽 如胰島素 干擾素 細(xì)胞因子等 為臨床使用提供有效的保障 2 可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì) 以便對其生理 生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究 從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍 3 利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn) 挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì) 4 內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處 可通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造和去除 如白細(xì)胞介素 2的半胱氨酸改為絲氨酸或丙氨酸 白細(xì)胞介素 2的活性以及熱穩(wěn)定性均有提高 5 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物 擴(kuò)大藥物篩選來源 利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn) 第二節(jié)基因工程藥物生產(chǎn)的過程 基因工程技術(shù)是將所要重組對象的目的基因插入載體 拼接 轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞 構(gòu)建成工程菌 或細(xì)胞 實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合 并使目的基因在工程菌 或細(xì)胞 內(nèi)進(jìn)行復(fù)制和表達(dá)的技術(shù) 基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游 上游階段 主要指的是目的基因分離 工程菌 或細(xì)胞 構(gòu)建 上游階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成 下游階段 主要指的是從工程菌 或細(xì)胞 的大規(guī)模培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化 質(zhì)量控制等 獲得目的基因 組建重組質(zhì)粒 培養(yǎng)工程菌 構(gòu)建基因工程菌或細(xì)胞 產(chǎn)物分離純化 除菌過濾 半成品檢定 包裝 成品檢定 基因工程藥物制備的一般過程 基因工程基本過程 切 接 轉(zhuǎn) 增檢 工程菌 或細(xì)胞 構(gòu)建中重要的工具 工具 酶限制性內(nèi)切酶連接酶逆轉(zhuǎn)錄酶Klenow酶大片段 DNA聚合酶I 核酸酶S1DNA擴(kuò)增酶 第三節(jié)目的基因的獲得 克隆真核基因常用方法 逆轉(zhuǎn)錄法和化學(xué)合成法 不能直接分離 一 逆轉(zhuǎn)錄法逆轉(zhuǎn)錄法就是先分離純化目的基因的mRNA 再反轉(zhuǎn)錄成cDNA 然后進(jìn)行cDNA的克隆表達(dá) cDNA與模板mRNA序列嚴(yán)格互補(bǔ) 而不含內(nèi)含子 逆轉(zhuǎn)錄法的步驟1 mRNA的純化2 cDNA第一鏈的合成3 cDNA第二鏈的合成4 cDNA克隆5 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞6 cDNA文庫的鑒定7 目的cDNA克隆的分離和鑒定 cDNA克隆示意圖 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 ss DNA ds cDNA ds cDNA 核酸酶S1 1 mRNA的純化 真核細(xì)胞mRNA3 polyA 20 250 采用OligodT 纖維素 以親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來 2 cDNA第一鏈的合成 可用寡聚dT作為引物 在逆轉(zhuǎn)錄酶的催化下 開始cDNA鏈的合成 3 cDNA第二鏈的合成 除去cDNA mRNA雜交鏈中的mRNA鏈 堿解或RNaseH酶解 然后以cDNA第一鏈為模板合成第二鏈 由于第一鏈cDNA鏈3 末端往往形成一個(gè)發(fā)夾形結(jié)構(gòu) 所以 可以從這一點(diǎn)開始合成cDNA第二鏈 常用Klenow酶或DNA聚合酶I 切除發(fā)夾結(jié)構(gòu) 核酸酶S1 專一性切除單鏈DNA 4 cDNA克隆 用于cDNA克隆的載體有三類 細(xì)菌質(zhì)粒 如pBR322 pUC等 插入片段10kb動(dòng)植物病毒根據(jù)重組后插入的cDNA能否經(jīng)轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)非表達(dá)型載體 pBR322及 gt10 表達(dá)型載體 pUC及 gt11 有利于目的基因的篩選 5 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 1 轉(zhuǎn)化 指質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組DNA導(dǎo)入細(xì)菌的過程 2 轉(zhuǎn)染 指病毒或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入真核細(xì)胞的過程 脂質(zhì)體介導(dǎo) 原生質(zhì)體融合 電穿孔 顯微注射 基因槍 病毒介導(dǎo) 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)染 6 cDNA文庫的鑒定 1 表型改變 抗生素抗性 抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變 a互補(bǔ) 報(bào)告基因 缺陷恢復(fù) 2 結(jié)構(gòu)特征 DNA大小 酶切圖譜 雜交 核酸 蛋白 PCR檢測 DNA序列分析3 免疫化學(xué)檢測 表達(dá)產(chǎn)物分析 7 目的cDNA克隆的分離和鑒定 從cDNA文庫中分離特異的cDNA克隆 