12《基因工程的基本操作程序》課件.ppt

1 2基因工程的基本操作程序 1 目的基因的獲取 2 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 3 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 4 目的基因的檢測與鑒定 基因工程基本操作的四個步驟 有了目的基因 我們才能賦予一種生物以另一種生物的遺傳特性 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并可進(jìn)行遺傳 表達(dá)和發(fā)揮作用 載體進(jìn)入受體細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá) 才能實現(xiàn)一種生物的基因在另一種生物中的轉(zhuǎn)化 才能確定目的基因是否真正在受體細(xì)胞中穩(wěn)定遺傳和正確表達(dá) 一 目的基因的獲取 一 目的基因主要是 編碼蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)基因 請舉出三個以上的例子 二 獲取目的基因的常用方法有哪些 1 從基因文庫中獲取 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增 3 人工合成 請閱讀P9第一和二兩段 一 目的基因的獲取 一 從基因文庫中直接獲取 1 基因文庫 概念見P9 2 基因文庫的分類 按外源DNA片段的來源分類 種類 基因組DNA文庫 含有一種生物的全部基因 部分基因文庫 只包含了一種生物的部分基因 如 cDNA文庫 3 基因文庫的目的 為了在不知目的基因序列的情況下 便于獲得所需的目的基因 4 獲取目的基因的根據(jù) 見課本P9 提取某種生物的全部DNA 用適當(dāng)?shù)南拗泼盖?一定大小的DNA片段 將DNA片段與載體連接 導(dǎo)入受體菌中儲存 基因組文庫 5 基因文庫的構(gòu)建方法之一 1 直接分離法 鳥槍法 某種生物的單鏈mRNA 單鏈互補(bǔ)DNA 雙鏈cDNA片段 導(dǎo)入受體菌中儲存 與載體連接 cDNA文庫 反 逆 轉(zhuǎn)錄酶 DNA聚合酶 反轉(zhuǎn)錄法 cDNA的合成流程圖解 5 基因文庫的構(gòu)建方法之 基因組文庫和部分基因組文庫 cDNA文庫 比較 2 利用PCR技術(shù)擴(kuò)增目的基因 四種脫氧核苷酸 dNTP 一對引物 熱穩(wěn)定DNA聚合酶 Taq酶 模板DNA 需含有目的基因 Mg2 激活劑 條件 緩沖溶液 一對寡核苷酸序列 與目的基因的起始段互補(bǔ) 一段已知目的基因的核苷酸序列 以便根據(jù)這一序列合成引物 前提 過程 高溫變性 解旋為單鏈 低溫退火 引物與單鏈互補(bǔ)結(jié)合 適溫延伸 在Taq酶的作用下合成與模板互補(bǔ)的DNA雙鏈 重復(fù)循環(huán) 預(yù)變性 增加DNA變性的概率 2 具體過程 PCR 多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 概念 PCR全稱為 是一項在生物 復(fù)制 的核酸合成技術(shù) 條件 等 原理 方式 以 方式擴(kuò)增 即 n為擴(kuò)增循環(huán)的次數(shù) 結(jié)果 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 體外 特定DNA片段 DNA復(fù)制 四種脫氧核苷酸 一對引物 DNA聚合酶 指數(shù) 2n 使目的基因的片段在短時間內(nèi)成百萬倍地擴(kuò)增 要有一段已知目的基因的核苷酸序列 前提條件 過程 a DNA變性 90 95 雙鏈DNA模板在熱作用下 斷裂 形成 b 退火 復(fù)性55 65 系統(tǒng)溫度降低 引物與DNA模板結(jié)合 形成局部 c 延伸 70 75 在Taq酶的作用下 合成與模板互補(bǔ)的 氫鍵 單鏈DNA 雙鏈 DNA鏈 PCR技術(shù)擴(kuò)增與DNA復(fù)制的比較 堿基互補(bǔ)配對 四種脫氧核苷酸 模板 能量 酶 DNA在高溫下變性解旋 解旋酶催化 體外復(fù)制 細(xì)胞核內(nèi) 熱穩(wěn)定的DNA聚合酶 細(xì)胞內(nèi)的DNA聚合酶 大量的DNA片段 形成整個DNA分子 目的基因的mRNA 單鏈DNA cDNA 雙鏈DNA 即目的基因 反轉(zhuǎn)錄 合成 1 反轉(zhuǎn)錄法 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使RNA為模板 反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈DNA 然后在酶的作用下合成雙鏈DNA 從而獲得所需的基因 蛋白質(zhì)的氨基酸序列 mRNA的核苷酸序列 結(jié)構(gòu)基因的核苷酸序列 目的基因 推測 推測 化學(xué)合成 