克隆載體與表達(dá)載體

克隆載體 克隆載體 大多是高拷貝的載體 一般是原核細(xì)菌 將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接 再大多是高拷貝的載體 一般是原核細(xì)菌 將需要克隆的基因與克隆載體的質(zhì)粒相連接 再 導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi) 質(zhì)粒會(huì)在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定會(huì)表達(dá) 但導(dǎo)入原核細(xì)菌內(nèi) 質(zhì)粒會(huì)在原核細(xì)菌內(nèi)大量復(fù)制 形成大量的基因克隆 被克隆的基因不一定會(huì)表達(dá) 但 一定被大量復(fù)制 克隆載體只是為了保存基因片段 這樣細(xì)胞內(nèi)不會(huì)有很多表達(dá)的蛋白質(zhì)而影響別的工作 一定被大量復(fù)制 克隆載體只是為了保存基因片段 這樣細(xì)胞內(nèi)不會(huì)有很多表達(dá)的蛋白質(zhì)而影響別的工作 克隆載體克隆載體 Cloning vector 攜帶插入外源片段的質(zhì)?；蚴删w 從而產(chǎn)生更多物質(zhì)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物 攜帶插入外源片段的質(zhì)粒或噬菌體 從而產(chǎn)生更多物質(zhì)或蛋白質(zhì)產(chǎn)物 這是為這是為 攜帶攜帶 感興趣的外源感興趣的外源 DNA 實(shí)現(xiàn)外源 實(shí)現(xiàn)外源 DNA 的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些的無(wú)性繁殖或表達(dá)有意義的蛋白質(zhì)所采用的一些 DNA 分子 分子 其中 為使插入的外源其中 為使插入的外源 DNA 序列可轉(zhuǎn)錄 進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體 序列可轉(zhuǎn)錄 進(jìn)而翻譯成多肽鏈而設(shè)計(jì)的克隆載體又稱表達(dá)載體 是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件 即啟動(dòng)子是否含有表達(dá)系統(tǒng)元件 即啟動(dòng)子 核糖體結(jié)合位點(diǎn)核糖體結(jié)合位點(diǎn) 克隆位點(diǎn)克隆位點(diǎn) 轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) 這是用來(lái)區(qū)別克隆載體和轉(zhuǎn)錄終止信號(hào) 這是用來(lái)區(qū)別克隆載體和 表達(dá)載體的標(biāo)志 表達(dá)載體的標(biāo)志 表達(dá)載體 有的是高拷貝的 有的是低拷貝的 各有各的用處 是一些用于工程生產(chǎn)的細(xì)菌 被導(dǎo)入的目表達(dá)載體 有的是高拷貝的 有的是低拷貝的 各有各的用處 是一些用于工程生產(chǎn)的細(xì)菌 被導(dǎo)入的目 標(biāo)基因會(huì)在此類細(xì)菌中得到表達(dá) 生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物 導(dǎo)入的基因是由克隆載體產(chǎn)出的 表達(dá)載體具標(biāo)基因會(huì)在此類細(xì)菌中得到表達(dá) 生產(chǎn)出我們需要的產(chǎn)物 導(dǎo)入的基因是由克隆載體產(chǎn)出的 表達(dá)載體具 有較高的蛋白質(zhì)表達(dá)效率 一般因?yàn)榫哂袕?qiáng)的啟動(dòng)子 有較高的蛋白質(zhì)表達(dá)效率 一般因?yàn)榫哂袕?qiáng)的啟動(dòng)子 表達(dá)載體 表達(dá)載體 Expression vectors 就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件 如啟動(dòng)子 