2012高中生物實(shí)驗(yàn)13DNA片段的PCR擴(kuò)增輔導(dǎo)教案 浙科版

1 輔導(dǎo)教案輔導(dǎo)教案 導(dǎo)學(xué)誘思導(dǎo)學(xué)誘思 DAOXUEYOUSIDAOXUEYOUSI 一 PCR 技術(shù) 1 PCR 的全稱是 2 PCR 技術(shù)是用于 DNA 片段復(fù)制 擴(kuò)增的生化技術(shù) 3 PCR 技術(shù)用途 除用于基因擴(kuò)增外 還用于 4 PCR 技術(shù)的具體應(yīng)用 在法學(xué) 醫(yī)學(xué) 食品和考古學(xué)上也是重要的實(shí)用工具 如 鑒定 鑒定 食品質(zhì)量的確定 病診斷 腫瘤病和其他疾病的診斷以及 考古中人種的確定等 答案 答案 1 聚合酶鏈反應(yīng) 3 測(cè)定 DNA 序列 4 親子 犯罪 遺傳 二 DNA 的體內(nèi)自我復(fù)制與 PCR 技術(shù) DNA 聚合酶在有 的存在時(shí) 利用 4 種 可從 末端向 末端 合成新鏈 PCR 技術(shù)還需要 作為 這一段叫 答案 答案 DNA 模板 脫氧核苷三磷酸 5 3 與 DNA 模板互補(bǔ)的一段單鏈 DNA 聚合 酶作用的起點(diǎn) 引物 三 PCR 作用的過(guò)程 1 1 個(gè)循環(huán)的操作 步驟具體操作 雙鏈 DNA 將雙鏈 DNA 加熱至 DNA DNA 之間 的 打開(kāi) 雙鏈分離 也叫做 續(xù)表 步驟具體操作 與 結(jié)合雙鏈分離后 將溫度 這一降 2 溫過(guò)程叫 退火后 引物可與 2 個(gè) 分別結(jié)合 DNA 新鏈的 下 聚合酶可利用 組裝模板 的互補(bǔ)鏈 從引物延伸至 末端 2 一般大約需要重復(fù)上述 3 步驟 個(gè)循環(huán) 3 結(jié)果 一個(gè)循環(huán)形成 個(gè)雙鏈 DNA 在 20 個(gè)循環(huán)后 大約 1h 1 個(gè) DNA 片段可擴(kuò)增 上百萬(wàn)個(gè)拷貝 30 個(gè)循環(huán)可產(chǎn)生 10 億個(gè)拷貝 答案 答案 1 分開(kāi) 95 變性 氫鍵 解鏈 引物 迅速降至 40 60 退火 單鏈的 DNA 模 板 延伸 72 4 種 dNTP 3 2 15 30 3 2 四 實(shí)驗(yàn)操作 1 設(shè)備 用品 略 2 材料 凝膠 DNA 標(biāo)樣 PCR 試劑盒 TBE 緩沖液 0 1 亞甲藍(lán) 3 步驟 文字說(shuō)明 取 3 個(gè) 0 5 mL 微量離心管 分別記做 1 2 3 號(hào) 用取樣器按表一加入試劑 關(guān)閉上蓋并 在振蕩器上振蕩 20 s 使之混合均勻 將 3 個(gè)微量離心管放在固定器上 保證每管中的液面在水浴中的水面以下 依表二的時(shí)間依 次放入 3 個(gè)水浴進(jìn)行 PCR 將 TBE 緩沖液加入到電泳槽中 使緩沖液高出凝膠面 3 4 mm 再將樣品加入凝膠板的加樣孔中 所 加順序內(nèi)容依次為 凝膠板中的加樣情況說(shuō)明表凝膠板中的加樣情況說(shuō)明表 加樣孔編號(hào) 對(duì)應(yīng)右 圖所示 1234 離心管中樣品標(biāo)號(hào) SA1A2A3 所 加 樣 品 1 號(hào)樣品 20 微升 DNA 標(biāo) 準(zhǔn)溶液 PCR 產(chǎn)物 1 72 1min 后 得到的 PCR 產(chǎn)物 2 72 1min 70 2min 后得到 對(duì)照組產(chǎn)物 3 的 2 號(hào)樣品 2 微升 藍(lán)色緩沖液 1 號(hào)樣品與 2 號(hào)樣品必須充分混勻后再加入 開(kāi)始進(jìn)行電泳 若用 18 V 電池的電泳 4 6 h 若甲直流電泳儀電源 80 V 可電泳 40 min 電泳后將凝膠緩沖液倒出 緩沖液可再利用 將 10 mL 染色劑 亞甲藍(lán) 覆蓋在凝膠表面 15 20 min 后移去 可再利用 再加入 5 mL70 乙醇 不斷搖動(dòng) 1 2 min 使其分布均 勻 再除去 加入冷水 幾分鐘后看到藍(lán)色的區(qū)帶出現(xiàn) 這就是擴(kuò)增的 DNA 比較 判斷膠片結(jié)果 圖表輔助 表一 試劑1 號(hào)管 12 個(gè)循環(huán) 2 號(hào)管 14 個(gè)循環(huán) 3 號(hào)管 對(duì)照 PCR 混 合液 2020 蒸餾 水 20 引物 202020 模板 DNA 101010 總體 積 505050 4 表二 時(shí)間溫度目的 2 min 30 s 30 s 1 min 2 min 95 95 49 72 70 開(kāi)始變性 解鏈 最后擴(kuò)增 5 膠片染色結(jié)果 核心解讀核心解讀 HEXINJIEDUHEXINJIEDU 1 為什么 DNA 復(fù)制需要引物 DNA 的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?