主要采用 1 核酸探針雜交法 根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列 人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針 從cDNA文庫中分離特異cDNA克隆 2 免疫反應(yīng)鑒定法 用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫 可用免疫學(xué)方法分組逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物 即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的特異cDNA克隆 分離得到含有目的基因的陽性克隆后 必須對其作進(jìn)一步的驗(yàn)證和鑒定 限制酶圖譜 基因測序等 不需合成第二鏈 mRNA 逆轉(zhuǎn)錄酶 ss DNA PCR 特異引物 目的cDNA鏈 1985 PCR發(fā)明以后 RT PCR得到了廣泛的應(yīng)用 二 逆轉(zhuǎn)錄 聚合酶鏈反應(yīng)法 RT PCR 三 化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)或多肽的編碼基因可以用化學(xué)合成法合成 必須知道目的基因的核苷酸順序或目的蛋白質(zhì)的氨基酸順序 人工化學(xué)合成的限制 一不能合成太長的基因 50 60bp 二是人工合成時(shí) 遺傳密碼的簡并性可導(dǎo)致中性突變 三是費(fèi)用較高 第四節(jié)基因表達(dá) 基因表達(dá) 是指結(jié)構(gòu)基因在生物體中的轉(zhuǎn)錄 翻譯以及所有加工過程 基因高效表達(dá) 將外源基因片段拼接到另一個(gè)基因表達(dá)體系中 使即獲得原生物活性又可高產(chǎn)的表達(dá)產(chǎn)物 最佳的基因表達(dá)體系 生物活性高 表達(dá)產(chǎn)量高 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定 表達(dá)產(chǎn)物容易分離純化 一 宿主細(xì)胞的選擇 1 培養(yǎng)容易 生長快速 2 容易獲得較高濃度的細(xì)胞 3 能利用易得廉價(jià)原料 4 不致病 不產(chǎn)生內(nèi)毒素 5 發(fā)熱量低 需氧低 適當(dāng)?shù)陌l(fā)酵溫度 6 容易進(jìn)行DNA重組技術(shù)操作 7 產(chǎn)物的產(chǎn)量 產(chǎn)率高 8 產(chǎn)物容易提取純化 宿主細(xì)胞常用兩大類 原核細(xì)胞 常用有大腸桿菌 枯草芽胞桿菌 鏈霉菌等 真核細(xì)胞 常用有酵母 絲狀真菌 哺乳動(dòng)物細(xì)胞等 原核細(xì)胞 大腸桿菌 基因工程研究中采用最多的原核表達(dá)體系 優(yōu)點(diǎn) 生長快速 代謝簡單 遺傳體系清楚 容易操作 細(xì)胞破碎容易 缺點(diǎn) 不存在導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號序列 分泌能力不足 產(chǎn)品多為胞內(nèi)產(chǎn)物 活性偏低 提取困難 蛋白表達(dá)后不能修飾加工 糖基化等 產(chǎn)物蛋白質(zhì)N端多余一個(gè)蛋氨酸殘基 能引起免疫反應(yīng) 內(nèi)毒素存留 枯草芽孢桿菌 分泌能力強(qiáng) 蛋白質(zhì)不形成包含體 產(chǎn)物蛋白質(zhì)不能糖基化 有很強(qiáng)的胞外蛋白酶對產(chǎn)物降解 鏈霉菌 作為外源性基因表達(dá)受到重視 不致病 使用安全 分泌能力強(qiáng) 表達(dá)產(chǎn)物可糖基化 真核細(xì)胞 酵母是研究基因表達(dá)最有效的單細(xì)胞真核微生物 其基因組小 世代時(shí)間短 有單倍體雙倍體兩種形式 繁殖迅速 無毒性 能外分泌 產(chǎn)物可糖基化 已有不少真核基因成功表達(dá) 絲狀真菌優(yōu)點(diǎn) 分泌能力強(qiáng) 能正確進(jìn)行翻譯后加工 肽剪切 糖基化 有成熟的發(fā)酵和后處理工藝 哺乳動(dòng)物細(xì)胞優(yōu)點(diǎn) 表達(dá)產(chǎn)物可由重組轉(zhuǎn)化細(xì)胞分泌到培養(yǎng)液中 純化容易 產(chǎn)物是糖基化的接近天然物 缺點(diǎn) 生長慢 生產(chǎn)率低 培養(yǎng)條件苛刻 費(fèi)用高 培養(yǎng)液濃度稀 二 大腸桿菌體系中的基因表達(dá) 一 表達(dá)載體表達(dá)載體必須具備的條件 1 載體能獨(dú)立地進(jìn)行復(fù)制 復(fù)制起點(diǎn) ori 2 應(yīng)具有靈活的克隆位點(diǎn)和方便的篩選標(biāo)記 以利于外源基因的克隆 鑒定和篩選 且克隆位點(diǎn)位于啟動(dòng)子序列后 以便外源基因表達(dá) 3 應(yīng)具有很強(qiáng)的啟動(dòng)子 能為大腸桿菌的RNA聚合酶所識別 4 應(yīng)具有阻遏子 使啟動(dòng)子受到控制 只有當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)才進(jìn)行轉(zhuǎn)錄 外源基因的高效表達(dá)往往會抑制宿主細(xì)胞的生長 增殖 而阻遏子可使宿主細(xì)胞免除此不良影響 5 應(yīng)具有很強(qiáng)的終止子 以便使RNA聚合酶集中力量轉(zhuǎn)錄克隆的外源基因 而不轉(zhuǎn)錄其他無關(guān)的基因 同時(shí) 很強(qiáng)的終止子所產(chǎn)生的mRNA較為穩(wěn)定 6 所產(chǎn)生的mRNA必須具有翻譯的起始信號 即起始密碼AUG和SD序列 以便轉(zhuǎn)錄后能順利翻譯 如 在大腸桿菌中表達(dá)非融合蛋白的操縱子必須改建成 細(xì)菌啟動(dòng)子 細(xì)菌SD序列 起始密碼子 結(jié)構(gòu)基因 終止子 常用表達(dá)載體pBV220系統(tǒng) 啟動(dòng)子 多克隆位點(diǎn) 終止子 阻遏子 P23 復(fù)制起始位點(diǎn) 它已成功地表達(dá)了人白細(xì)胞介素2 干擾素和腫瘤壞死因子等外源基因 氨芐青霉素抗性基因 限制性內(nèi)切酶 SD序列 pBV220系統(tǒng)國內(nèi)使用最多的載體 