就是在克隆載體基本骨架的基礎(chǔ)上增加表達(dá)元件 如啟動(dòng)子 RBS 終止子等 是目的基因能夠表達(dá)的載體 如表達(dá)載體 終止子等 是目的基因能夠表達(dá)的載體 如表達(dá)載體 pKK223 3 是一個(gè)具有典型表達(dá)結(jié)構(gòu)的大是一個(gè)具有典型表達(dá)結(jié)構(gòu)的大 腸桿菌表達(dá)載體 其基本骨架為來(lái)自腸桿菌表達(dá)載體 其基本骨架為來(lái)自 pBR322 和和 pUC 的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因 在表達(dá)元的質(zhì)粒復(fù)制起點(diǎn)和氨芐青霉素抗性基因 在表達(dá)元 件中 有一個(gè)雜合件中 有一個(gè)雜合 tac 強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子 在啟動(dòng)子下游有強(qiáng)啟動(dòng)子和終止子 在啟動(dòng)子下游有 RBS 位點(diǎn) 如果利用這個(gè)位點(diǎn) 要求與位點(diǎn) 如果利用這個(gè)位點(diǎn) 要求與 ATG 之間間隔之間間隔 5 13bp 其后的多克隆位點(diǎn)可裝載要表達(dá)的目標(biāo)基因 其后的多克隆位點(diǎn)可裝載要表達(dá)的目標(biāo)基因 RBSRBS 位點(diǎn) 位點(diǎn) 19741974 年年 ShineShine 和和 DalgarnoDalgarno 首先發(fā)現(xiàn) 原核生物 在首先發(fā)現(xiàn) 原核生物 在 mRNAmRNA 上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn) 它們上有核糖體的結(jié)合位點(diǎn) 它們 是起始密碼子是起始密碼子 AUGAUG 和一段位于和一段位于 AUGAUG 上游上游 3 3 1010 bpbp 處的由處的由 3 3 9bp9bp 組成的序列 這段序列富含嘌呤核苷組成的序列 這段序列富含嘌呤核苷 酸 剛好與酸 剛好與 16S16S rRNArRNA 3 3 末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ) 是核糖體 末端的富含嘧啶的序列互補(bǔ) 是核糖體 RNARNA 的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn) 根據(jù)發(fā)現(xiàn)者的的識(shí)別與結(jié)合位點(diǎn) 根據(jù)發(fā)現(xiàn)者的 名字 命名為名字 命名為 Shine DalgarnoShine Dalgarno 序列 簡(jiǎn)稱序列 簡(jiǎn)稱 S DS D 序列 序列 由于它正好與由于它正好與 30S30S 小亞基中的小亞基中的 16s16s rRNA3 rRNA3 端一部分序列互補(bǔ) 因此端一部分序列互補(bǔ) 因此 S DS D 序列也叫做核糖體結(jié)合序列 序列也叫做核糖體結(jié)合序列 真核生物真核生物存存在在于于真真核核生生物物 m mR RN NA A 的的一一段段序序列列 其其在在翻翻譯譯的的起起始始中中有有重重要要作作用用 加加K Ko oz za ar rk k s se eq qu ue en nc ce e G GC CC CA AC CC C K Ko oz za ak k s se eq qu ue en nc ce e 是是用用來(lái)來(lái)增增強(qiáng)強(qiáng)真真核核基基因因的的翻翻譯譯效效率率的的 是是最最優(yōu)優(yōu)化化的的A AT TG G 環(huán)環(huán)境境 避避免免 r ri ib bo os so om me e 出出現(xiàn)現(xiàn) l le ea ak ky y s sc ca an n 克隆載體目的在于復(fù)制足夠多的目標(biāo)質(zhì)粒 所以常帶有較強(qiáng)的自我復(fù)制元件 如復(fù)制起始位點(diǎn)等 往往克隆載體目的在于復(fù)制足夠多的目標(biāo)質(zhì)粒 所以常帶有較強(qiáng)的自我復(fù)制元件 