為了明確地表示 DNA 的方向 通常將 DNA 的羥基末端稱為 3 端 而磷酸基團(tuán)的末端稱為 5 端 DNA 聚合酶不能從頭開(kāi)始合成 DNA 而只能從 3 端 延伸 DNA 鏈 因此 DNA 復(fù)制需要引物 當(dāng)引物與 DNA 母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合后 DNA 聚合酶就能從引物的 3 端開(kāi)始延伸 DNA 鏈 DNA 的合成方向總是從子鏈的 5 端向 3 端延 伸 DNA 復(fù)制方向的示意圖 2 細(xì)胞內(nèi)參與 DNA 復(fù)制的各種組成成分和作用是怎樣的 參與的組 分 在 DNA 復(fù)制中的作用 解旋酶打開(kāi) DNA 雙鏈 DNA 母鏈提供 DNA 復(fù)制的模板 4 種脫氧核 苷酸 合成子鏈的原料 DNA 聚合酶催化合成 DNA 子鏈 6 引物 使 DNA 聚合酶能夠從引物的 3 端開(kāi)始連接脫 氧核苷酸 3 細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制與體外 DNA 擴(kuò)增 PCR 技術(shù) 相同嗎 兩者又有什么關(guān)聯(lián)呢 細(xì)胞內(nèi)的 DNA 復(fù)制與體外 DNA 擴(kuò)增 PCR 技術(shù) 是不同的 兩者具體比較見(jiàn)下表 細(xì)胞內(nèi) DNA 復(fù)制 PCR 解旋有解旋酶的參與 邊解旋邊復(fù)制80 100 高度解旋 雙鏈完全分開(kāi) 酶DNA 解旋酶 DNA 聚合酶 DNA 連接酶TaqDNA 聚合酶 引物 RNA DNA 或 RNA 能量 ATP 不加 不 同 點(diǎn) 溫度體內(nèi)溫和條件高溫 相同 點(diǎn) 提供 DNA 復(fù)制的模板 四種脫氧核苷酸作原料 子鏈延伸的方向都是從 5 端到 3 端 PCR 反應(yīng)是通過(guò)控制溫度使 DNA 復(fù)制在體外反復(fù)進(jìn)行 PCR 反應(yīng)的實(shí)質(zhì)就是 DNA 復(fù)制 所以有關(guān) PCR 反應(yīng)的題目與 DNA 復(fù)制的原理相同 計(jì)算方法也大體相同 例如 PCR 反應(yīng)中 的目的片段一般以 2n的方式積累 其中 n 為反應(yīng)循環(huán)次數(shù) 一個(gè) DNA 片段在 30 次循環(huán)后反 應(yīng)物中大約有 10 億 230 個(gè)這樣的片段 4 當(dāng) PCR 反應(yīng)體系的溫度經(jīng)快速冷卻到 50 左右時(shí) 為什么一般不考慮解開(kāi)的 2 個(gè) DNA 模板鏈又重新結(jié)合了 這是為什么 原因是 1 模板 DNA 比引物長(zhǎng)得多 復(fù)雜得多 不易重新結(jié)合 2 引物和模板之間的碰撞機(jī)會(huì)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于模板互補(bǔ)鏈之間的碰撞 3 加入的引物的量足夠大而模板鏈數(shù)量少 模板鏈濃度低 不易結(jié)合 5 為什么 PCR 能有廣泛用途 除用于 DNA 擴(kuò)增外 還有哪些用途 在生物基因組中存在著許多差異 如物種之間的差異 基因表達(dá)上的時(shí)間差異 基因表 達(dá)的地域或組織差異 變異后的差異 生理和病理變化引起的差異 遺傳的差異 雜交的差 異等 但這些差異只有在 DNA 擴(kuò)增后才能被觀察出來(lái) 因此 PCR 是這種差異的一種觀察方 法 因而在法醫(yī)學(xué)上 在遺傳病和其他疾病的診斷 考古中人種的確定 食品質(zhì)量的確定上 和基因轉(zhuǎn)移上都可使用 6 PCR 的反應(yīng)過(guò)程具體是怎樣的 7 PCR 一般要經(jīng)歷三十多次循環(huán) 每次循環(huán)可以分為變性 當(dāng)溫度上升到 90 以上時(shí) 雙 鏈 DNA 解聚為單鏈 復(fù)性 溫度下降到 