【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）豬干擾素-γ基因的克隆、表達及其疫苗佐劑效應(yīng)研究預(yù)防獸醫(yī)學碩士論文

I 密級 _ 論文編號 _ 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 豬干擾素 因的克隆、表達及其 疫苗佐劑效應(yīng)研究 of as of of as 豬干擾素 因的克隆 、 表達及其疫苗佐劑效應(yīng)研究 摘 要 干擾素 是一種具有廣泛 抗病毒 、 抗細胞內(nèi)寄生菌及胞內(nèi)寄生蟲 、 抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用 。 它 主要由活化的 T 淋巴細胞和 胞產(chǎn)生， 絲裂原以及抗原特異性刺激 T 淋巴細胞克隆也可產(chǎn)生。 研究表明， 望成為新一代的疫苗佐劑。為了研究和開發(fā)豬 用于 相關(guān) 疾病的治療或預(yù)防，我們進行了 豬干擾素 表達及其疫苗佐劑效應(yīng)研究。以植 物血凝素（ 脂多糖（ 同刺激分離的豬外周血淋巴細胞，提取總 用反轉(zhuǎn)錄 術(shù) 擴增 豬 因，將 擴增 到的基因與 體連接后進行酶切 、 及測序鑒定 ， 結(jié)果表明 ： 所克隆的豬 因與 的豬 因序列完全一致。 依照 該基因開放閱讀框（ 側(cè) 序列重新 設(shè)計并合成引物，以重組質(zhì)粒 模板進行擴增，擴增產(chǎn)物和 和 雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌。經(jīng)酶切 、 及測序鑒定證明，豬 因正確插入到 體。用 導表達，表達產(chǎn)物通過 析， 證實 豬 因在大腸桿菌中得到了成功表達， 目的蛋白與 成融合形式，分子量大小為 40右，與預(yù)期的大小相吻合，而且可被 鼠 抗人重組 清所 別 ；薄層掃描分析表明， 表達產(chǎn)物 約 占菌體總蛋白的 30將克隆到的豬 因插入到哺乳動物細胞表達載體 核啟動子 ，直接用該質(zhì)粒作為豬囊蟲全蟲疫苗佐劑免疫 小鼠 ，檢測抗體 ，結(jié)果試驗組小鼠抗體滴度明顯高于各對照組，說明 豬 因重組真核表達載體 豬囊蟲全蟲疫苗 有 良好的 免疫 佐劑作用 ，優(yōu)于傳統(tǒng)使用的鋁鹽和206 佐劑。 該研究首次對 面的 作 用進行了探索，為打破目前寄生蟲免疫防制的被動局面進行了有益的嘗試。 關(guān)鍵詞： 豬 因克??；誘導表達；疫苗佐劑 of as is a K or It a in to It a in is to be as a in In we HA NA it as a to 00% We to RF of as in CR to of in a of 0 ST by 0of . We , it as an to ; V 目 錄 第一章 引 言 1 1 研究目的和意 義 1 2 國內(nèi)外研究現(xiàn) 狀 2 3 研究內(nèi)容和方 法 9 第二章 豬干擾素 因的克隆及表 達 10 1 實驗材料和方 法 10 驗材 料 10 驗方 法 12 2 實驗結(jié) 果 21 3 討論 30 第三章 豬 32 1 實驗材料和方法 32 驗材料 32 驗方法 32 2 實驗結(jié)果 34 3 討論 35 研究結(jié)論 37 參考文獻 38 附錄 44 致謝 49 作者簡歷 50中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 1 第一章 引 言 1 研究目的和意義 干擾素 一種具有廣泛的抗病毒、抗 細胞內(nèi)寄生菌及胞內(nèi)寄生蟲、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用的細胞因子，在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用。 