如復(fù)制起始位點(diǎn)等 往往 在菌體內(nèi)存在多拷貝 所以抽質(zhì)粒會(huì)抽出一大堆 但不具備表達(dá)元件 而表達(dá)質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成 為的是在菌體內(nèi)存在多拷貝 所以抽質(zhì)粒會(huì)抽出一大堆 但不具備表達(dá)元件 而表達(dá)質(zhì)粒有復(fù)雜的構(gòu)成 為的是 控制目標(biāo)蛋白的表達(dá) 如各種啟動(dòng)子 控制目標(biāo)蛋白的表達(dá) 如各種啟動(dòng)子 T7 調(diào)節(jié)子 調(diào)節(jié)子 LacZ 等 而且以 等 而且以 pET 為代表的表達(dá)載體在菌體為代表的表達(dá)載體在菌體 內(nèi)都是低拷貝的 防止?jié)B漏表達(dá) 內(nèi)都是低拷貝的 防止?jié)B漏表達(dá) 克隆載體只是把你要的基因片段拿到就可以了 不管讀碼框什么的 但是表達(dá)載體是不但要你的目的克隆載體只是把你要的基因片段拿到就可以了 不管讀碼框什么的 但是表達(dá)載體是不但要你的目的 基因連在上面 而且要表達(dá)蛋白 所以就要求你的讀碼框不能亂了 否則就不能得到你想到的表達(dá)產(chǎn)物 基因連在上面 而且要表達(dá)蛋白 所以就要求你的讀碼框不能亂了 否則就不能得到你想到的表達(dá)產(chǎn)物 1 載體即要把一個(gè)有用的基因 目的基因載體即要把一個(gè)有用的基因 目的基因 研究或應(yīng)用基因 通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞 受體細(xì)研究或應(yīng)用基因 通過(guò)基因工程手段送到生物細(xì)胞 受體細(xì) 胞 需要運(yùn)載工具 交通工具 攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞 這種運(yùn)載工具就叫做載體 胞 需要運(yùn)載工具 交通工具 攜帶外源基因進(jìn)入受體細(xì)胞 這種運(yùn)載工具就叫做載體 vector 2 載體的分類載體的分類 按功能分成 按功能分成 1 克隆載體 克隆載體 都有一個(gè)松弛的復(fù)制子 能帶動(dòng)外源基因 在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增 它是都有一個(gè)松弛的復(fù)制子 能帶動(dòng)外源基因 在宿主細(xì)胞中復(fù)制擴(kuò)增 它是 用來(lái)克隆和擴(kuò)增用來(lái)克隆和擴(kuò)增 DNA 片段 基因 的載體 片段 基因 的載體 2 表達(dá)載體 表達(dá)載體 具有克隆載體的基本元件 具有克隆載體的基本元件 ori Ampr Mcs 等 還具有轉(zhuǎn)錄等 還具有轉(zhuǎn)錄 翻譯所必需的翻譯所必需的 DNA 順序的載體 順序的載體 按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分 按進(jìn)入受體細(xì)胞類型分 1 原核載體 原核載體 2 真核載體 真核載體 3 穿梭載體 穿梭載體 sbuttle vector 指在兩種宿指在兩種宿 主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 因而可以運(yùn)載目的基因 穿梭往返兩種生物之間 主生物體內(nèi)復(fù)制的載體分子 因而可以運(yùn)載目的基因 穿梭往返兩種生物之間 克隆載體克隆載體 顧名思義就是質(zhì)?？