其組成 來源于pUC8多克隆位點(diǎn) 核糖體rrnB基因終止信號 pBR322第4225 3735位 pUC18第2066 680位 噬菌體cIts857阻遏子基因及PR啟動(dòng)子 pRC23的PL啟動(dòng)子及SD序列 pBV220系統(tǒng)優(yōu)點(diǎn) cIts857阻遏子基因與PL啟動(dòng)子同在一個(gè)載體上 可以轉(zhuǎn)化任何菌株 以便選用蛋白酶活性較低的宿主細(xì)胞 使表達(dá)產(chǎn)物不易降解 SD序列緊跟多克隆位點(diǎn) 便于插入帶起始ATG的外源基因 可表達(dá)非融合蛋白 強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄終止信號可防止出現(xiàn) 通讀 現(xiàn)象 有利于質(zhì)粒 宿主系統(tǒng)的穩(wěn)定 整個(gè)質(zhì)粒僅為3 66kb 有利于增加其拷貝數(shù)及容量 可以插入大片段外源基因 PR和PL啟動(dòng)子串聯(lián) 可以增強(qiáng)啟動(dòng)作用 本系統(tǒng)為溫度誘導(dǎo) 外源基因表達(dá)量可達(dá)細(xì)胞總蛋白的20 30 產(chǎn)物以包含體形式存在不易降解均一性好 PR和PL啟動(dòng)子 選用溫度敏感突變體cIts857的基因產(chǎn)物來調(diào)控PL PR啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄 在較低溫度 30 時(shí)以活性形式存在在較高溫度 42 時(shí)失活脫落 PL PR cIts857 PL和PR表達(dá)系統(tǒng)存在的問題PL和PR表達(dá)系統(tǒng)誘導(dǎo)時(shí)不加化學(xué)誘導(dǎo)劑 成本又低廉 缺陷1 在熱脈沖誘導(dǎo)過程中 大腸桿菌熱休克蛋白的表達(dá)也會被激活 其中一些是蛋白水解酶 有可能降解所表達(dá)的重組蛋白 2 在大體積發(fā)酵培養(yǎng)菌體時(shí) 通過熱平衡交換方式把培養(yǎng)溫度從30 提高到42 需要較長的時(shí)間 這種緩慢的升溫方式影響誘導(dǎo)效果 對重組蛋白表達(dá)量有一定的影響 3 pBV220系統(tǒng)表達(dá)的外源蛋白以包含體的形式存在 不易純化 pBG 2是由pBV220系統(tǒng)衍生的便于產(chǎn)物純化的融合表達(dá)載體 該質(zhì)粒在PRPL啟動(dòng)子下游插入G蛋白中與IgGFc段結(jié)合的結(jié)構(gòu)域基因片段180個(gè)核苷酸 下游是多克隆位點(diǎn) 引入了剪切融合蛋白的切點(diǎn) 具有與IgG結(jié)合的活性 可用親和層析 簡化下游工藝 pBG 2 2 pET系統(tǒng)pET系統(tǒng)被認(rèn)為使最有潛力的系統(tǒng)之一插入基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯系統(tǒng)來源于T7噬菌體表達(dá)由位于宿主細(xì)胞染色體上的T7 RNA聚合酶控制克隆宿主可用大腸桿菌K12的HB101 JM103等表達(dá)宿主為BL21 DE3 在LB或M9培養(yǎng)基中生長 IPTG或乳糖誘導(dǎo)外源基因表達(dá)量大 50 表達(dá)質(zhì)粒pET 32a 優(yōu)點(diǎn) 是原核蛋白表達(dá)應(yīng)用最多的系統(tǒng) 在任何大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中 基礎(chǔ)表達(dá)水平最低 真正的調(diào)節(jié)表達(dá)水平的 變阻器 控制 提供各種不同融合標(biāo)簽和表達(dá)系統(tǒng)配置 可溶性蛋白生產(chǎn) 二硫鍵形成 蛋白外運(yùn)和多肽生產(chǎn)等專用載體和宿主菌 以FusionProtein的形式表達(dá)藥物基因許多蛋白質(zhì)藥物與原核生物的蛋白質(zhì)融合后 能保留原有的免疫原性 一些免疫原性弱的多肽制成融合蛋白 其免疫原性能得到加強(qiáng) 用這種融合蛋白免疫動(dòng)物所制備的抗體 能夠用于檢測原來的多肽藥物 也可用于藥代動(dòng)力學(xué)研究 藥物受體研究以及藥物產(chǎn)品的檢測 有些情況下 采用融合蛋白的形式表達(dá)外源基因是不得以而為之 一些多肽藥物在原核細(xì)胞中不穩(wěn)定 難以獲得高表達(dá) 這些蛋白與菌體蛋白融合后得到穩(wěn)定 但融合蛋白需經(jīng)過后處理才能釋放出有活性的外源多肽 多肽藥物的純化通常較為困難 但與特定的原核蛋白融合后 不僅能穩(wěn)定所表達(dá)的產(chǎn)物 還能用識別蛋白的配體進(jìn)行親和層析純化 如GST 融合基因 所產(chǎn)生的融合蛋白可用谷胱甘肽親和柱一次性純化 二 影響目的基因在大腸桿菌中表達(dá)的因素 外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和單個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān) 單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于 外源基因的拷貝數(shù)質(zhì)粒的拷貝數(shù)直接關(guān)系到外源基因的拷貝數(shù) 拷貝數(shù)增加 表達(dá)量增加 外源基因的表達(dá)效率外源基因在大腸桿菌中高效表達(dá)的原理啟動(dòng)子終止子核糖體結(jié)合位點(diǎn)密碼子 轉(zhuǎn)錄 翻譯 啟動(dòng)子和終止子的強(qiáng)弱 大腸桿菌高效表達(dá)需要強(qiáng)的啟動(dòng)子和終止子 外源基因在強(qiáng)啟動(dòng)子的控制下表達(dá) 容易發(fā)生轉(zhuǎn)錄過頭現(xiàn)象 即RNA聚合酶滑過終止子結(jié)構(gòu)繼續(xù)轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒上鄰近的DNA序列 形成長短不一的mRNA混合物過長轉(zhuǎn)錄物的產(chǎn)生在很大程度上會影響外源基因的表達(dá) 對于一些終止作用較弱的終止子 通?？