1973 年 抗原性與以前發(fā)現(xiàn)的完全不同，于是就命名為 型 980 年統(tǒng)一命名為 伯泉 ,2001）。 1981 年， 首次成功地克隆了人 因（ ， 2000），其后多種動物的 因相繼被克隆和表達，豬 因在 1990 年由 成功克隆（ 周光炎， 2001）。 因的成功克 隆，使人們能夠大量獲得具有活性的重組 加方便地開展 用及應(yīng)用方面的研究。近年來，隨著細胞分子生物學、免疫學、 組技術(shù)及基因轉(zhuǎn)移技術(shù)的發(fā)展 ,有關(guān) 作用機理、臨床應(yīng)用等方面取得了長足發(fā)展，由于 有廣泛的抗病毒、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用，使其成為臨床治療病毒性疾病的首選藥物。 要由活化的 T 淋巴細胞和 胞產(chǎn)生，絲裂原以及抗原特異性刺激 T 細胞克隆均可產(chǎn)生 T 細胞中， 類是產(chǎn)生 主要細胞，此外， 胞、病毒或同種異體抗原 刺激的 核細胞、巨噬細胞以及樹突狀細胞均可分泌 伯泉 ,2001）。有許多生物學活性，在抗病毒感染和抗腫瘤方面同 相似，但 免疫調(diào)節(jié)作用比 更為重要，而且 較嚴格的種屬特異性，如人的 作用于人和靈長類動物的細胞。 于 細胞因子，可誘導機體免疫反應(yīng)向 轉(zhuǎn)化 ,而抑制 免疫反應(yīng)。在小鼠實驗?zāi)Ｐ椭邪l(fā)現(xiàn)， 促進 泌，而降低 水平， 可抑制 導小鼠 B 細胞 表達 (， 1996； H 等，1998)。 人和小鼠的 因分別定位于 12 號和 10 號染色體，在 平上與 基因無同源性，但立體分子結(jié)構(gòu)十分相似，有人認為這三個基因可能來自于同一個祖先基因。人與各種動物 因開放閱讀框（ 苷酸同源性分別為：人與小鼠為 40%、人與豬為 人與牛為 牛與豬為 88%。在蛋白質(zhì)水平，人成熟 子由 143 個氨基酸殘基組成，而小鼠成熟 133 個氨基酸殘基組成 ，人與小鼠氨基酸序列同源性為 40%、人與豬為 人與牛為 、牛與豬為 70%。 分子中沒有形成二硫鍵的半胱氨酸，其活性形式是牢固的二聚體或四聚體，單體沒有活性。天然 一種糖蛋白，在第 25 位和第 97 位 有兩個糖基化位點，雖然大腸桿菌表達的 有進行糖基化修飾，但研究證實仍具有生物學活性（郭瀛軍等， 2001）。在 分子中的 86 90 位和 /或 128 132 位分別為 種堿性氨基酸序列可能是 伯泉 ,2001）。豬 為 501碼由 166 個氨基酸殘基組成的前體蛋白，其中信號肽為 23 個，可引導 泌到細胞外，在胞外切去信號肽后成為成熟的豬 含 143 個氨基酸，分子量為 17 在 128 132 位含有 列，而不存在 列。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 2 理想的疫苗接種后應(yīng)能刺激機體產(chǎn)生持久的特異性免疫反應(yīng)，但目前許多疫苗免疫原性差，接種后所激發(fā)的免疫應(yīng)答或強度不足，或維持時間短，即使使用傳統(tǒng) 的疫苗佐劑也不能有效誘導機體產(chǎn)生足夠強的免疫應(yīng)答和特定的應(yīng)答類型（ 這些一直是困繞免疫接種的一大難題（張延齡等， 2004）。近年來，隨著細胞因子研究的進展，發(fā)現(xiàn)許多細胞因子具有明顯的佐劑效應(yīng)，若以細胞因子作為疫苗佐劑使用，不僅可有效增強疫苗的免疫效果，而且可誘導免疫應(yīng)答向特定的類型轉(zhuǎn)換，這使得細胞因子的應(yīng)用從治療轉(zhuǎn)向了預(yù)防。