【畢業(yè)學(xué)位論文】(Word原稿)茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化動(dòng)態(tài)的研究-土壤微生物群落

分類號： 單位代碼： 10389 密 級： 學(xué) 號： (S/B) 福建農(nóng)林大學(xué)碩士學(xué)位論文 茶園土壤微生物 群落結(jié)構(gòu) 變化 動(dòng)態(tài)的 研究 學(xué) 科 門 類： 理 學(xué) 一級學(xué)科名稱： 生命科學(xué) 二級學(xué)科名稱： 微生物 研 究 方 向： 土壤微生物群落 研 究 生： 指 導(dǎo) 教 師： 完 成 時(shí) 間：二 年四月 獨(dú)創(chuàng)性聲明 本人聲明，所呈交的學(xué)位（畢業(yè)）論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下獨(dú)立完成的研究成果，并且是自己撰寫的。盡我所知，除了文中作了標(biāo)注和致謝中已作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果。與我一同對本研究做出貢獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了謝意，如被查有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 論文使用授權(quán)的說明 本人完全了解福建農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位（畢業(yè)）論文的規(guī)定，即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù) 印件，允許論文被查閱和借閱 ; 學(xué)?？梢怨颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。 保密，在 年后解密可適用本授權(quán)書。 不保密，本論文屬于不保密。 學(xué)位（畢業(yè)）論文作者親筆簽名： 日期： 指導(dǎo)教師親筆簽名： 日期： I 中文摘要 摘要： 目前，磷脂脂肪酸 (析被廣泛地應(yīng)用于土壤微生物多樣性研究 。磷脂是所有生物活細(xì)胞重要的的膜組分，在真核生物和細(xì)菌的膜中 磷脂分別占約 50和 98。磷脂的構(gòu)成成分，它具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物特異性，土壤中 存在及其豐度可揭示特定生物或生物種群的存在及其豐度 不同的土壤環(huán)境有不同的磷脂脂肪酸標(biāo)記，我通過研究不同生境的磷脂脂肪酸圖表分析它們土壤微生物群落異同之處。本文研究了不同海拔的茶園土壤微生物群落發(fā)現(xiàn)結(jié)果表明，不同海拔茶園土壤共檢測 35 個(gè)同的 不同海拔茶園土壤分布差異顯著，可分為兩種類型：完全分布和不完全分布，高海拔（ 800 米）的茶園土壤分布的 類和數(shù)量都是最多。對不同海拔茶 園土壤微生物各主要類群 對生物量分析表明，各海拔高度的茶園土壤都沒有放線菌存在，指示細(xì)菌的 16:0 標(biāo)記在海拔 800 米處分布量最大，指示真菌的18:36c(6,9,12)標(biāo)記在海拔 600 米處分布量最大。不同樹齡茶園的微生物群落變化也是很大的， 脂肪酸 14:00、 ， 16:00、 、 8c 等脂肪酸標(biāo)記隨樹齡的增大而增大， 108:0、 18:17C、 18:1 9c、 18:36c(6,9,12)， 18:00、 隨樹齡先增大后減小。 還有一部分脂肪酸標(biāo)記變化在不同的樹齡茶園間變化很小 屬于穩(wěn)定型的一類脂肪酸標(biāo)記 。研究不同月份茶園土壤微生物群落是發(fā)現(xiàn)在 8 月份不同樹齡的茶園土壤微生物總量和種類都是全年最高點(diǎn)。 