4動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)大實(shí)驗(yàn).ppt

實(shí)驗(yàn)九培養(yǎng)細(xì)胞的凍存 培養(yǎng)細(xì)胞要即時(shí)留種 轉(zhuǎn)運(yùn) 須要進(jìn)行保存操作 方法 不斷傳代法 低溫保存法 20 超低溫凍存法 196 細(xì)胞數(shù)對(duì)數(shù)值 培養(yǎng)時(shí)間 周 024810121420 細(xì)胞系 無(wú)限細(xì)胞系 死亡 原代 第一次傳代 轉(zhuǎn)化 超低溫凍存 難點(diǎn) 冷凍速度過(guò)慢 當(dāng)溫度降到冰點(diǎn)時(shí) 細(xì)胞外的水分會(huì)形成冰晶 滲透作用使細(xì)胞脫水 蛋白質(zhì)及酶活性改變 造成化學(xué)損傷 冷凍速度過(guò)塊 細(xì)胞內(nèi)水分來(lái)不及滲出 形成冰晶 破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu) 造成物理傷害 細(xì)胞代謝 生長(zhǎng)完全停止 但不會(huì)喪失形態(tài)發(fā)生的潛能 不會(huì)使遺傳性狀改變 理論上可無(wú)限期保存 辦法 冷凍保護(hù)劑 可滲透入細(xì)胞 與水分子結(jié)合 降低細(xì)胞冰點(diǎn) 使細(xì)胞內(nèi)水分有時(shí)間充分滲出 從而減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成 冷凍速度 25 以上 按1 2 min的梯度降溫 25 以下 按5 10 min的梯度降溫 達(dá)到 100 時(shí) 投入液氮 196 二甲亞砜 DMSO 冰點(diǎn) 體液 甘油 繭蜂 超冷 實(shí)驗(yàn)用品 手術(shù)器件 1套 移液管 1包 凍存管 2個(gè) 離心管 2支 小青瓶 1個(gè) 吸管 1包 Hanks液 1瓶 消化液 1瓶 完全培養(yǎng)液 1瓶 二甲基亞砜 DMSO 水浴箱 液氮罐 凍存盒 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛 即可進(jìn)行凍存 取培養(yǎng)瓶倒掉培養(yǎng)液 加5mlHanks液 輕洗后倒出 加入3ml消化液 擰緊瓶蓋 平握在手中 消化約10 15分鐘 其間不時(shí)輕搖幾次 鏡下觀察細(xì)胞變圓 脫落漂動(dòng)時(shí) 加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化 同時(shí)吹打分散細(xì)胞后 移入離心管 離心 除去上清 再加入適量Hanks液 漂洗1次 離心 除去上清 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 加入2 5ml完全培養(yǎng)液 制成細(xì)胞懸液 移2ml完全培養(yǎng)液于青瓶中 再移入0 5mlDMSO 混勻?yàn)閮龃姹Ｗo(hù)液 然后 滴加 到 的離心管中 混勻制成細(xì)胞懸液 分裝到 個(gè)凍存管中 液面離管口2mm 擰緊蓋 標(biāo)記號(hào) 將凍存管放入凍存盒 5分鐘后將凍存盒放入 20 冰箱 30分鐘后取出凍存管放入凍存提桶 置液氮罐口 逐漸下降 8分鐘內(nèi)降至液氮面上 2分鐘后沉入液氮中 注意 周四下午進(jìn)行 復(fù)蘇 實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程 觀察培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛 即可進(jìn)行凍存 取培養(yǎng)瓶倒掉培養(yǎng)液 加5mlHanks液 輕洗后倒出 加入3ml消化液 擰緊瓶蓋 平握在手中 消化約10 15分鐘 其間不時(shí)輕搖幾次 鏡下觀察細(xì)胞變圓 脫落漂動(dòng)時(shí) 加入5ml完全培養(yǎng)液終止消化 同時(shí)吹打分散細(xì)胞后 移入離心管 離心 除去上清 再加入適量Hanks液 漂洗1次 離心 除去上清 加入2 5ml完全培養(yǎng)液 制成細(xì)胞懸液 移 ml完全培養(yǎng)液于青瓶中 再移入 mlDMSO 混勻?yàn)閮龃姹Ｗo(hù)液 然后 滴加 到 的離心管中 混勻制成細(xì)胞懸液 分裝到 個(gè)凍存管中 液面離管口2mm 擰緊蓋 將凍存管放入凍存盒 分鐘后將凍存盒放入 冰箱 分鐘后取出凍存管放入凍存提桶 置液氮罐口 逐漸下降 分鐘內(nèi)降至液氮面上 分鐘后沉入液氮中 實(shí)驗(yàn)十培養(yǎng)細(xì)胞的復(fù)蘇 使用凍存細(xì)胞時(shí) 需要進(jìn)行復(fù)蘇 復(fù)蘇過(guò)程中 復(fù)溫速度不當(dāng) 也可能引起細(xì)胞內(nèi)重結(jié)冰 造成細(xì)胞損失 復(fù)蘇原則是快速融化 1 2min內(nèi)恢復(fù)到常溫 以保證細(xì)胞外的冰晶快速融化 進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的水分也來(lái)不及形成冰晶 復(fù)蘇時(shí) 保護(hù)劑又可促進(jìn)細(xì)胞外水分進(jìn)入胞內(nèi) 緩解滲透性腫脹引起的細(xì)胞損傷 實(shí)驗(yàn)用品 液氮罐 凍存管 40水浴 離心管 1包 完全培養(yǎng)液 培養(yǎng)瓶 2個(gè) 1 取出凍存管 立即投入40 溫水中 并充分搖動(dòng) 使其快速融化 2 將細(xì)胞懸液移至含 ml完全培養(yǎng)液的離心管中 離心 棄上清 加入 ml完全培養(yǎng)液 懸浮細(xì)胞 移入培養(yǎng)瓶 松蓋入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 1日后 正