梢圆捎枚垠w終止子串聯(lián)的特殊結(jié)構(gòu) 以增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄終止作用 常見的強(qiáng)啟動(dòng)子 Lac trp tac PL T7 外源基因在大腸桿菌細(xì)胞中的高效表達(dá)不僅取決于轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)的頻率 而且在很大程度上還與mRNA的翻譯起始效率密切相關(guān) mRNA翻譯的起始效率主要由其5 端的結(jié)構(gòu)序列 消除二級結(jié)構(gòu) 所決定 稱為核糖體結(jié)合位點(diǎn) RBS 核糖體結(jié)合位點(diǎn)的有效性 SD序列與翻譯起始密碼子之間的距離SD序列與起始密碼子AUG之間的精確距離保證了mRNA在核糖體上定位后 翻譯起始密碼子AUG正好處于核糖體復(fù)合物結(jié)構(gòu)中的P位 這是翻譯啟動(dòng)的前提條件 在很多情況下 SD序列位于AUG之前大約七個(gè)堿基處 在此間隔中少一個(gè)堿基或多一個(gè)堿基 均會導(dǎo)致翻譯起始效率不同程度的降低 由于原核生物和真核生物基因組中密碼子的使用頻率具有較大程大的差異性 因此外源基因尤其是高等哺乳動(dòng)物基因在大腸桿菌中高效翻譯的一個(gè)重要因素是密碼子的正確選擇 一般而言 有兩種策略可以使外源基因上的密碼子在大腸桿菌細(xì)胞中獲得最佳表達(dá) 外源基因全合成同步表達(dá)相關(guān)tRNA編碼基因 密碼子組成 生物體對密碼子的偏愛性 表達(dá)產(chǎn)物的穩(wěn)定性 組建融合蛋白 利用大腸桿菌的信號肽或真核多肽中自身的信號肽 采用位點(diǎn)突變的方法 選用蛋白酶缺陷型大腸桿菌為宿主細(xì)胞 可能會減弱表達(dá)產(chǎn)物的降解 細(xì)胞代謝負(fù)荷 宿主細(xì)胞的生長與重組質(zhì)粒的復(fù)制分開 細(xì)胞的生長和外源基因的表達(dá)分成兩個(gè)階段 工程菌的培養(yǎng)條件除宿主 載體和克隆基因三者之間的關(guān)系影響外源基因的高水平表達(dá)外 培養(yǎng)條件亦是非常值得研究的因素 三 真核基因在大腸桿菌中的表達(dá)形式 以融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因以原核多肽和真核蛋白結(jié)合在一起稱融合蛋白 優(yōu)點(diǎn) 操作簡便 表達(dá)蛋白在菌體內(nèi)穩(wěn)定 易實(shí)現(xiàn)高效表達(dá) 缺點(diǎn) 只能作抗原用 以非融合蛋白的形式表達(dá)藥物基因非融合蛋白指在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白質(zhì)以真核蛋白的mRNA的AUG為起始 在其氨基端不含細(xì)菌多肽序列 優(yōu)點(diǎn) 保持原有蛋白活性 缺點(diǎn) 易被蛋白酶破壞 分泌型表達(dá)蛋白藥物基因優(yōu)點(diǎn) 在周質(zhì)中穩(wěn)定 有活性 不含蛋氨酸殘基 缺點(diǎn) 產(chǎn)量不高 信號肽不被切割 三 酵母中的基因表達(dá) 一 表達(dá)載體酵母載體是可以攜帶外源基因在酵母細(xì)胞內(nèi)保存和復(fù)制 并隨酵母分裂傳遞到子代細(xì)胞的DNA或RNA單位 1 載體的復(fù)制序列 酵母附加體質(zhì)粒 yeastepisomalplasmid Yep類 酵母復(fù)制型質(zhì)粒 yeastreplicationplasmid Yrp類 酵母著絲粒質(zhì)粒 yeastcentromericplasmid YCp類 酵母整合型質(zhì)粒 yeastinteegrativeplasmid YIp類 1 克隆載體從大腸桿菌中制備質(zhì)粒比從酵母中容易得多 因此酵母質(zhì)粒的加工和制備大部分是通過大腸桿菌進(jìn)行的 只有在最后階段才轉(zhuǎn)入酵母中 這就要求酵母載體也同時(shí)具有在大腸桿菌中復(fù)制和增殖的能力 2 表達(dá)載體將酵母菌的啟動(dòng)子和終止子等有關(guān)控制序列引入載體的適當(dāng)位點(diǎn)后 就構(gòu)成了酵母菌的表達(dá)載體 普通表達(dá)載體 只能方便地引入外源基因并進(jìn)行表達(dá) 對表達(dá)產(chǎn)物的組成 特別是對其N末端氨基酸是否增減并無嚴(yán)格要求 精確表達(dá)載體 要求在啟動(dòng)子或信號肽編碼序列的適當(dāng)部位有內(nèi)切酶點(diǎn) 以利于接入外源基因 并使他在表達(dá)后加工后N末端氨基酸序列與天然產(chǎn)物相同 既無多余的氨基酸 也無缺失的氨基酸 影響目的基因在酵母菌中表達(dá)的因素 外源基因的劑量高穩(wěn)定的高拷貝數(shù)的質(zhì)?？墒雇庠椿蚋咝П磉_(dá) 但高拷貝數(shù)通常會引起細(xì)胞生長量的降低 而單拷貝數(shù)的質(zhì)粒對細(xì)胞的最大生長沒有影響 因而也能達(dá)到高效表達(dá) 外源基因的表達(dá)效率 啟動(dòng)子 組成型和誘導(dǎo)型 分泌信號的效率 終止序列的影響 外源基因表達(dá)產(chǎn)量與細(xì)胞濃度和單個(gè)細(xì)胞平均表達(dá)產(chǎn)量呈正相關(guān) 單個(gè)細(xì)胞產(chǎn)量取決于 外源蛋白的糖基化外源蛋白經(jīng)釀酒酵母糖基化后 可靠有效地以活性型分泌到培養(yǎng)基中 某些蛋白質(zhì)糖基化后更加穩(wěn)定 便于分離精制 宿主菌株的影響 菌體生長力強(qiáng) 菌體內(nèi)源蛋白酶要較弱 菌體性能穩(wěn)定常用的幾乎是突變株 避免使用回復(fù)突變率高的不穩(wěn)定體系 最好使用二倍體或多倍體菌株 分泌能力強(qiáng) 5 培養(yǎng)條件 四 動(dòng)物中的基因表達(dá) 優(yōu)點(diǎn) 產(chǎn)物類似于天然產(chǎn)物 容易分離純化缺點(diǎn) 動(dòng)物細(xì)胞生長慢 培養(yǎng)條件苛刻 費(fèi)用高培養(yǎng)液濃度較小 主要基因工程表達(dá)體系比較 第五節(jié)基因工程菌生長代謝的特點(diǎn) 菌體的生長通常用比生長速率來表示 比生長速率 菌體生長速率與培養(yǎng)基中菌體濃度之比 工程菌培養(yǎng)可通過選用不同的碳源 控制補(bǔ)料和稀釋速率等方法來控制菌體的生長 