文摘要 is in is of of of in in to of 5 in be of 800 of no in of 6:0 00 8:36c(6,9,12) 00 of be in in to in we a 800 00 of of 4:00、 ， 16:00、 、 8c) of 08:0、 18:17C、 18:1 9c、 18:36c(6,9,12)， 18:00、 )it of of in we 目 錄 第一章 綜述 . 1 1 茶園土壤生態(tài)及茶園改造 . 1 樹種植概況及 發(fā)展中的問題 . 1 園土壤生態(tài)建設(shè)的必要性和重要性 . 2 2 茶園土壤微生物研究概況 . 3 壤微生物群落研究進(jìn)展分析方法 . 3 肪酸生物標(biāo)記在土壤微生物群落研究中的應(yīng)用 . 5 園土壤微生物群落研究方法與進(jìn)展 . 6 園土壤微生物群落 研究的應(yīng)用前景 . 7 3 研究新意 . 7 第二章 海拔對茶園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響 . 8 1 材料方法 . 8 本選擇及采集 . 8 樣磷脂脂肪酸的提取和測定 . 9 2 結(jié)果分析 . 10 壤微生物群落的磷脂脂肪酸分析 . 10 同海拔茶樹根系土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析 . 10 同海拔茶樹根際土壤微生物各主要類群 對生物量 . 12 生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的聚類分析 . 14 同海拔茶樹根際土壤微生物群落多樣性分析 . 14 3. 討論 . 15 第三章 樹齡對茶園土壤微生物群落影響研究 . 17 1 材料與方法 . 17 本選擇及采集 . 17 樣磷脂脂肪酸的提取和測定 . 17 2 結(jié)果與分析 . 18 肪酸標(biāo)記在不同樹齡茶園土壤中的含量對比 . 18 脂肪酸標(biāo)記聚類分析 . 21 3. 討論 . 24 第 四 章 季節(jié)變化對茶園土壤微生物群落影響研究 . 25 1 材料與方法 . 25 本選擇及采集 . 25 樣磷脂脂肪酸的提取和測定 . 25 2 結(jié)果與分析 . 26 肪酸標(biāo)記在不同樹齡茶園土壤中的含量對比 . 26 3. 討論 . 30 第 五 章 結(jié)論 . 31 參考文獻(xiàn) . 31 致 謝 . 35 作者簡介 . 36 福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 1 第一章 綜述 茶樹拉丁語學(xué) 名： 山茶科山茶屬，為多年生常綠木本植物按樹干來分，有喬木型、半喬木型和灌木型三種類型一般為灌木， 適宜在 土層厚達(dá) 1米以上不含石灰石，排水良好的砂質(zhì)壤土，有機(jī)質(zhì)含量 1%2%以上，通氣性、透水性或蓄水性能好， 酸堿度 壤環(huán)境生長 。光照是茶樹生存的首要條件，不能太強(qiáng)也不能太弱，對紫外線有特殊嗜好，因而高山出好茶。隨著海拔的升高，氣溫和濕度都有明顯的變化，在一定高度的山區(qū)，雨量充沛，云霧多，空氣濕度大，漫射光強(qiáng)，這對茶樹生育有利，但也不是愈高愈好，在 1000 米以 上，會有凍害 1,2,35。 1 茶園土壤生態(tài)及茶園改造 樹種植概況及發(fā)展中的問題 茶，原產(chǎn)于中國。我國人民發(fā)現(xiàn)茶和利用茶歷史已經(jīng)很久遠(yuǎn)了。大約人類進(jìn)入到文明時(shí)代，就有了對茶的認(rèn)識。神農(nóng)本草中說： 神農(nóng)嘗百草，日遇七十二毒，得茶而解之 。神農(nóng)是古代先民的代表，莊子盜跖篇 說： 神農(nóng)之世 只知其母，不知其父。 也就是說 ， 早在幾千年前，我們的祖先還處于母系氏族社會，由狩獵時(shí)代演變到養(yǎng)殖和耕種的時(shí)代，就已經(jīng)發(fā)現(xiàn) 和利用茶葉了， 距今已有近 5000 年的歷史了。 