但是，細胞因子作為佐劑存在使用過量帶來一定副作用和很快失活的缺點。后來，受基因免疫的啟發(fā)，以編碼細胞因子的表達載體直接作為佐劑可避免這些缺點，編碼細胞因子的表達載體進入機 體后可在體內(nèi)持續(xù)低水平表達，起基因治療作用或參與疫苗免疫的應(yīng)答，這種方法不僅避免細胞因子的不利影響，還省去了表達、純化等復雜的手續(xù)。以 其基因作為治療劑或疫苗佐劑的研究目前已取得了較大的進展，如將 因?qū)?瘤小鼠不僅可延長其存活期，并有 25%的實驗鼠腫瘤消退，這說明 在小鼠體內(nèi)表達并發(fā)揮了相應(yīng)的作用（ 陳受霓等， 2003） 。將乙肝病毒 因共同免疫小鼠，可明顯促進 胞增殖，并使抗 面抗原的抗體 量增加，同時顯著抑制 胞的增殖并減少 體的產(chǎn)生 (H 等 , 1998)。這些結(jié)果使得人們對細胞因子的研究前景充滿了信心，而 為一種抗病毒和抗腫瘤的細胞因子更是具有極高的研究和開發(fā)價值。 作為疫苗佐劑調(diào)節(jié)機體對疫苗的免疫應(yīng)答之外，它還可作為治療藥物用于病毒性或細菌性疾病的治療。總之，對 用方面的研究將有望解決目前許多疫苗不能達到有效保護的問題，為動物病毒病的治療和預(yù)防提供一種強有力的手段。它將是一個新的技術(shù)產(chǎn)業(yè)，產(chǎn)生不可估量的社會和經(jīng)濟效益。 醫(yī)學臨床上目前 雖然已有重組人 于病毒?。ㄈ缫腋危┗蚰[瘤的治療，但將其作為疫苗佐劑尚處于研究探索階段。動物方面，國內(nèi)外雖進行了許多動物源 面的研究，但僅僅處于起步階段，在國內(nèi)還沒有一種動物源性 品，為了研究和開發(fā)豬 用于相關(guān)疾病的治療或預(yù)防，我們開展了本項研究。 2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 2 1 細胞因子的研究現(xiàn)狀 細胞因子（ 一類由活化的免疫細胞（淋巴細胞、單核巨噬細胞等）和相關(guān)細胞（纖維細胞、內(nèi)皮細胞等）產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)細胞功能的高活性、多功能蛋白質(zhì)，它們通過與高親和力特 異性受體相互作用，在低濃度下發(fā)揮作用，是機體發(fā)揮免疫功能不可缺少的成分（金伯泉，2001）。 1957 年， 發(fā)現(xiàn)病毒誘導細胞產(chǎn)生一種能干擾病毒復制的可溶性蛋白質(zhì)，將其命名為干擾素，這是正式命名的第一個（類）細胞因子。此后，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了一系列的細胞因子。20 世紀 70 到 80 年代是細胞因子研究十分活躍的時期，在此階段，有關(guān)細胞因子的研究有兩個重要發(fā)展，一是細胞因子命名的統(tǒng)一，二是細胞因子純化、鑒定技術(shù)的發(fā)展和基因重組技術(shù)的應(yīng)用（ A 等， 2000）。尤其是在 80 年代，由于分子生物學技術(shù)和 基因重組技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，新的細胞因子不斷被發(fā)現(xiàn)，重組的細胞因子更加接近于天然分子，這使得人們能更加確切的研究各種細胞因子的理化特性、結(jié)構(gòu)和生物學效應(yīng)，作用的受體、受體的結(jié)構(gòu)及受體介導的信中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 3 號傳導過程（金伯泉， 2001；周光炎， 2001）。但是，由于重組細胞因子在臨床應(yīng)用中可引起如發(fā)熱、寒顫等一系列的副作用以及很快失活的特性，人們又將目光轉(zhuǎn)向?qū)毎蜃舆M行適當?shù)募庸ず透脑焐蟻?