截悢?shù)比較高顧名思義就是質(zhì)粒拷貝數(shù)比較高 在做上游克隆時(shí)比較方便在做上游克隆時(shí)比較方便 其重點(diǎn)在于質(zhì)粒的復(fù)制其重點(diǎn)在于質(zhì)粒的復(fù)制 問題 問題 基因工程中有克隆載體和表達(dá)載體 克隆載體可以在受體菌中大量復(fù)制 基因工程中有克隆載體和表達(dá)載體 克隆載體可以在受體菌中大量復(fù)制 表達(dá)載體用于表達(dá)目的蛋白 那么實(shí)際應(yīng)用中 我們的最終目的是要得到目的表達(dá)載體用于表達(dá)目的蛋白 那么實(shí)際應(yīng)用中 我們的最終目的是要得到目的 蛋白 克隆載體不能完成表達(dá) 有何用呢 還是說(shuō)利用克隆載體實(shí)現(xiàn)目的基因蛋白 克隆載體不能完成表達(dá) 有何用呢 還是說(shuō)利用克隆載體實(shí)現(xiàn)目的基因 的大量復(fù)制后 再將其轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)表達(dá) 它是否有何缺陷不能整合的大量復(fù)制后 再將其轉(zhuǎn)移到表達(dá)載體中實(shí)現(xiàn)表達(dá) 它是否有何缺陷不能整合 克隆載體的功能 構(gòu)建兼有克隆和表達(dá)雙重功能的載體有何困難 克隆載體的功能 構(gòu)建兼有克隆和表達(dá)雙重功能的載體有何困難 1 1 克隆的目的比較單一 就是將你感興趣的克隆的目的比較單一 就是將你感興趣的 DNADNA 片段 重組進(jìn)入載體 然后于片段 重組進(jìn)入載體 然后于 宿主細(xì)胞中大量繁殖 主要用于各種文庫(kù)的建立 比如人類基因組計(jì)劃 同時(shí)宿主細(xì)胞中大量繁殖 主要用于各種文庫(kù)的建立 比如人類基因組計(jì)劃 同時(shí) 由于載體所能容納的目的片段的長(zhǎng)度是有限的 而克隆載體沒有表達(dá)所需的各由于載體所能容納的目的片段的長(zhǎng)度是有限的 而克隆載體沒有表達(dá)所需的各 種片段 所以可以容納更長(zhǎng)的目的片段 即可以克隆足夠長(zhǎng)的基因 效率更高 種片段 所以可以容納更長(zhǎng)的目的片段 即可以克隆足夠長(zhǎng)的基因 效率更高 2 2 重組重組 DNADNA 需要使用限制性內(nèi)切酶 因此待克隆的目的片段兩端必需有其識(shí)別需要使用限制性內(nèi)切酶 因此待克隆的目的片段兩端必需有其識(shí)別 位點(diǎn) 現(xiàn)在的位點(diǎn) 現(xiàn)在的 T AT A 克隆載體可以直接克隆克隆載體可以直接克隆 PCRPCR 產(chǎn)物 省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn)產(chǎn)物 省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn) 的設(shè)計(jì) 的設(shè)計(jì) PCRPCR 效率就更高 效率就更高 3 3 表達(dá)載體的目的是多樣化的 為了實(shí)現(xiàn)實(shí)際工作中的需要 不同的目的就要表達(dá)載體的目的是多樣化的 為了實(shí)現(xiàn)實(shí)際工作中的需要 不同的目的就要 設(shè)計(jì)不同的載體 用表達(dá)載體克隆基因不是不可以 實(shí)際工作中要考慮更多 設(shè)計(jì)不同的載體 用表達(dá)載體克隆基因不是不可以 實(shí)際工作中要考慮更多 因此更復(fù)雜 因此更復(fù)雜 4 4 細(xì)菌攝取能量的能力是一定的 如果用來(lái)合成大量蛋白質(zhì) 合成核酸就會(huì)少 細(xì)菌攝取能量的能力是一定的 如果用來(lái)合成大量蛋白質(zhì) 合成核酸就會(huì)少 5 5 細(xì)菌承受的工作負(fù)荷也是有限的 給它的工作太多 效率必然低下 這和我細(xì)菌承受的工作負(fù)荷也是有限的 給它的工作太多 效率必然低下 這和我 們?nèi)粘Ｉ钍且粋€(gè)道理 們?nèi)粘Ｉ钍且粋€(gè)道理 原因很簡(jiǎn)單 不是不能 是完全可以 但是效率會(huì)低很多 所以我們一般的策原因很簡(jiǎn)單 不是不能 是完全可以 但是效率會(huì)低很多 所以我們一般的策 略是 將目的片段克隆于非常簡(jiǎn)單的克隆載體上 按照需要再亞克隆于可以滿略是 將目的片段克隆于非常簡(jiǎn)單的克隆載體上 按照需要再亞克隆于可以滿 足各種要求的表達(dá)載體上 回答的不是很系統(tǒng) 如有問題可以繼續(xù)來(lái)信討論 足各種要求的表達(dá)載體上 回答的不是很系統(tǒng) 如有問題可以繼續(xù)來(lái)信討論 希望對(duì)你有所幫助 希望對(duì)你有所幫助 1 1 T A T A 