中國茶區(qū)分布遼闊，東起東經(jīng) 122 度的臺 灣省東部海岸，西至東經(jīng) 95 度的西藏自治區(qū)易貢，南自北緯 18 度的海南島榆林 ， 北到北緯 37 度的山東省榮城縣，東西跨經(jīng)度27 度 ， 南北跨緯度 19 度。共有浙江、湖南、湖北、安徽、四川、福建、云南、廣東、廣西、貴州、江蘇、江西、陜西、河南、臺灣、山東、西藏、甘肅、海南等 21 個(gè)?。▍^(qū)、市）的上千個(gè)縣市。地跨中熱帶、邊緣熱帶、南亞熱帶、中亞熱帶、北亞熱帶和暖日溫帶。在垂直分布上，茶樹最高種植在海拔 2600 米高地上，而最低僅距海平面幾十米或百米。在不同地區(qū)，生長著不同類型和不同品種的茶樹，從而決定著茶葉的品質(zhì)及其適制性和適應(yīng) 性，形成了一定的茶類結(jié)構(gòu)。 本論文主要研究福建安溪茶園土壤微生物群落，所以主要介紹安溪茶園的發(fā)展?fàn)顩r以及面臨的問題。 福建省安溪縣地處廈漳泉結(jié)合部，居山而臨海。全縣土地面積 口 111 萬，是全國著名的烏龍茶主產(chǎn)區(qū)，鐵觀音、黃金桂的發(fā)源地。安溪產(chǎn)茶歷史已有 1000 多年，自古就有 “閩南茶都 ”的美譽(yù)。安溪制茶起源于唐朝，發(fā)展于宋元，興盛于明清，停滯于近代，崛起于當(dāng)代 67。據(jù)安溪縣志載， 250 多年前安溪人就已在東南亞形成了初具規(guī)模并較為完整的茶葉加工銷售體系。 20 世紀(jì) 90 年代后， 安溪茶業(yè)步人新的高速發(fā)展時(shí)期，其發(fā)展速度之快、勢頭之猛 、效益之高 、影響之遠(yuǎn)，居全國上千個(gè)產(chǎn)茶縣之最，安溪也從福建省最大的貧困縣，躋身全國縣域經(jīng)濟(jì)競爭力百強(qiáng)縣之列，被稱為茶業(yè)界的一面旗幟。 安溪烏龍茶歷史悠久，安溪烏龍茶兩大品牌產(chǎn)品 鐵觀音和毛蟹盛產(chǎn)于名聞遐邇的安溪 “兩坪 ”：西坪和大坪。兩大主產(chǎn)區(qū)歷福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 2 史上 曾經(jīng)創(chuàng)造過極大的輝煌， 1957年全國十四省的茶葉現(xiàn)場推廣會就在安溪大坪召開 ，可見大坪烏龍茶昔日的名氣和風(fēng)光?？墒菚r(shí)過境遷，如今 “風(fēng)水 ” 已經(jīng)轉(zhuǎn)到以往名不見經(jīng)傳的一些新茶區(qū) 祥華 、感德等地。為何老茶區(qū) 不再風(fēng)光呢 ?原因有三： 其一，由于茶園舊、茶樹老 、 長期依靠化肥農(nóng)藥 “ 做力 ”， 茶樹及土壤受到嚴(yán)重?fù)p害，制出的茶葉農(nóng)殘普遍偏高 7。其二 ，正因?yàn)榇笃簽觚埐杵財(cái)?shù)量的發(fā)展，由此制約了質(zhì)量的提升。其三 ， 茶園基礎(chǔ)設(shè)施差，近年來由于各級財(cái)政對茶葉的投入極為有限，茶農(nóng)自我積累、自我投入的能力又嚴(yán)重不足，造成大部分茶園年久老化、基礎(chǔ)設(shè)施不配套、茶葉生產(chǎn)條件差，使受制于天的落后生產(chǎn)狀況未能根本改變。 其中由于茶園土壤環(huán)境生態(tài)遭到嚴(yán)重破壞是老茶園茶葉質(zhì)量下降的主要原因，隨著樹齡的增長對茶園土壤的各種營養(yǎng)元素及活性離子主要包括氮 ，磷，鉀，鐵，鋁，鈣，鎂等元素不斷消耗，而茶農(nóng)主要施用化學(xué)肥料，造成土壤肥力單一， 普通元素富足而部分微量元素缺乏，久而久之 土壤 物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分都發(fā)生顯著變化，例如土壤板結(jié)不再是疏松的顆粒結(jié)構(gòu)，對土壤水分保持以及茶樹根系發(fā)展都是不利的，或者土壤酸堿度發(fā)生顯著變化 。 