50 左右 兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈 DNA 結(jié)合 和延伸 溫度上升到 72 左右 溶液中的四種脫氧核苷酸在 DNA 聚合酶的作用下 根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的 DNA 鏈 三步 從第二輪循環(huán)開(kāi)始 上一次循環(huán)的產(chǎn)物也作 為模板參與反應(yīng) 并且由引物 延伸而成的 DNA 單鏈會(huì)與引物 結(jié)合 進(jìn)行 DNA 的延伸 這 樣 DNA 聚合酶只能特異的復(fù)制處于兩個(gè)引物之間的 DNA 序列 使這段固定長(zhǎng)度的序列成指 數(shù)擴(kuò)增 第一輪的產(chǎn)物作為第二輪的模板 經(jīng)過(guò)變性 復(fù)性 延伸三步 第二輪的產(chǎn)物作為第三輪的模板 經(jīng)過(guò)變性 復(fù)性 延伸三步 8 題例領(lǐng)悟題例領(lǐng)悟 TILILINGWUTILILINGWU 例題 1 一個(gè)由 15N 標(biāo)記的 DNA 分子 放在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng) 利用 PCR 循環(huán) 5 次后標(biāo)記的 DNA 分子占總數(shù)的 A 1 10 B 1 5 C 1 16 D 1 25 解析 解析 一個(gè) DNA 分子利用 PCR 技術(shù)循環(huán) 5 次后產(chǎn)生的 DNA 分子數(shù)目為 2n 而 DNA 的復(fù)制 是半保留復(fù)制 其特點(diǎn)是新形成的 DNA 雙鏈 一條是來(lái)自親代 DNA 分子的母鏈 另一條是新 形成的子鏈 這樣最初由 15N 標(biāo)記的 DNA 分子復(fù)制后 其標(biāo)記的兩條鏈就分別進(jìn)入兩個(gè)子代 DNA 分子中 這樣兩個(gè)子代 DNA 分子被標(biāo)記了 以后均是在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng) 不論經(jīng) 過(guò)多少次復(fù)制 最初標(biāo)記的兩條鏈?zhǔn)冀K存在于兩個(gè) DNA 分子中 這樣經(jīng)過(guò) n 次循環(huán)后 標(biāo)記 的 DNA 分子中的 2 2n 即 1 2n 1 答案 C PCR 技術(shù)的實(shí)質(zhì)就是 DNA 分子的復(fù)制 例題 2 DNA 的復(fù)制需要引物 其主要原因是 A 可加快 DNA 的復(fù)制速度 B 引物可與 DNA 母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合 C 引物的 5 端有助于 DNA 聚合酶的延伸 DNA 鏈 D DNA 聚合酶只能從 3 端延伸 DNA 鏈 解析 解析 DNA 的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?為了明確地表示 DNA 的方向 通常將 DNA 的羥基 OH 末端稱為 3 端 而磷酸基團(tuán)的末端稱為 5 端 DNA 聚合酶不能從 5 端開(kāi)始合成 DNA 9 而只能從 3 端延伸 DNA 鏈 因此 DNA 復(fù)制需要引物 當(dāng)引物與 DNA 母鏈通過(guò)堿基互補(bǔ)配 對(duì)結(jié)合后 DNA 聚合酶就能從引物的 3 端開(kāi)始延伸 DNA 鏈 DNA 的合成方向總是從子鏈的 5 端向 3 端延伸 答案 D DNA 復(fù)制是有方向的 只能由 3 端延伸至 5 端 而不能倒過(guò)來(lái) 隨堂訓(xùn)練隨堂訓(xùn)練 SUITANGXUNLIANSUITANGXUNLIAN 11 個(gè) PCR 循環(huán)后 一個(gè)由 15N 標(biāo)記的 DNA 分子 放在沒(méi)有標(biāo)記的環(huán)境中培養(yǎng) 可產(chǎn)生幾 個(gè)含 15N 標(biāo)記的 DNA 分子 A 1 個(gè) B 23 8 個(gè) C 2 個(gè) D 4 個(gè) 答案 答案 C 解析 解析 PCR 的 1 次循環(huán) 相當(dāng)于 1 個(gè) DNA 分子復(fù)制了 1 次 因?yàn)?DNA 的復(fù)制為 半保留復(fù)制 所以形成了 2 個(gè)帶標(biāo)記的