2 根據(jù)已知的氨基酸序列合成DNA法 3 人工合成的目的基因 二 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 基因工程的核心 1 目的 所需物質(zhì) 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在 并且可以遺傳給下一代 同時使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用 它們各自的作用是什么 2 基因表達(dá)載體的組成 復(fù)制原點 目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因 它們各自的作用是什么 啟動子 位于基因的首端的一段特殊的DNA片斷 它是RNA聚合酶識別和結(jié)合的部位 有了它才能驅(qū)動基因轉(zhuǎn)錄出mRNA 最終獲得蛋白質(zhì)終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 能終止mRNA的轉(zhuǎn)錄標(biāo)記基因的作用是為了鑒別受體細(xì)胞中是否含有目的基因 從而將有目的基因的細(xì)胞篩選出來 載體與表達(dá)載體的區(qū)別 二者都有標(biāo)記基因和復(fù)制原點兩部分DNA片段 表達(dá)載體在載體基礎(chǔ)上增加了目的基因 啟動子 終止子三部分結(jié)構(gòu) 用到的工具酶 既用到限制酶切割載體 又用到DNA連接酶將目的基因和載體拼接 兩種酶作用的化學(xué)鍵都是磷酸二酯鍵 啟動子 終止子對于目的基因表達(dá)必不可少 目的基因不能單獨進(jìn)入受體細(xì)胞 必需以表達(dá)載體的方式攜帶進(jìn)去 注意 三 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 一 轉(zhuǎn)化 二 方法 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 基因槍法 花粉管通道法 顯微注射法 感受態(tài)細(xì)胞 目的基因進(jìn)入 內(nèi) 并且在受體細(xì)胞內(nèi)維持 和 的過程 受體細(xì)胞 穩(wěn)定 表達(dá) 1 將目的基因?qū)胫参锛?xì)胞的方法 1 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 農(nóng)桿菌特點 易感染雙子葉植物和裸子植物 對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力 原理 Ti質(zhì)粒上的T DNA可以轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞 并整合到受體細(xì)胞染色體的DNA上 過程 優(yōu)點 2 基因槍法 3 花粉管通道法 2 將目的基因?qū)雱游锛?xì)胞 方法 顯微注射法 程序 目的基因表達(dá)載體提純?nèi)÷?受精卵 顯微注射受精卵新性狀動物 3 將目的基因?qū)胛⑸锛?xì)胞 原核生物特點 繁殖快 單細(xì)胞 遺傳物質(zhì)少 方法 用Ca2 處理細(xì)胞感受態(tài)細(xì)胞表達(dá)載體與感受態(tài)細(xì)胞混合感受態(tài)細(xì)胞吸收DNA分子 四 目的基因的檢測與鑒定 檢查是否成功 一 檢測 1 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 關(guān)鍵步驟 首先取出轉(zhuǎn)基因生物的基因組DNA 用含目的基因的DNA片段用放射性同位素等作標(biāo)記 以此做探針 使探針和轉(zhuǎn)基因生物的基因組雜交 若顯示出雜交帶 表明染色體已插入染色體DNA中 1 方法 DNA分子雜交 2 過程 歸納步驟 DNA分子雜交示意圖 采用一定的技術(shù)手段 將兩種生物的DNA分子的單鏈放在一起 如果這兩個單鏈具有互補(bǔ)的堿基序列 那么 互補(bǔ)的堿基序列就會結(jié)合在一起 形成雜合雙鏈區(qū) 在沒有互補(bǔ)堿基序列的部位 仍然是兩條游離的單鏈 P15思考與探究 二 鑒定 個體生物學(xué)水平 2 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 3 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 分子雜交 方法 抗原抗體雜交 過程 用上述探針和轉(zhuǎn)基因生物的mRNA雜交 若出現(xiàn)雜交帶 表明目的基因轉(zhuǎn)錄出了mRNA 歸納步驟 四 目的基因的檢測與鑒定 檢查是否成功 檢測 鑒定 檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的DNA上是否插入了目的基因 檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA 檢測目的基因是否翻譯成蛋白質(zhì) 抗蟲鑒定 抗病鑒定 活性鑒定等 方法 方法 方法 DNA分子雜交 分子雜交 注意與上不同之處 抗原抗體雜交 歸納 基因工程的基本操作程序 獲取目的基因從基因文庫利用PCR化學(xué)方法人工合成構(gòu)建基因表達(dá)載體目的基因 啟動子 終止子 標(biāo)記基因?qū)⒛康幕驅(qū)胧荏w細(xì)胞農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法 顯微注射法目的基因的檢測與鑒定檢測 是否插入 轉(zhuǎn)錄 翻譯鑒定 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 1 獲得耐鹽基因后 構(gòu)建重組DNA分子所用的限制性內(nèi)切酶作用于圖中的處 DNA連接酶作用于處 填 a 或 b a a 練習(xí)1 2008理綜山東卷 為擴(kuò)大可耕地面積 增加糧食產(chǎn)量 黃河三角洲等鹽堿地的開發(fā)利用備受關(guān)注 我國科學(xué)家應(yīng)用耐鹽基因培育出了耐鹽水稻新品系 2 將重組DNA分子導(dǎo)入水稻受體細(xì)胞的常用方法有農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法和法 3 由導(dǎo)入目的基因的水稻細(xì)胞培養(yǎng)成植株需要利用技術(shù) 該技術(shù)的核心是和 4 為了確定耐鹽轉(zhuǎn)基因水稻是否培育成功 既要用放射性同位素標(biāo)記的作探針進(jìn)行分子雜交檢測 又要用方法從個體水平鑒定水稻植株的耐鹽性 基因槍法 花粉管通道法 植物組織培養(yǎng) 脫分化和再分化 耐鹽基因 一定濃度鹽水澆灌 1 以下說法正確的是 A 所有的限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列B 質(zhì)粒是基因工程中唯一的運(yùn)載體C 運(yùn)載體必須具備的條件之一是 具有多個限制酶切點 以便與外源基因連接D 基因控制的性狀都能在后代表現(xiàn)出來 C 練習(xí) 2 不屬于質(zhì)粒被選為基因運(yùn)載體的理由是A 能復(fù)制 B 有多個限制酶切點C 具有標(biāo)記基因D 它是環(huán)狀DNA D 練習(xí) 3 有關(guān)基因工程的敘述中 錯誤的是 A DNA連接酶將黏性末端的堿基對連接起來B 限制性內(nèi)切酶用于目的基因的獲得C 目的基因須由運(yùn)載體導(dǎo)入受體細(xì)胞D 人工合成目的基因不用限制性內(nèi)切酶 A 練習(xí) 4 有關(guān)基因工程的敘述正確的是 A 限制酶只在獲得目的基因時才用B 重組質(zhì)粒的形成在細(xì)胞內(nèi)完成C 質(zhì)粒都可作為運(yùn)載體D 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)可為合成目的基因提供資料 D 練習(xí) 5 基因工程是在DNA分子水平上進(jìn)行設(shè)計施工的 在基因操作的基本步驟中 不進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對的步驟是 A 人工合成目的基因B 目的基因與運(yùn)載體結(jié)合C 將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞D 目的基因的檢測和表達(dá) C 練習(xí) 知識點一 1 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點 啟動子 終止子 啟動子 位于基因首端一段能與RNA聚合酶結(jié)合并能起始mRNA合成的序列 沒有啟動子 基因就不能轉(zhuǎn)錄 終止子 位于基因的尾端的一段特殊的DNA片斷 它能阻礙RNA聚合酶的移動 并使其從DNA模板鏈上脫離下來 使轉(zhuǎn)錄終止 RNA聚合酶 能夠識別啟動子上的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種蛋白質(zhì) 以模板轉(zhuǎn)錄然后脫落 不能轉(zhuǎn)錄為信使RNA 不能編碼蛋白質(zhì) 能轉(zhuǎn)錄相應(yīng)的信使RNA 能編碼蛋白質(zhì) 編碼區(qū) 非編碼區(qū) 原核細(xì)胞的基因結(jié)構(gòu) 有調(diào)控遺傳信息表達(dá)的核苷酸序列 在該序列中 最重要的是位于編碼區(qū)上游的RNA聚合酶結(jié)合位點 非編碼區(qū) 非編碼區(qū) 編碼區(qū) 編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 啟動子 終止子 編碼區(qū) 與RNA聚合酶結(jié)合位點 內(nèi)含子 外顯子 能夠編碼蛋白質(zhì)的序列叫做外顯子 不能夠編碼蛋