自然土壤植茶后，由于茶樹生物物質(zhì)循環(huán)及施肥管理等因素，土壤理化性質(zhì)會發(fā)生一系列變化。明顯的變化是土壤 下降， F 等元素含量增加 ，而 M 等鹽基離子和微量元素相對缺乏；另外，由于茶樹凋落物歸還土壤及根系分泌物的影響， 多酚類物質(zhì)逐 漸在茶園土壤中富集 ，形成了非常獨(dú)特的土壤化學(xué)環(huán)境 2。 茶樹起源于我國西南地區(qū)的云貴高原，在亞熱帶溫暖濕潤的氣候條件下，形成了喜酸怕堿的生活習(xí)性，茶樹在土壤 間能正常生長，尤以 最好， 于 生長逐漸停滯，超過 甚至?xí)劳觯?低于 茶樹生長受到抑制，影響茶葉產(chǎn)量與質(zhì)量，并且土壤理化性質(zhì)將明顯惡化。相關(guān)報(bào)道表明，當(dāng)前不同類型茶園土壤已明顯地向越來越酸的方向發(fā)展，而茶園土壤的酸化無疑對茶樹的生長和茶葉的品質(zhì)產(chǎn)生了嚴(yán)重的影響。土壤酸化是指土壤中氫 離子增加的過程或者說是土壤酸度由低變高的過程，它是一個(gè)持續(xù)不斷的自然過程 ， 主要有下列幾個(gè)原因： 茶樹的自身代謝作用、人為管理措施不當(dāng)以及 境惡化等種種 原因，茶園土壤酸化日趨嚴(yán)重，土壤 低 于 茶園卻越來越多，并已成為茶葉生產(chǎn)中的世界問題。早在 20 世紀(jì) 7080年代就有世界各地茶園土壤化問題的許多相關(guān)報(bào)道。 20 世紀(jì) 60 年代，世界上主要茶國茶園土壤的 大多在 到了 7080 代，世界各地茶園土壤在不斷酸化， 右，有的更低。例如在 20 世紀(jì) 70 年代末，日本 土 壤 在 而到 80 年代末， 一 半以上的茶園土壤 在 4 0 以下。 本論文研究安溪感德等地的茶園土壤，經(jīng)測試大部分土樣 右部分低于 所以安溪產(chǎn)茶區(qū)部分土壤存在酸化的問題，個(gè)別地區(qū)甚至酸化嚴(yán)重。 園土壤生態(tài)建設(shè)的必要性和重要性 在上一節(jié)我們介紹了茶園特別是老茶園存在的突出問題，因茶樹自然生長代謝累積以及人們長期施用化學(xué)肥料和化學(xué)農(nóng)藥等原因造成茶園土壤生態(tài)遭到破壞進(jìn)而導(dǎo)致茶葉質(zhì)量日漸 變差，傷失 了茶葉原有的茶香 等品質(zhì) 。所以解決茶園當(dāng)前面臨的問題迫在眉福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 3 睫。 不僅 關(guān)系 到茶區(qū)農(nóng)民的當(dāng)前經(jīng)濟(jì)利益而且關(guān)系到子孫后代福祉 。 現(xiàn)在不少地方政府部門已經(jīng)意識這個(gè)問題的嚴(yán)重性，并邀請專家開展討論會集思廣益探討長期可持續(xù)發(fā)展的新型茶園。 根據(jù)生態(tài)學(xué)原理，我們將茶園生態(tài)系統(tǒng)定義為：由以茶樹為優(yōu)勢種群的生物群落和物理環(huán)境組成的生態(tài)系統(tǒng)。茶園生態(tài)系統(tǒng)建設(shè)的目標(biāo) ,采取人工措施 ,豐富和培育茶園生態(tài)系統(tǒng)中的生物群落 (它包括茶園及周圍環(huán)境的各類生物，如林木、茶園雜草、土壤微生物、茶園病蟲及天敵等 )，因地制宜改善茶園物理環(huán)境，采取清潔的生產(chǎn)技術(shù)，促進(jìn)系統(tǒng)內(nèi)部以及系統(tǒng)與系統(tǒng)外部之間能量的流動(dòng)和物質(zhì)的循 環(huán)，使茶園生態(tài)系統(tǒng)具有較強(qiáng)的自然調(diào)節(jié)生態(tài)平衡的能力，保持相對平衡。其中土壤生態(tài)是一個(gè)重要且基礎(chǔ)的方面，它與上面的植被結(jié)構(gòu)是相互聯(lián)系相互影響， 與茶農(nóng)的茶園管理措施也是緊密相連的，所以茶園生態(tài)建設(shè)不是但一方面的問題，而是一個(gè)系統(tǒng)工程。