控制菌體的生長對提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性 減少代謝副產(chǎn)物積累 提高外源蛋白產(chǎn)率有重要意義 大腸桿菌的蛋白 菌體量的比值是基本恒定的 因而菌體的生長速度反映了蛋白質(zhì)的合成速度 培養(yǎng)條件的改變 都會改變菌體的能量代謝和小分子前體的供應(yīng) 影響生物大分子的和成和菌體的生長 一 菌體的生長與能量的關(guān)系 碳源物質(zhì)是組成培養(yǎng)基的主要成分 碳源物質(zhì)為細(xì)胞提供能量 當(dāng)菌體生長所需能量大于菌體有氧代謝提供的能量時(shí) 菌體會產(chǎn)生乙酸 導(dǎo)致培養(yǎng)基的pH值下降 從而影響菌體的生長 適當(dāng)提高pH 可減少乙酸的抑制作用 分批培養(yǎng)中選擇不同的碳源 連續(xù)培養(yǎng)中控制稀釋速率等都能一定范圍內(nèi)控制菌體的生長 從而控制乙酸的產(chǎn)生 減少它的抑制作用 加入蛋氨酸和酵母提取物都能減少乙酸的產(chǎn)生 大腸桿菌中克隆攜帶氧能力的透明顫菌血紅蛋白 VHB蛋白 的基因可提高菌體生長速率 采用磷酸乙酰化酶缺陷株作為宿主細(xì)胞 阻止乙酰輔酶A乙酸產(chǎn)生 可提高產(chǎn)量 二 菌體生長與前體供應(yīng)的關(guān)系 在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入氨基酸 小分子前體 能使菌體蛋白合成增加 比生長率提高 基因工程菌質(zhì)粒的表達(dá)需與宿主細(xì)胞競爭共同的前體和催化結(jié)構(gòu) 致工程菌生長速率降低 質(zhì)粒存在對菌體代謝的影響 中等拷貝質(zhì)粒 56拷貝 的工程菌中與前體合成有關(guān)的酶增加 其質(zhì)粒對工程菌的生長影響不大 高拷貝質(zhì)粒的工程菌 240拷貝 生長速率和菌體總蛋白合成均減少 這與工程菌大量前體被利用引起前體不足 從而產(chǎn)生 嚴(yán)緊反應(yīng) 有關(guān) 嚴(yán)緊反應(yīng)當(dāng)細(xì)菌發(fā)現(xiàn)它們處于很差的生長環(huán)境 沒有足夠的氨基酸來維持蛋白質(zhì)合成時(shí) 它們就會停止大部分活動(dòng) 這種現(xiàn)象稱為嚴(yán)緊反應(yīng) 嚴(yán)緊反應(yīng)產(chǎn)生兩種非正常的核酸堆積物 即ppGpp和pppGpp 統(tǒng)稱 P PPGPP 嚴(yán)緊反應(yīng)機(jī)制 產(chǎn)生鳥苷四磷酸鳥苷五磷酸 激活核糖體RelA蛋白 嚴(yán)緊因子 抑制rRNA基因表達(dá) 核糖體與mRNA結(jié)合抑制其翻譯 氨基酸饑餓 GTPATP p ppGpp的產(chǎn)生機(jī)制 應(yīng)急因子RelA是一種 p ppGpp合成酶 約與5 的核糖體結(jié)合在一起 當(dāng)核糖體A位被空載tRNA占據(jù)時(shí) RelA被激活 一個(gè)空載tRNA進(jìn)入A位就生成一個(gè) p ppGpp p ppGpp的作用 應(yīng)急應(yīng)答使得rRNA和tRNA的合成量大幅減少 10 20 一些mRNA的合成也減少 1 3 蛋白質(zhì)的降解速率增加 許多代謝調(diào)節(jié)作用開始發(fā)生 基因工程菌的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)在重組質(zhì)粒的不穩(wěn)定性 這種不穩(wěn)定性具有下列兩種表現(xiàn)形式 一 質(zhì)粒的不穩(wěn)定性分裂不穩(wěn)定 指工程菌分裂時(shí)出現(xiàn)一定比例不含質(zhì)粒子代菌的現(xiàn)象 結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定 指外源基因從質(zhì)粒上丟失或堿基重排 缺失所致工程菌性能的改變 第六節(jié)基因工程菌的不穩(wěn)定性 影響質(zhì)粒分裂不穩(wěn)定的因素 含質(zhì)粒菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌的頻率 這兩種菌比生長速度率差異的大小 質(zhì)粒穩(wěn)定性的分析方法 樣品 不含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基 10 12h 100個(gè)菌落 含抗性標(biāo)記抗生素平板培養(yǎng)基 10 12h 統(tǒng)計(jì)生長菌落數(shù) 重復(fù)三次 計(jì)算比值 穩(wěn)定性stability 二 提高質(zhì)粒穩(wěn)定性的方法 1 選擇合適的宿主菌受體細(xì)胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解2 選擇合適的載體低拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率高 增加工程菌質(zhì)?？截悢?shù)可提高穩(wěn)定性 高拷貝質(zhì)粒工程菌產(chǎn)生不含質(zhì)粒子代菌頻率低 但如果提高質(zhì)粒拷貝數(shù) 可能抑制菌體生長 對穩(wěn)定性不利 3 施加選擇壓力根據(jù)載體上的抗藥性標(biāo)記 向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的抗生素藥物和食品生產(chǎn)時(shí)禁止使用抗生素加入大量的抗生素會使生產(chǎn)成本增加添加一些容易被水解失活的抗生素 只能維持一定時(shí)間添加抗生素選擇壓力對質(zhì)粒結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定無能為力載體上的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 向培養(yǎng)系統(tǒng)中添加相應(yīng)的營養(yǎng)組份培養(yǎng)基復(fù)雜 成本較高 4 分階段控制培養(yǎng)因外源基因表達(dá)造成質(zhì)粒不穩(wěn)定時(shí) 可以考慮將發(fā)酵過程分階段控制 在生長階段使外源基因處于阻遏狀態(tài) 避免因表達(dá)造成不穩(wěn)定性問題的發(fā)生 