克隆載體可以直接克隆克隆載體可以直接克隆 PCRPCR 產(chǎn)物 省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì) 產(chǎn)物 省去了兩端加裝識(shí)別位點(diǎn)的設(shè)計(jì) PCRPCR 效率就效率就 更高 更高 是什么意思 是什么意思 T AT A 克隆載體是克隆載體是 PUCPUC 載體的線性化后兩端加了載體的線性化后兩端加了 T T 而 而 TaqTaq 酶有在酶有在 PCRPCR 產(chǎn)物后隨機(jī)加產(chǎn)物后隨機(jī)加 A A 的的 特性 所以特性 所以 PCRPCR 產(chǎn)物直接可以接入產(chǎn)物直接可以接入 T T 載體 而經(jīng)典的克隆載體 而經(jīng)典的克隆 PCRPCR 產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶產(chǎn)物需要限制性內(nèi)切酶 切割后接入載體 所以在設(shè)計(jì)切割后接入載體 所以在設(shè)計(jì) PCRPCR 引物時(shí)兩端要加酶的識(shí)別位點(diǎn) 而加裝的序列與模引物時(shí)兩端要加酶的識(shí)別位點(diǎn) 而加裝的序列與模 板不配對(duì) 因此板不配對(duì) 因此 PCRPCR 效率會(huì)低很多 效率會(huì)低很多 2 2 克隆載體只是為了得到大量的目的基因 而現(xiàn)在多用克隆載體只是為了得到大量的目的基因 而現(xiàn)在多用 PCRPCR 就可以達(dá)到這個(gè)目的 那這就可以達(dá)到這個(gè)目的 那這 個(gè)目的基因的主要用途是什么 只用來(lái)測(cè)序嗎 表達(dá)載體應(yīng)該兼有克隆與表達(dá)的功能個(gè)目的基因的主要用途是什么 只用來(lái)測(cè)序嗎 表達(dá)載體應(yīng)該兼有克隆與表達(dá)的功能 的吧 的吧 嗯 基本是這個(gè)意思 就測(cè)序不克隆也可以進(jìn)行 克隆到載體的嗯 基本是這個(gè)意思 就測(cè)序不克隆也可以進(jìn)行 克隆到載體的 CMSCMS 中就在基因兩端中就在基因兩端 有了可供你選擇的很多限制性酶切位點(diǎn) 方便亞克隆到各種表達(dá)載體上 當(dāng)然表達(dá)載有了可供你選擇的很多限制性酶切位點(diǎn) 方便亞克隆到各種表達(dá)載體上 當(dāng)然表達(dá)載 體可以克隆 但是效率低于克隆載體 一是因?yàn)楸磉_(dá)載體不能直接克隆體可以克隆 但是效率低于克隆載體 一是因?yàn)楸磉_(dá)載體不能直接克隆 PCRPCR 產(chǎn)物 必產(chǎn)物 必 須加裝限制性酶切識(shí)別序列 上面已經(jīng)講過(guò) 二是表達(dá)載體的選擇相對(duì)克隆載體是更須加裝限制性酶切識(shí)別序列 上面已經(jīng)講過(guò) 二是表達(dá)載體的選擇相對(duì)克隆載體是更 加嚴(yán)謹(jǐn)型的質(zhì)粒 就是每個(gè)細(xì)菌里的拷貝數(shù)較低 能量守恒 細(xì)菌攝取能量的能力是加嚴(yán)謹(jǐn)型的質(zhì)粒 就是每個(gè)細(xì)菌里的拷貝數(shù)較低 能量守恒 細(xì)菌攝取能量的能力是 一定的 用來(lái)合成蛋白質(zhì) 核酸的合成必然受一定得限制 一定的 用來(lái)合成蛋白質(zhì) 核酸的合成必然受一定得限制 3 3 我要構(gòu)建一個(gè)基因的載體 我要構(gòu)建一個(gè)基因的載體 1 1 我可以將目的基因 我可以將目的基因 1 3kb1 3kb 左右 和表達(dá)載體分別作酶切后連接嗎 這幾天將目的左右 和表達(dá)載體分別作酶切后連接嗎 這幾天將目的 基基 因做了一個(gè)因做了一個(gè) T T 載體連接 可是不知道下一步怎么利用 載體連接 可是不知道下一步怎么利用 2 2 設(shè)計(jì)引物的時(shí)候用了設(shè)計(jì)引物的時(shí)候用了 sac1sac1 和和 hind111hind111 做 做 pcrpcr 的時(shí)候可以用的時(shí)候可以用 pfupfu 酶嗎 酶嗎 pfupfu 酶是必酶是必 須的嗎 須的嗎 3 3