土壤生態(tài)狀況也是這個(gè)系統(tǒng)的綜合反映。土壤生態(tài)維護(hù)方面有一下幾點(diǎn)措施：（ 1）生物群落結(jié)構(gòu)合理是茶園生態(tài)平衡的關(guān)鍵 ，病蟲害發(fā)生的聯(lián)系等。一般生態(tài)系統(tǒng)中，生物群落結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，各生物之間以食物鏈和食物網(wǎng)鏈接的依存度也就越高，整個(gè)系統(tǒng)的穩(wěn)定性也越大。因此在茶園生態(tài)建設(shè)過程中，應(yīng)以維持茶園生態(tài) 系統(tǒng)平衡為標(biāo)，采取科學(xué)合理的農(nóng)業(yè)措施增加各生物群落的種類和相對數(shù)量，并保持相對平衡。（ 2）適度中耕，有利于促進(jìn)茶樹根系的生長，有利于土壤的通風(fēng)和微生物的活動(dòng)，有利于破壞土層中害蟲的棲息場所，便于害蟲天敵覓食。茶園除草 ，要除養(yǎng)結(jié)合。對于惡性雜草，要及時(shí)耕除，不用除草劑，對般雜草，適量保留，有利于害蟲天敵的棲息和改善茶園生態(tài)小氣候。（ 3）茶園施肥要以有機(jī)肥為主，逐步做到不施無機(jī)肥。茶園施用的有機(jī)肥要作無害化處理，防止有害微生物、有害蟲卵等污染茶園。茶園施肥要適時(shí)適量，做到平衡施肥，避免施人的氮素過量 。 以生態(tài) 工程為載體，構(gòu)建平衡協(xié)調(diào)的生態(tài)體系是嚴(yán)格控制茶園規(guī)模。嚴(yán)格禁止毀林新開茶園，退茶還林，對于坡度過陡的茶園征收水土保持費(fèi)，對于違法開墾茶園的予以嚴(yán)厲追究，確保整個(gè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)健康發(fā)展。 經(jīng)濟(jì)效益和 生態(tài)效益和諧統(tǒng)一。 2 茶園土壤微生物研究概況 壤微生物群落研究進(jìn)展分析方法 土壤是一個(gè)極為復(fù)雜的生態(tài)體系，土壤微生物是陸地生態(tài)系統(tǒng)中重要的生命體，其群落結(jié)構(gòu)組成及其變化在一定程度上反映了土壤的質(zhì)量及其健全性，因此對土壤微生物多樣性研究具有重要意義。但是土壤微生物一直被認(rèn)為是研究中的 “黑匣子 ”許多研究已經(jīng)證實(shí)，通 過傳統(tǒng)的分離方法鑒定的微生只占環(huán)境微生物總數(shù)的 0 1一 10 5。傳統(tǒng)的土微生物研究方法如分離計(jì)數(shù)法、顯微鏡法往往會低估價(jià)土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成，雖然使用電顯微鏡或熒光抗體染色法可以對土壤微生物形態(tài)多樣性進(jìn)行觀察，但是這兩種方法并不能描述出土微生物的群落結(jié)構(gòu)組成方面的信息，也無法描繪出不同群體的生理差異。隨著微生物研究技術(shù)的發(fā)尤其是分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，土壤微生物學(xué)家開發(fā)出一系列的研究土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的方法。 1、 生物標(biāo)志物 ( 。 福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 4 使用生物標(biāo)志物來定量描述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組 成是最常用的方法之一。