在獲得需要的菌體密度后 再去阻遏或誘導(dǎo)外源基因表達(dá) 連續(xù)培養(yǎng)時(shí)可以考慮采用多級培養(yǎng) 如在第一級進(jìn)行生長 維持菌體的穩(wěn)定性 在第二級進(jìn)行表達(dá) 5 控制培養(yǎng)條件工程菌的培養(yǎng)條件對其質(zhì)粒的穩(wěn)定性和表達(dá)效率影響很大可調(diào)控的環(huán)境參數(shù)為 培養(yǎng)基組分 培養(yǎng)溫度 pH和溶解氧濃度 有些含質(zhì)粒的菌對發(fā)酵環(huán)境的改變比不含質(zhì)粒的菌反應(yīng)慢 因而采用間隙改變培養(yǎng)條件的方法以改變這兩種菌的比生長速率 從而改善質(zhì)粒的穩(wěn)定性 通過間隙供氧的方法和通過改變稀釋速率的方法都可提高質(zhì)粒的穩(wěn)定性 培養(yǎng)基組成 限制培養(yǎng)基比豐富培養(yǎng)基更有利于穩(wěn)定培養(yǎng)溫度 較低的培養(yǎng)溫度有利于重組質(zhì)粒的穩(wěn)定 6 固定化固定化可以提高基因重組大腸桿菌的穩(wěn)定性基因重組大腸桿菌進(jìn)行固定化后 質(zhì)粒的穩(wěn)定性及目的產(chǎn)物的表達(dá)率都有了很大提高 在游離重組菌系統(tǒng)中常用抗生素 氨基酸等選擇性壓力穩(wěn)定質(zhì)粒的手段 往往在大規(guī)模生產(chǎn)中難以應(yīng)用 而采用固定化方法后 這種選擇壓力則可被省去 不同的宿主菌及質(zhì)粒在固定化系統(tǒng)中均表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性 中試是上游技術(shù)與工業(yè)化生產(chǎn)的連接環(huán)節(jié) 其目的在于考察一個(gè)上游構(gòu)建成功的重組菌種是否適合未來的產(chǎn)業(yè)化 另外 通過中試還可以獲得大量的產(chǎn)品供臨床試驗(yàn) 同時(shí)中試所得的相關(guān)培養(yǎng) 發(fā)酵 純化等工藝參數(shù)可以做為生產(chǎn)設(shè)計(jì)時(shí)的參考 第七節(jié)基因工程菌的中試 中試應(yīng)考慮的問題 工程菌是否適宜商品化發(fā)酵反應(yīng)器設(shè)計(jì)反應(yīng)過程選擇發(fā)酵培養(yǎng)條件生產(chǎn)工藝最佳方法優(yōu)化工藝監(jiān)測方法工藝控制方法工藝自動(dòng)化使用方法生物催化劑使用方法 如果有的話 產(chǎn)品提取方法分離精制技術(shù)等 一 工程菌選擇 用于中試的工程菌需具備的條件 1 能用一般基因重組技術(shù)獲得2 有高產(chǎn)潛力3 能以工業(yè)原料為培養(yǎng)基 主要是碳源4 生產(chǎn)工藝不復(fù)雜 能一般化5 能產(chǎn)生和分泌蛋白質(zhì) 細(xì)胞外分泌 6 不致病 無毒性7 能安全生產(chǎn) 符合國家衛(wèi)生部門規(guī)定8 代謝可控性 產(chǎn)品有特異性9 發(fā)酵液粘度小等 二 反應(yīng)器 發(fā)酵罐 設(shè)計(jì)符合生物反應(yīng)和化學(xué)工程需要 設(shè)計(jì)基礎(chǔ) 5種生物數(shù)據(jù) 培養(yǎng)細(xì)胞系特性 細(xì)胞生長率 發(fā)酵罐消毒方法 溫度pH溶氧二氧化碳及代謝產(chǎn)物 后處理效果 設(shè)計(jì)中應(yīng)考慮的問題 根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件需要 能連續(xù)發(fā)酵 也可分批發(fā)酵 并附有加料管取料管及測量儀表 易安裝及移動(dòng) 儀表所得數(shù)據(jù)可靠 數(shù)據(jù)重復(fù)性好 可任意安裝附件 罐體材質(zhì)好并打光 避免殘?jiān)e存 三 發(fā)酵培養(yǎng)基組成 1 化學(xué)元素 細(xì)胞生長必需的碳 氮 氧 氫 磷及一些微量元素和金屬離子 2 特殊營養(yǎng)源 氨基酸 維生素等 3 能源 葡萄糖等 4 代謝控制物 生物活性物質(zhì) 或者改變溫度 pH值 誘導(dǎo)菌種改變生長速度或代謝途徑等 目的為增加產(chǎn)量 注意 工業(yè)化生產(chǎn)用培養(yǎng)基以工業(yè)原料為主 以降低生產(chǎn)成本 所以中試時(shí)就要進(jìn)行培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件探索 四 工藝最佳化與參數(shù)監(jiān)測控制1 工藝最佳化 指最快周期 最高產(chǎn)量 最好質(zhì)量 最低能耗 最大安全性 最周全的廢物處理效果 最佳化速度 最低失敗率等 只有在掌握菌種生物特性和發(fā)酵工藝參數(shù)了如指掌 才能設(shè)計(jì)出最佳生產(chǎn)工藝 2 參數(shù)監(jiān)測控制 四種需要監(jiān)測的參數(shù)主要參數(shù) pH 溫度 溶氧 二氧化碳生物量 渾濁度 細(xì)胞組分 總氮量及菌絲干重 碳源 糖 有機(jī)酸 乙醇 淀粉 脂質(zhì)產(chǎn)品 形成時(shí)間 形式 性狀等全自動(dòng)化控制 五 計(jì)算機(jī)的應(yīng)用 全自動(dòng)化控制的基礎(chǔ)熱電耦電極 溫度離子敏感電極 離子pH電極 pH氧化還原電極 還原電位熱量計(jì) 熱平衡可以儲存于計(jì)算機(jī) 通過計(jì)算機(jī)計(jì)算 對比 優(yōu)化選擇 提高產(chǎn)品產(chǎn)量與質(zhì)量 降低原材料與能源消耗 降低成本 最終模擬出一個(gè)高產(chǎn) 高質(zhì) 低成本生產(chǎn)工藝最佳化的控制微生物數(shù)學(xué)公式并實(shí)際運(yùn)用 培養(yǎng)工藝是發(fā)酵工藝的重要組成部分 對外源蛋白的表達(dá)至關(guān)重要 直接影響產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量 從而影響產(chǎn)品成本及市場競爭力 最佳的培養(yǎng)工藝還要考慮對純化工藝的影響 第八節(jié)基因工程菌的培養(yǎng) 一 基因工程菌的培養(yǎng)方式 1 分批培養(yǎng) 培養(yǎng)基的量一次性加入 產(chǎn)品一次性收獲 分批培養(yǎng)操作簡單 