，通過對細胞因子的結(jié)構(gòu)進行適當?shù)募庸ず透脑欤垣@得生物學活性更加單一、更加有效、副作用更小的細胞因子。研究發(fā)現(xiàn)，將 125 位 突變?yōu)?得到的有不形成二聚體、比活性高、熱穩(wěn)定性好、體內(nèi)半衰期延長等優(yōu)點（李元等 ,2003）。若利用 組技術(shù)，用 段取代綠膿桿菌 素基因的細胞識別功能區(qū)構(gòu)建嵌合基因，發(fā)現(xiàn)該融合蛋白對表面表達 活化 T 淋巴細胞具有明顯殺傷效應(yīng)，可用于抗排斥反應(yīng)或治療自身免疫性疾?。?C 等， 1989； G 等， 1998；畢美霞， 2000）。美國科學家也構(gòu)建了以白喉桿菌（ 毒素為主體的 明它們能在體外高度特異性地 殺傷高表達相應(yīng)細胞因子受體的腫瘤細胞（劉堰等， 2002）。目前，要證實新發(fā)現(xiàn)一種細胞因子的標準是：必須克隆其基因且證明其具有生物學活性，并在核苷酸序列和氨基酸序列上與已知的細胞因子或其它活性蛋白質(zhì)顯著不同（金伯泉， 2001；孫衛(wèi)民等， 1999）。 從細胞因子被發(fā)現(xiàn)時起，就因其對免疫系統(tǒng)的強大調(diào)節(jié)作用而備受關(guān)注，開始研究其與疾病的關(guān)系，但直到近年來隨著細胞工程和基因工程的發(fā)展，能夠大量獲得天然或重組細胞因子以后，其臨床應(yīng)用才成為可能。 1986 年，美國食品和藥物管理局（ 準 于臨床，至今至少已 有 30 個以上的細胞因子在美國、歐洲和世界各地用于臨床治療，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)有活性的細胞因子用于疾病的治療或預(yù)防已成為當前研究的熱門并取得了很大的成績，相信不久將有更多的細胞因子進入臨床應(yīng)用（ ， 2000）。用細胞因子作為疫苗佐劑的研究也取得了很大的進展，對于抗原性弱、不能有效誘導機體產(chǎn)生保護性免疫反應(yīng)的疫苗，利用細胞因子作為佐劑進行免疫可達到增強免疫效果的目的，尤其對于基因工程疫苗或基因疫苗，選擇合適的細胞因子或細胞因子基因作為佐劑是當前研究的重點和熱點（李求是等， 1994； 1994；G 等， 2003）。細胞因子拮抗劑（包括天然的、基因重組的和可溶性細胞因子受體等）也日漸成為研究的重點之一，從而可有效控制某些細胞因子的負作用，如消除其對機體造成免疫損傷或抑制排斥反應(yīng)等（ H 等， 1998；王斐等， 1999）。細胞因子的基因?qū)氙煼ê图毎蜃优c基因工程抗體、細胞因子與毒素等復合物的臨床價值亦在研究之中。近年來，動物細胞因子的研究也越來越受到重視并取得了一定的成績，但總的來說相對滯后，各種獸用相關(guān)細胞因子產(chǎn)品正處于研究和開發(fā)之中，開發(fā)動物源性細胞因 子作為疫苗佐劑的研究才剛剛起步。 2 2 干擾素 的分類、特性及其基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控 擾素的分類及特性 在 20 世紀 60 年代，人們根據(jù) 生的來源及其對酸（ 耐受程度，將它分為 型和 型干擾素。 型干擾素在 件下活性穩(wěn)定，其中由病毒感染的白細胞產(chǎn)生的稱為白細胞干擾素，而由病毒感染的成纖維細胞產(chǎn)生的稱為成纖維細胞干擾素。 型干擾素主要由抗原或絲裂原刺激的外周血單個核細胞（ 產(chǎn)生，所以又叫免疫干擾素。 20 世紀 80 年代初，又根據(jù)干擾素分子結(jié)構(gòu)、抗原性及生物活性的區(qū)別，將 型 干擾素中的白細胞干擾素命名為纖維細胞干擾素命名為 型干擾素命名為 中 有異質(zhì)性，又可分為不同的亞型（金伯泉， 2001；金奇， 2001）。