這種生物標(biāo)志物通常是微生物細(xì)胞的生化組成成分或是細(xì)胞外分泌產(chǎn)物。當(dāng)測定土壤中這些化合物時(shí)，首先使用一種合適的提取劑直接把其從土壤中提取 出來，然后對提取物進(jìn)行純化后用合適的儀器加以定量測定。用這種方法來定量描述土壤微生物的群落結(jié)構(gòu)組成的優(yōu)點(diǎn)是既不需要把微生物的細(xì)胞從環(huán)境樣中分離，同時(shí)又能克服由于對微生物培養(yǎng)而導(dǎo)致不同微生物種群可能會發(fā)生選擇性生長所造成的麻煩。磷脂脂肪酸 (譜分析、脂肪酸 (圖以 及甲基脂肪酸酯 (圖分析在群落動(dòng)態(tài)分析上的應(yīng)用十分廣泛。磷脂是構(gòu)成生物細(xì)胞膜的主要成分，約占細(xì)胞干重的 5 12在細(xì)胞死亡時(shí)，細(xì)胞膜很快被降解，磷脂脂肪酸被迅速代謝掉，因此它只在活細(xì)胞中存在 ，十分適合于微生物群落的動(dòng)態(tài)監(jiān)測。另一個(gè)重要因素是脂肪酸具有屬的特異性，特殊的甲基脂肪酸已經(jīng)被作為微生物分類的依據(jù)。磷脂脂肪酸譜圖分析法首先將磷脂脂肪酸部分提取出來，然后用氣相色譜分析，得出 圖。群落的微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，即可以通過譜圖的變化 得到快速有效的監(jiān)測。甲基脂肪酸酯是細(xì)胞膜磷脂水解產(chǎn)物，該法利用 統(tǒng) (一種氣相色譜分析系統(tǒng) )分析出全細(xì)胞的 圖 C 等人用 圖法找出了微生物群落與樹木根系的關(guān)系。 等人通過試驗(yàn)驗(yàn)證了 圖法分析土壤微生物群落的可行性，還同時(shí)進(jìn)行了生物量分類結(jié)構(gòu)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明 圖法能夠監(jiān)測土壤微生物群落細(xì)微變化。為人們提供了一個(gè)監(jiān)測土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的常規(guī)方法。 2、以 基礎(chǔ)的 分析方法。 細(xì)胞中相對穩(wěn)定， 拷貝數(shù)多，并存在于所有細(xì)菌中。 保守區(qū)和可變區(qū)組成，在細(xì)菌中高度保守，素有 “細(xì)菌化石 ”之稱，是細(xì)菌系統(tǒng)分類學(xué)研究中最有用和最常用的分子鐘。原核生物的 為 3 種，分別為 5S 16S 23S 且它們位于同一操縱子上。其中 16S 列分析已經(jīng)成為細(xì)菌種屬鑒定和分類的標(biāo)準(zhǔn)方法， 23S 子比較大，并且只有少數(shù)種的核酸序列被報(bào)道，尚未在細(xì)菌分類和鑒定中得到廣泛應(yīng)用。 16S 23S 區(qū) ( 于沒有特定功能和進(jìn)化速率 比 16十多倍，近幾年來在細(xì)菌系統(tǒng)發(fā)育學(xué)，特別是在相近種和菌株的區(qū)分和鑒定方面占據(jù)一席之地。由于以上序列每年都以很快的速度補(bǔ)充到 去，這使得微生物工作者能夠比較方便地利用這一數(shù)據(jù)庫進(jìn)行微生物群體多樣性研究 17 3、變性梯度凝膠電泳 (溫度梯度凝膠電泳 (自從 31 首先將 術(shù)應(yīng)用到分子微生物生態(tài)學(xué)后，已證明這類電泳技術(shù)是揭示土壤中微生物群體遺傳多樣性的有效手段，可用于污染土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的研究 、微生物種群動(dòng)態(tài)的分析等。 始時(shí)在醫(yī)學(xué)上用于檢測基因突變，后來被廣泛應(yīng)用于微生物生態(tài)的研究。同樣大小的 列由于含有的堿基不同，各片段的 也就不同。甚至一個(gè)堿基對的不同，都會引起 大的差異， 是應(yīng)用這種差異來區(qū)分不同的基因序列 22。 