但因不能控制生長 獲得的菌體密度也有限 2 補(bǔ)料分批培養(yǎng) 在一次投料發(fā)酵的基礎(chǔ)上 流加一定量的營養(yǎng) 使細(xì)胞進(jìn)一步的生長 可得到更多的代謝產(chǎn)物 3 連續(xù)培養(yǎng) 不斷地流加營養(yǎng) 并不斷地取出發(fā)酵液 連續(xù)培養(yǎng)則多用于動(dòng)力學(xué)特性和穩(wěn)定性等研究 4 透析培養(yǎng) 5 固定化培養(yǎng) 補(bǔ)料分批培養(yǎng)補(bǔ)料分批培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng) 經(jīng)過一段時(shí)間 間歇或連續(xù)地補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基 使菌體進(jìn)一步生長的培養(yǎng)方法 在分批培養(yǎng)中 為保持基因工程菌生長所需的良好微環(huán)境 延長其生長對數(shù)期 獲得高密度菌體 通常把溶氧控制和流加補(bǔ)料措施結(jié)合起來 根據(jù)基因工程菌的生長規(guī)律來調(diào)節(jié)補(bǔ)料的流加速率 基因工程菌培養(yǎng)方式 連續(xù)培養(yǎng)連續(xù)培養(yǎng)是將種子接入發(fā)酵反應(yīng)器中 攪拌培養(yǎng)至菌體濃度達(dá)到一定程度后 開動(dòng)進(jìn)料和出料蠕動(dòng)泵 以一定稀釋率進(jìn)行不間斷培養(yǎng) 但是由于基因工程菌的不穩(wěn)定性 連續(xù)培養(yǎng)比較困難 為了解決這一問題 人們將工程菌的生長階段和基因表達(dá)階段分開 進(jìn)行兩階段連續(xù)培養(yǎng) 基因工程菌培養(yǎng)方式 透析培養(yǎng)透析培養(yǎng)技術(shù)是利用膜的半透性原理使培養(yǎng)物和培養(yǎng)基分離 其主要目的是通過去除培養(yǎng)液中的代謝產(chǎn)物來解除其對生產(chǎn)菌的不利影響 基因工程菌培養(yǎng)方式 發(fā)酵液 透析過的發(fā)酵液 透析膜 乙酸 養(yǎng)分 代謝產(chǎn)物 固定化培養(yǎng)基因工程菌培養(yǎng)的一大難題是如何維持質(zhì)粒的穩(wěn)定性 有人將固定化技術(shù)應(yīng)用到這一領(lǐng)域 發(fā)現(xiàn)基因工程菌經(jīng)固定化后 質(zhì)粒的穩(wěn)定性大大提高 便于進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng) 特別是對分泌型菌更為有利 由于這一優(yōu)點(diǎn) 基因工程菌固定化培養(yǎng)研究已得到迅速開展 基因工程菌的培養(yǎng)方式 二 培養(yǎng)工藝因素 1 培養(yǎng)基 C源的使用是關(guān)鍵2 接種量 一般采用大接種量 10 15 3 溫度 溫度高引發(fā)熱休克效應(yīng) 形成包涵體4 溶解氧 高水平轉(zhuǎn)錄和翻譯需大量能量5 誘導(dǎo)時(shí)機(jī) 對數(shù)期后期 OD600 2 5 6 誘導(dǎo)程序 短時(shí)升溫防止熱休克蛋白過量產(chǎn)生7 pH 大腸桿菌生長期6 8 7 4 蛋白表達(dá)期6 0 6 5 三 基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 基因工程菌培養(yǎng)是為了獲得最大量的基因表達(dá)產(chǎn)物 由于這類物質(zhì)是相對獨(dú)立于細(xì)胞染色體之外的重組質(zhì)粒上的外源基因所合成的 細(xì)胞并不需要的蛋白質(zhì) 因此 培養(yǎng)設(shè)備以及設(shè)備控制應(yīng)滿足獲得高濃度的受體細(xì)胞和高效的表達(dá)基因產(chǎn)物 發(fā)酵罐的組成部分有 發(fā)酵罐體保證高傳質(zhì)作用的攪拌器 精細(xì)的溫度控制和滅菌系統(tǒng) 空氣無菌過濾裝置殘留氣體處理裝置參數(shù)測量與控制系統(tǒng) 如pH O2 CO2等 培養(yǎng)液配制及連續(xù)操作裝置等 基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 基因工程菌在發(fā)酵培養(yǎng)過程中要求環(huán)境條件恒定 不影響其遺傳特性 更不能引起所帶質(zhì)粒丟失 對發(fā)酵罐有特殊要求如要提供菌體生長的最適條件培養(yǎng)過程不得污染保證純菌培養(yǎng)培養(yǎng)及消毒過程中不得游離出異物 干擾細(xì)菌代謝活動(dòng) 基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 1 發(fā)酵罐的結(jié)構(gòu)材料的穩(wěn)定性要好 一般要應(yīng)用不銹鋼制成2 罐體表面光滑易清洗 滅菌時(shí)沒有死角3 所有的連接接口均要用密封圈封閉 不留 死腔 不得有泄漏4 發(fā)酵罐的排氣口須有蒸汽滅菌或微孔濾器除菌后才將廢氣放出 5 攪拌器轉(zhuǎn)速和通氣應(yīng)適當(dāng)6 與發(fā)酵罐連接的閥門要用膜式閥 不用球形閥7 空氣過濾系統(tǒng)要采用活性碳和玻璃纖維棉材料8 培養(yǎng)液要經(jīng)化學(xué)處理或熱處理后才可排放9 軸封可采用磁力攪拌或雙端面密封 基因工程菌的培養(yǎng)設(shè)備 第十節(jié)基因工程藥物的分離純化 基因工程藥物大部分為多肽或蛋白質(zhì) 其分離 純化非常重要 特點(diǎn) 目的產(chǎn)物在初始物料中含量較低 含有大量細(xì)胞及代謝產(chǎn)物 表達(dá)產(chǎn)物穩(wěn)定性差 易失活變性 表達(dá)產(chǎn)物的種類繁多 結(jié)構(gòu)不一 成品要求純度高 無菌 無熱原 一 建立分離純化工藝的依據(jù) 含目的產(chǎn)物的起始物料的特點(diǎn)基因工程菌的發(fā)酵產(chǎn)物其上游過程的各種因素對分離 純化工藝有影響 包括 菌種的類型及其代謝特性 原材料和培養(yǎng)基的來源及其質(zhì)量 生產(chǎn)工藝及條件 初始物料的物理 化學(xué) 生物學(xué)性質(zhì) 物料中雜質(zhì)的種類和性質(zhì) 目的產(chǎn)物特性 產(chǎn)品質(zhì)量的要求 二 