雖然將干擾素分為不同的種類，但其生物中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 4 活性大致相同，主要有： 抗病毒、抗細胞內(nèi)寄生菌及其它微生物繁殖； 抗腫瘤細胞和其它細胞增殖； 免疫調(diào)節(jié)作用，包括增強巨噬細胞、 胞和 胞活性，促進或抑制抗體產(chǎn)生，促進 達，激活補體系統(tǒng)等。其中 型干擾素即 免疫調(diào)節(jié)作用比 強許多倍，但其生物學作用有較嚴 格的種屬特異性（金奇， 2001；殷震等， 1997）。 身并不直接滅活病毒，而是作用于靶細胞膜上的 體，發(fā)生內(nèi)化并降解，導致抗病毒蛋白基因的操縱子去抑制化而轉(zhuǎn)錄并合成抗病毒蛋白，從而發(fā)揮抗病毒作用。這些抗病毒蛋白目前研究最為清楚的是 2成酶，它可催化一種特殊的寡核苷酸 ） 2形成，該寡核苷酸可使干擾素誘導的潛伏的內(nèi)切核酸酶 化，活化的 降解病毒 而抑制病毒蛋白的合成。另一種 導的抗病毒蛋白是 賴蛋白激酶可 使 譯的起始因子 酸化而滅活，抑制了病毒蛋白的合成（ 1993； 等， 1994）。此外， 誘生一些只作用于某一類病毒的蛋白質(zhì)，如 白只阻斷流感病毒的復制（ A， 1992）。盡管對干擾素的抗病毒機理進行了很長時間的研究，但它對大多數(shù)病毒的確切作用機理仍不十分清楚，僅了解一些普遍的特征，這是由于：首先，干擾素誘生的不同蛋白質(zhì)介導不同的抗病毒機制；其次，對不同科的病毒，其作用途徑亦不一樣；第三，可作用在病毒繁殖周期的一個或多個步 驟，包括病毒穿入、脫殼、轉(zhuǎn)錄、翻譯、基因組復制、裝配和釋放，具體作用于哪個步驟主要取決于病毒的性質(zhì)和感染細胞的類型。 因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 通常 因受一種抑制物的作用而使其表達處于沉默狀態(tài)，只有受到誘導和刺激后被激活才進行轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄時也受到多種因素的調(diào)節(jié)和控制，這些因素相互作用，組成一個復雜的基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。研究表明，在 T 細胞受到抗原刺激分化為 ，細胞因子基因轉(zhuǎn)錄需要經(jīng)過兩個階段：首先是未致敏的 T 細胞受到抗原刺激后活化、增殖，同時在 化，在此過程中 因位點染色體重構(gòu)， 甲基化，細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子及細胞表面受體的上調(diào)和下調(diào)；然后 因在誘導性轉(zhuǎn)錄因子作用下進行轉(zhuǎn)錄（ T 等， 1999； O， 2000），這些轉(zhuǎn)錄因子包括活化 T 細胞核因子（ 胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（ (H 等， 1999)。 以和 因啟動子近端 的 5 個功能性位點（ 4）相結(jié)合，并與結(jié)合在 點的激活蛋白（ 同作用，誘導 低水平轉(zhuǎn)錄；同時，在 增強子上亦存在功能性 合位點，增強子與啟動子協(xié)同作用，才能使 因充分轉(zhuǎn)錄與表達（ 等 ， 1997； 等， 1998）。盡管 因表達具有重要作用，但 因的表達必需細胞特異性轉(zhuǎn)錄因子的參與才能完全實現(xiàn)。 于亮氨酸拉鏈轉(zhuǎn)錄因子家族，其只在 胞中表達而不在 胞中表達，它可以與 因啟動子近端 應(yīng)元件結(jié)合。在體外， 以激活 因啟動子， 因敲除小鼠 其它 細胞因子（ 5、 6、 10、 13 等）的產(chǎn)生不受影響。