福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 5 4、 16S 限制性片段長度多態(tài)性 析 (提取土壤中的微生物總 通用引物擴(kuò)增 16S 因，并構(gòu)建于載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，建立 16S 因文庫，隨即選取一定 數(shù)量的克隆，以特定的限制性內(nèi)切核酸酶消化 16S 因，通過電泳分析消化后的片段長度多態(tài)性，來反映微生物群落結(jié)構(gòu)的多樣性 26。 同時(shí)利用分離培養(yǎng)物和直接從土壤中提取的 16S 因的 譜分析了松樹根圈土壤 (樹間的土壤 (生物的群落結(jié)構(gòu)，他們通過 和 兩種限制性 內(nèi)切酶分別分析了 17 種分離培養(yǎng)物和 801 種直接從土壤中提取的 16因的 譜， 發(fā)現(xiàn)從土壤中直接提取的有 498 種系統(tǒng)型 (在分離培養(yǎng)物中卻只有 34 種。并且還發(fā)現(xiàn)松樹根圈土壤中的微生物豐富度大于樹間的土壤 36。 法最大的缺點(diǎn)是工作量大，目前，應(yīng)用該方法進(jìn)行微生物群落結(jié)構(gòu)分析，還沒有人設(shè)置重復(fù)。 由于土壤微生物群落組成極其復(fù)雜，目前所應(yīng)用的任何方法都不能窮盡對土壤微生物的認(rèn)識，但 是 這些方法的應(yīng)用卻使人們對復(fù)雜的土壤微生物的認(rèn)識逐漸深入，新的微生物類群不斷被發(fā)現(xiàn)引大多數(shù)土壤微生物未知種群蘊(yùn)藏著目前還無法估量的資源。通過土壤微生物群落和多樣性研究，從土壤 微生物資源中分離篩選、開發(fā)出功能微生物，將是今后應(yīng)該加強(qiáng)研究的重要工作。結(jié)構(gòu)總是和特定的功能相聯(lián)系的，對土壤微生 物結(jié)構(gòu)的認(rèn)識，是為了更好地發(fā)揮土壤微生物的功 能，為工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)服務(wù)。穩(wěn)定性同位素等方法在土壤微生物結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系上的研究，使人們找到了一些具有特定功能的新的微生物類?，F(xiàn)代生物化學(xué)以及分子生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用于土壤微生物學(xué)研究，大大拓寬了研究的深度與廣度，必將為土壤微生物學(xué)的研究帶來深遠(yuǎn)的影響。 肪酸生物標(biāo)記在土壤微生物群落研究中的 應(yīng)用 目前，磷脂脂肪酸 (析被廣泛地應(yīng)用于土壤微生物 多樣性研究 。磷脂是所有生物活細(xì)胞重要的的膜組分，在真核生物和細(xì)菌的膜中磷脂分別占約 50和 9811。 磷脂的構(gòu)成成分，它具有結(jié)構(gòu)多樣性和生物特異性，土壤中 存在及其豐度可揭示特定生物或生物種群的存在及其豐度。磷脂在細(xì)胞死亡后快速降解 (厭氧條件下約需 2 d，而好氧條件下約需 16 d) ， 故用以表征微生物群落中 “存活 ”的那部分群體。 命名一般采用以下原則：以總碳數(shù)：雙鍵數(shù)和雙鍵距離分子末端位置命名 ,c 表示順式， t 表示反式， a 和 i 分別表示支鏈的反異構(gòu)和異構(gòu)， 示 不知道甲基的位置， 10示一個(gè)甲基團(tuán)在距分子末端第 10 個(gè)碳原子上，環(huán)丙烷脂肪酸用 c)r 表示。從已有的研究結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，作為革蘭氏陽性細(xì)菌的標(biāo)記 要有： 、 、 18:19C，作為革蘭氏陰性細(xì)菌的標(biāo)記 要有： 、 。