分離純化的基本過程 發(fā)酵液細(xì)胞分離胞內(nèi)產(chǎn)物胞外產(chǎn)物細(xì)胞破碎固液分離可溶性蛋白包含體細(xì)胞碎片分離變性復(fù)性 濃縮初步分離高度純化制劑產(chǎn)品 三 分離純化的技術(shù) 分離純化的技術(shù)要求 技術(shù)條件溫和能保持產(chǎn)物生物活性 選擇性好 能從復(fù)雜的混合物中有效的將目的產(chǎn)物分離 達(dá)到較高的純化倍數(shù) 收率高 成本低 兩個(gè)技術(shù)間能直接銜接 不需要對物料加以處理 純化過程要快 滿足高生產(chǎn)率的要求 細(xì)胞破碎與固液分離 細(xì)胞收集 離心法 生物膜分離法 細(xì)胞破碎 是否加外力 機(jī)械破碎法 非機(jī)械破碎法 所用方法屬性 物理法 化學(xué)法 生物法 固液分離 高速離心 膜過濾 雙相萃取 目的產(chǎn)物含有大量雜質(zhì)必須進(jìn)行分離純化 蛋白質(zhì)分離純化方法的設(shè)計(jì)根據(jù)其分子的理化性質(zhì)和生物學(xué)特性來決定 五 重組蛋白的分離純化 產(chǎn)物特性作用等電點(diǎn)決定離子交換種類及條件相對分子量選擇不同孔徑的介質(zhì)疏水性與疏水 反相介質(zhì)結(jié)合的程度生物特異性決定親和配基溶解性決定分離體系及蛋白濃度穩(wěn)定性決定工藝采用溫度及流程時(shí)間 產(chǎn)物的特性 分離純化方法 層析 chromatography A離子交換層析B疏水層析C親和層析D凝膠過濾層析 A離子交換層析離子交換層析的基本原理離子交換介質(zhì)的基本性質(zhì)離子交換介質(zhì)的選擇原則 外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化方法 離子交換層析的基本原理 離子交換層析是以離子交換劑為固定相 以特定的含離子溶液為流動(dòng)相 利用離子交換劑對待分離的各種離子結(jié)合力的差異 而將混合物中不同離子進(jìn)行分離的層析技術(shù) 離子交換劑 通常是一種不溶性高分子化合物如纖維素 葡聚糖 瓊脂糖等 離子交換劑中所含的可解離基團(tuán)在水溶液中能與溶液中的其它陽離子或陰離子起交換作用 離子交換劑 陽離子交換劑 強(qiáng)酸型和弱酸型可電離的基團(tuán)磺酸基 SO3H 磷酸基 PO3H2 羧酸基 COOH 酚羥基 OH 陰離子交換劑 強(qiáng)堿型和弱堿型可電離的基團(tuán)伯胺基 NH2 仲胺基 NHCH3 叔胺基 N CH3 2 季胺基 N CH3 3 離子交換劑的分類 常用的離子交換劑離子交換纖維素 離子交換纖維素是攜帶功能基團(tuán)纖維素衍生物 具有松散的親水性網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)以及較大的表面積 大分子可以自由通過 因而對生物大分子 如蛋白質(zhì) 的交換容量比離子交換樹脂大 陽離子型離子交換纖維素包括羥甲基纖維素 CM纖維素 等陰離子型離子交換纖維素包括二乙基氨基乙基纖維素 DEAE纖維素 常用的離子交換劑離子交換葡聚糖 離子交換葡聚糖是葡聚糖經(jīng)環(huán)氧氯丙烷交聯(lián)后形成的具有多孔三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)和離子交換功能基團(tuán)的多糖衍生物 SephadexG 常用的離子交換葡聚糖包括 陽離子交換劑CM SephadexC 25CM SephadexC 50陰離子交換劑DEAE SephadexA 25DEAE SephadexA 50 常用的離子交換劑離子交換瓊脂糖 離子交換瓊脂糖是攜帶DEAE或CM基團(tuán)的SepharoseCL 6BDEAE Sepharose 陰離子型 和CM Sepharose 陽離子型 的離子交換介質(zhì)具有硬度大 性質(zhì)穩(wěn)定 流速好 分離能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn) 離子交換介質(zhì)的選擇原則一般而言 酸性物質(zhì)用陰離子交換劑分離堿性物質(zhì)用陽離子交換劑分離氨基酸 核苷酸 蛋白質(zhì)等兩性電解質(zhì) 可根據(jù)其pI值及離子化曲線來選擇 離子交換介質(zhì)的選擇原則 1 2 3 4 6 7 8 9 10 5 pH 蛋白質(zhì)凈電荷 等電點(diǎn) 吸附陰離子交換劑 吸附陽離子交換劑 pHpI 對pI 5的某酸性蛋白質(zhì)當(dāng)pH5 5 9 0的范圍內(nèi)時(shí) 蛋白質(zhì)為陰離子 應(yīng)首選DEAE纖維素 當(dāng)pH3 5 4 5的范圍內(nèi)時(shí) 蛋白質(zhì)為陽離子 應(yīng)首選CM纖維素 B疏水層析 疏水層析 HIC 是根據(jù)分子表面疏水性差別來分離蛋白質(zhì)和多肽等生物大分子的一種較為常用的方法 疏水性弱的物質(zhì) 在較高離子強(qiáng)度的溶液時(shí)被洗脫下來 當(dāng)離子強(qiáng)度降低時(shí) 疏水性強(qiáng)的物質(zhì)才隨后被洗脫下來 疏水配基 烷基鏈配基 芳基配基 高分子配基 疏水基質(zhì) 應(yīng)用最廣泛 良好的生物相容性和化學(xué)穩(wěn)定性 基本操作 平衡Equilibration上樣Sampleapplication洗雜Washing洗脫Elution C親和層析親和層析的原理親和層析載體的性質(zhì)與選擇親和層析配基的性質(zhì)與選擇 親和層析的原理親和層析 利用固定化配基與目的蛋白質(zhì)之間特異的生物親和力進(jìn)行吸附 如抗體與抗原 受體與激素 酶與底物之間的作用 配基 在親和層析中起可逆性結(jié)合的特異性物質(zhì) 載體 與配基結(jié)合的支撐物 親和層析的特點(diǎn) 1 純化過程簡單 迅速 且分離效率高 2 特別適用于分離純化一些含量低 穩(wěn)定性差的生物大分子 3 純化倍數(shù)大 產(chǎn)物純度高 4 必須針對某一分離對象制備專一的配基及尋求穩(wěn)定的層析條件 因此應(yīng)用范圍受到一定的限制 常用的親和層析載體纖維素葡聚糖凝膠瓊脂糖凝膠聚丙烯酰胺凝膠其它新型載體 親和層析配基的選擇 純化對象和配基之間必須有較強(qiáng)的親和力 但親和力太高也是有害的 因?yàn)樵诮怆x配基復(fù)合物時(shí)所需的條件就要強(qiáng)烈 這樣可