因此， 因的高水平表達有重要作用（ I 等， 1998）。 鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族成員，也是 異性轉(zhuǎn)錄因子。 早期分化的 胞中移位表達，可抑制 化，使 細胞因子分泌增加，而使 細胞因子（ 12 等）分泌中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 5 減少；但 因?qū)?反應(yīng)不同， 直接激活 因啟動子，而 應(yīng)性較低，但對 有很強的結(jié)合能力（ I 等， 1998； S 等 ， 2003）。 首次在免疫細胞中發(fā)現(xiàn)的 T 盒轉(zhuǎn)錄因子家族成員，小鼠的 白由530 個氨基酸組成 ,含有一個由 189 個氨基酸組成的 T 盒 合域，人 氨基酸水平與小鼠 88%的同源性。用 跡和 跡雜交證實其僅選擇 性的表達于 未分化的 T 細胞及 胞中不表達，新鮮分離的 基因脾細胞在 非 導條件下可觀察到 表達；除 胞外 ,在活化的 B 細胞和 胞中可觀察到 同時表達 ,這表明 能與 表達有關(guān) ( 等， 2002)。目前，在因上發(fā)現(xiàn)了 3 個潛在的 合位點，兩個位于啟動子，一個位于第三個內(nèi)含子， 因的表達，而且可使 因位點染色體重組 ,可有 效地反式激活 因和 內(nèi)源表達（翟中和等， 2000）。另外還發(fā)現(xiàn) 動子具有抑制作用 ,而對 動子無明顯作用，但它可能通過抑制 因轉(zhuǎn)錄，降低 而抑制 細胞因子轉(zhuǎn)錄（ D 等 2003）。異位表達 新鮮分離的人 T 細胞，不僅可使 T 細胞在缺乏相應(yīng)細胞因子誘導下向 細胞分化 , 而且能誘導已分化的效應(yīng)性胞重新向 胞分化（ S 等， 2003）。從而說明 誘導 胞定向分化的特 異性轉(zhuǎn)錄因子。 與轉(zhuǎn)錄后 穩(wěn)定性有關(guān)。人們早就發(fā)現(xiàn)多種細胞因子 半衰期（ ）很短，如 的 均短于 30 分鐘，而 長達 17 小時，通過分析發(fā)現(xiàn) 、 基因的 富含 等， 2001)，當把 富含 連接到大鼠 端后，發(fā)現(xiàn) 穩(wěn)定性降低了 10果把 富含 缺失，則 穩(wěn)定性有明顯的提高，半衰期從 4 小時。所以， 3的富含 是 解的信號識別區(qū)（ S， 2001； 等， 1995； A 等， 2002）。研究 因表達調(diào)控具有實際意義，一方面可指導我們發(fā)掘拮抗劑或激活劑，便于主動地調(diào)節(jié)其表達；另一方面可指導我們構(gòu)建高效真核表達體系，以獲得高產(chǎn)量的重組 細胞因子，用于疾病的治療或作為疫苗佐劑使用。 體及其介導的信號傳遞 受體 (細胞表面或亞細胞組分中的一種生物大分子物質(zhì)，可以識別并特異性的與有生物活性的配體相結(jié)合，從而激活或啟動細胞的一系列生物化學反應(yīng)，最后導致配體特定的生物學效應(yīng)（ 孫大業(yè)等， 2001）。 揮其相應(yīng)的生物學功能也必須與其存在于靶細胞上的特異性受體相結(jié)合，通過受體的介導作用將胞外信號傳導至細胞內(nèi)，從而引起細胞內(nèi)的一系列變化；另外， 作用范圍和生物學效應(yīng)，取決于 體（ 表達和分布（ M 等，1999）?？梢姡荏w在 揮其相應(yīng)生物學效應(yīng)中具有十分重要的作用。因此， 號轉(zhuǎn)導途徑研究是目前研究的一個熱點，人們正在試圖控制或改變信號轉(zhuǎn)導，從而治療一系列疾病如腫瘤、自身免疫性疾病、免疫抑制或免疫缺陷、移植排斥反應(yīng)等。