16:15C、 18:19C 18:36C(6,9,12)是標(biāo)記真菌的 作放線菌的標(biāo)記 要是 1012 當(dāng)然，對這些 源的劃分并不是絕對的，而是根據(jù)它們在同類群微生物中 出現(xiàn)幾率和專一性及穩(wěn)定性的一個(gè)相對劃分，旨在通過它們反映土壤微福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 6 生物的變化。不可否認(rèn)的是，有的 能同時(shí)來自不止一種微生物，如 100就可 能同時(shí)來自放線菌和細(xì)菌。 總之，通過對 定量測定可完成對了解微生物活細(xì)胞生物量的測定，并可通過根據(jù) 析的種類了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)。生物標(biāo)記物可分為通用生物標(biāo)記物 (特定生物標(biāo)記物 (類。通用生物標(biāo)記物可反映總生物量。如 鏈磷脂脂肪酸 (總量可用于了解土壤微生物總生物量。革蘭氏陽性和陰性細(xì)菌中均含有單不飽和脂肪酸(但在革蘭氏陽性細(xì)菌中它們對總 相對貢獻(xiàn)很少 (海拔 500 米處（ 7733） 海拔 600 米處（ 7165） 海拔700 米處（ 4994） 。而各海拔茶樹根際土壤真菌 18:36c(6,9,12)的相對生物量大小依次為： 海拔 600米處（ 1210） 海拔 500 米處（ 1067） 海拔 800 米處（ 648） 海拔 700 米處（ 0）。 福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 13 020004000600080001000012000140001600018000500 600 700 800 海拔高度（ m ）三種不同脂肪酸生物標(biāo)記含量（6: 0018: 3W 6C (6 ,9,1 2)T 10 M E 18: 0圖 2 不同海拔茶樹根際土壤重要微生物類群 ？細(xì)菌，真菌，放線菌 圖 3不同海拔茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記聚類分析 ？ 20:00 20:19C a 17:19C 10 12:0 33:0 25:0 3OH G 16:1 27:00 10 7:0 38:0 29:0 10 4:15C 16:0 N 3OH F 17:0 2:00 14:00 18:36C (6,9,12) 15:0 8C 17:0 A 18:00 16:0 106:00 18:19C 16:15C 16:0 A 18:17C 福建農(nóng)林大學(xué)碩士畢業(yè)論文 茶園土壤微生物脂肪酸生物標(biāo)記分析及其群落結(jié)構(gòu)變化研究 14 生物群落脂肪酸生物標(biāo)記的聚類分析 聚類分析結(jié)果見圖 3， 當(dāng) 歐氏距離為 將不同海拔茶園的脂肪酸生物標(biāo)記分成兩個(gè)大的類群。類型 包括脂肪酸標(biāo)生物標(biāo)記 20:00、 20:19C 、 9C、 12:00、108:0、 12:0 313:0 214:00、 14:15C、 15:0 3 3F、 G、 16:0 N 16:1 217:00、 107:0 、 、 318:0 28:3(6,9,12)、 109:0， 其特征為脂肪酸生物標(biāo)記為不完全分布且分布量低，在各海拔平均分布量見表一；類型 包括脂肪酸生物標(biāo)記 、 、 16:00、 106:0、 、 16:15C、 、 、 18:00、 18:17C、 18:19C、 8C， 其特征是脂肪酸生物標(biāo)記完全分布、在各海拔平均分布量較高。具體數(shù)據(jù)參照表 1。 同海拔 茶樹根際土壤微生物群落多樣性分析 微生物群落多樣性指數(shù)見表 2，經(jīng)主成份分析，相關(guān)系數(shù)見