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 6 的結(jié)構(gòu)特點 1(, 成。其中 29 個氨基酸，分子量為 90 100膜外 區(qū)有 229 個氨基酸，含有兩個 構(gòu)域，五個 無 型細胞因子受體家族 的 x 序，它是 鏈，可與 聚體結(jié)合，主要分布于單核細胞、巨噬細胞、 T 細胞、 胞、中性粒細胞、成纖維細胞、上皮以及多種腫瘤細胞（ 等， 1994）。 10 氨基酸殘基，分子量為 62膜外區(qū)有 220 個氨基酸，含有兩個 構(gòu)域，但缺乏 序，有六個 膜區(qū)和胞漿區(qū)分別為 21 和 69 個氨基酸殘基，基因定位于 為 鏈（ ,1994）。 與 親和力結(jié)合，要通過胞膜外區(qū)與 合介導 等， 1994）。 介導的信號轉(zhuǎn)導 信號轉(zhuǎn)導是指一種信號形式轉(zhuǎn)換為另一種信號形式， 將胞外信號轉(zhuǎn)導到胞內(nèi)，細胞內(nèi)部將發(fā)生一系列的生化反應(yīng)，包括細胞生理反應(yīng)及誘導基因表達（ 孫大業(yè)等， 2001）。徑是目前研究最多的一條 主要信號轉(zhuǎn)導途徑，其參與了機體多種免疫和造血細胞的發(fā)育、分化成熟、調(diào)亡和功能的表達（賀平等， 1998），也是 導信號轉(zhuǎn)導的一條主要途徑。因此，國內(nèi)外學者近年來對此進行了深入廣泛的研究并取得了巨大進展。 1998 年 2 月在美國開了有關(guān) 專門會議，總結(jié)了過去 8 年的研究成果，充分說明了號轉(zhuǎn)導途徑的重要性。 于非受體型胞漿氨酸激酶，由 個成員構(gòu)成的一個家族，分子量為 110結(jié)構(gòu)上看， 族有 7 個高度保守的結(jié)構(gòu)域（ 從 C 端到 N 端依次為 構(gòu)域為蛋白酪氨酸激酶區(qū)（ 其中有活化所需的 序，切去該功能域后發(fā)現(xiàn) 僅失去激酶活性，而且成為一種顯性陰性分子。此外，該功能域還含有 2 個相鄰的酪氨酸殘基，該位點的磷酸化或脫磷酸化與 化有關(guān)。 構(gòu)域為激酶樣區(qū)（ 是與 合的部位， 子中該功能域自身無酶活性但與維持酶活性有關(guān)。 N 末端的 同源區(qū)域，無酶活性，是與細胞因子受體胞漿區(qū)域結(jié)合的功能域。最近發(fā)現(xiàn)在 N 端含有 樣（ 構(gòu)域，是 細胞因子結(jié)合所必需的結(jié)構(gòu)，目前認為其可能發(fā)揮一種分子接頭作用 (， 1995； 等， 1997)。在 直接底物中，信號轉(zhuǎn)導和轉(zhuǎn)錄活化因子（ of 一種 合蛋白，該家族由 成，結(jié)構(gòu)上可分為 4 個功能區(qū)， N 端為保守區(qū)，此區(qū)含有蛋白酪氨酸磷酸激酶功能域（ 中間是 合功能域（ 含有 合序列， C 末端是具有轉(zhuǎn)錄活化的功能域（ 含有與轉(zhuǎn)錄因子相互作用的基序和酪氨酸磷酸化位點，在 間依次為 能域，對于 磷酸化和二聚體化游重要作用， C 末端功能域在 能中發(fā)揮著重要作用 (H 等， 1995； OJ 等 1997)。 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 引言 7 其靶細胞上的特異受體結(jié)合后誘導受體 鏈發(fā)生聚化形成二聚體，二聚化的 鏈胞膜外區(qū)因變構(gòu)而產(chǎn)生與 鏈結(jié)合區(qū)域，其分別結(jié)合一條 鏈形成 22 四聚體，結(jié)合后的 合位點， 受體上的結(jié)合位點結(jié)合后發(fā)生自身或與受體交叉酪氨酸磷酸化而活化，活化 的 一步募集細胞內(nèi)含 構(gòu)域的信號分子如 使其磷酸化而活化，活化的 成同源或異源二聚體，進而與 核定位分子結(jié)合，移入細胞核內(nèi)，結(jié)合到特定基因啟動子上，激活相應(yīng)基因的表達，完成 導的信號轉(zhuǎn)導過程，該途徑活化迅速，在受體受到刺激 115 分鐘內(nèi) 發(fā)生磷酸化，隨即進入細胞核 (J 等 1998； J, 2001； 陳曉萍等， 2003)。 導的信號轉(zhuǎn)導除了 徑外，還有其它途徑，如 徑。一般來說， 徑主要調(diào)節(jié)功能性基因的轉(zhuǎn)錄， 徑主要介導細胞增殖反應(yīng)，研究同時還發(fā)現(xiàn) 徑之間也存在著復雜的相互作用（ W 等， 1996；， 2000）。此外， 號傳遞中還存在著負反饋抑制因子，其中信號轉(zhuǎn)導的抑制因子（ of 多數(shù)細胞因子受體信號轉(zhuǎn)導的重要調(diào)節(jié)劑 ,它們通過負反饋方式調(diào)節(jié)細胞因子啟動的 號轉(zhuǎn)導通路 ,其作用機制 包括：與 合而抑制其激酶活性 ,競爭性抑制 活化受體的結(jié)合而抑制 激活 ,以及介導信號蛋白依賴蛋白酶體的降解過程 ( 等 , 1997；朱蕾， 2003)。 機體免疫應(yīng)答的產(chǎn)物，對機體免疫系統(tǒng)具有強大的調(diào)節(jié)作用，是機體發(fā)揮免疫功能，清除胞內(nèi)寄生病原體不可缺少的成分，與疾病的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系；另一方面，機體 可引起病理性反應(yīng)。因此， 疾病的診斷、治療和預(yù)防等方面有著極為廣闊的應(yīng)用前景（ M 等 , 1996； 等， 2001）。進入 20 世紀 80 年代以來，包括 內(nèi)的諸多細胞因子的臨床應(yīng)用已成為醫(yī)學研究和產(chǎn)品開發(fā)的重要領(lǐng)域，進入臨床應(yīng)用的細胞因子逐年增多，它們在人類和動物疾病的診斷、治療和預(yù)防等方面發(fā)揮著越來越重要的作用，可以預(yù)計，在不久的將來，干擾素的應(yīng)用可能會有新的突破和貢獻。 診斷和治療方面的應(yīng)用 由于 僅具有抗胞內(nèi)寄生微生物及腫瘤細胞生長繁殖的功能，同時具有較強的免疫調(diào)節(jié)作用，因此它一方面可以治療某些疾病，如免疫缺陷性疾病、病毒性疾病、細菌性疾病及腫瘤等疾病，另 一方面可以導致和 /或促進某些疾病的發(fā)生和發(fā)展，如自身免疫性疾病、移植排斥反應(yīng)等，（ 陳受霓等， 2003）。支氣管哮喘患者體內(nèi) 細胞因子的濃度顯著升高，在其作用下 成增多， 嗜堿性粒細胞和肥大細胞上的高親和力受體結(jié)合，從而引起本病的發(fā)生。應(yīng)用 抗 體或 減少 細胞因子產(chǎn)生，從而抑制過敏反應(yīng)，達到治療的目的。在多發(fā)性硬化癥病人的病灶， 生明顯增加，而在恢復期， 泌增多 ， 細胞因子下降。因此，通過檢測細胞因子的濃度可判斷疾病的發(fā)展情況，也可通過運用 細胞因子或抑制 細胞的藥物阻止其進一步的發(fā)展。給大鼠肌肉注射 外，重組豬 第一章 引言 8 在體外可有效抑制豬口蹄疫病毒（ 藍耳病病毒（ 非洲豬瘟病毒（ 殖，同時對免疫抑制豬具有良好免疫調(diào)節(jié)作用（金奇， 2001）。受基因免疫的啟發(fā)， 將表達載體通過鼻內(nèi)接種的方法使其在小鼠的肺內(nèi)表達 果小鼠可抵抗合胞體 病毒的感染（ 等， 2000）。 將 因轉(zhuǎn)入腫瘤特異性 胞，使該 T 細胞的殺瘤活性提高了 23 倍，而且這種轉(zhuǎn)基因腫瘤特異性 腫瘤局部 濃度遠高于其它組織，從而加強了抗腫瘤效果，又大大減輕了 毒副作用，說明 因?qū)氙煼ㄓ衅洫毺氐膬?yōu)勢（ ,1996）。 為疫苗免疫佐劑的應(yīng)用 早在