【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究

蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 1 第一章 引言 睡眠是生命體不可缺少的基本行為，對維持機體正常的生理行為起著無可替代的作用。但是在當今社會，隨著生活壓力的增加，睡眠不足的問題越來越普遍，在青年和中年人群中尤為如此。人們往往傾向于認為：睡眠時間的減少只是會引起短期的困倦和某些認知障礙，但是并不會引起太大的健康問題。由此，許多人有意地減少睡眠時間，忙于個人事業(yè)或者其他活動。 勞德代爾等的研究顯示，青年和中年人群中，每晚睡眠時長為 5 至 7 小時的人所占比例最大。人們每天平均睡眠時長近年來呈縮短趨勢。加班工作、陪伴家人、觀看 電視、熬夜上網(wǎng)、過度娛樂等活動擠占了人們的睡眠時間，使平均睡眠時長縮短。睡眠不足可以引起一系列健康問題；此外還會引發(fā)很嚴重的事故，例如司機疲勞駕駛會危及乘客的生命安全等；睡眠剝奪甚至會造成嚴重的災難，如美國三里島核泄漏事件，就是與監(jiān)控人員睡眠不足、工作能力降低有關。如今睡眠不足問題已經(jīng)成為世界各國都非常關心的重要社會問題 1基于這種形勢，由世界精神衛(wèi)生和神經(jīng)科學基金會發(fā)起，將每年的 3 月 21日定為世界睡眠日，以提起人們對睡眠不足問題的重視。 迄今為止，對睡眠的研究已得到許多重要結果，但對于睡眠缺失的機 制及其對生理、心理的影響尚有待深入研究。睡眠剝奪 (指由于環(huán)境因素或自身原因無法滿足正常睡眠的情況 5。機體超過 24小時 內(nèi)睡眠時間短于 6小時即可以認定為是長時間的睡眠剝奪 6。睡眠剝奪在軍事、交通、醫(yī)療、心理以及特殊職業(yè)等多個領域均受到關注，相關研究也正在展開。 隨著研究技術的發(fā)展，采用多種手段對睡眠剝奪進行了研究。結果表明，睡眠剝奪可以引起認知能力、情緒、內(nèi)分泌、心血管系統(tǒng)以及免疫功能等一系列改變 5。伴隨疲勞程度的增加，可能產(chǎn)生很嚴重的健康問題。下面就 此問題做一總結。 第一，睡眠剝奪會影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常功能。 睡眠剝奪可以使學習和認知能力降低。張媛等篩查選取睡眠習慣良好（睡眠 特別早醒或特別晚醒者，無其他不良嗜好）、雙眼矯正視力良好（可以進行正常字母掃描）的大學生受試者 7。將其分為正常組、 和 組受試者均為早上 7點起床，之后進行正常生活但是不進行劇烈運動（以保持體力）。第一組（對照組）受試者被要求于當日 23： 00睡覺，第二組 (小時 )受試者被要求于次日凌晨 2： 00睡覺，第三組 (被要求于次日 凌晨 3：00睡覺。在睡眠剝奪期間，受試者可以進行娛樂活動或其他不消耗體力的行為以使蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 2 自己不進入睡眠。所有受試者都在次日 7： 30起床。之后進行注意力轉移水平測驗。結果表明：睡眠剝奪后，第二組 (小時 )和第三組 (的注意力轉移水平均有明顯下降。洪軍等的研究也發(fā)現(xiàn)，受試者在長時間的睡眠剝奪后，對圖形和數(shù)字的敏感性和識別能力下降 8。 解釋稱這種結果是由于睡眠剝奪限制了眼球快速轉動的能力所致 9。江帆等在各自的實驗中也有類似發(fā)現(xiàn)10，睡眠剝奪可以使學習和認知 能力降低。 睡眠剝奪引起認知功能的下降，發(fā)生的機制主要有三種假說。第一， 脫漏假說 ”，他認為隨著睡眠剝奪時間的延長，困倦增加，出現(xiàn) “正常反應過程中的不反應 ”現(xiàn)象，即原本可以有所反應的神經(jīng)行為無法進行下去 13。第二， “喚醒水平下降假說 ”。他認為長時間的覺醒會導致 “喚醒閾 ”上升，即完成 某種認知作業(yè)所需要的 “腦力要求 ”變高，導致腦力資源相對降低。當腦力資源無法滿足某些任務的要求時，就會出現(xiàn)工作成績的下降。起初，個體尚可以通過降低速度來保證準確率，因此出 現(xiàn)了反應時間延長而正確率保持不變的結果。如果進一步延長睡眠剝奪的時間，個體即使在延長反應時間后仍不能滿足需要時，就會出現(xiàn)正確率下降 14。第三， 濾除無關刺激困難假說 ”，指出被試者在疲勞狀態(tài)下 ,完成作業(yè)的能力下降是由于隨著作業(yè)時間延長，不能夠濾除掉無關刺激信息。無論外部的還是內(nèi)部的無關信息都能夠進入被試者的注意范圍，容易受到內(nèi)部表象或外部刺激的干擾，不能將注意力集中在正在進行的工作上 15。簡而言之，就是因為注意力降低而無法完成任務。 除了影響學習和認知能力，睡眠剝奪對情緒、感 官能力、腦電生理活動也有明顯影響。 著睡眠剝奪時間的延長，焦慮狀態(tài)和抑郁狀態(tài)的評分均呈進行性增加；而積極情緒狀態(tài)分值則呈進行性下降 16洪軍發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 52小時 后的受試著，情緒逐漸惡化，時而抑郁。時而煩躁，積極情緒下降明顯。睡眠剝奪還可以影響腦的電生理活動，而且對不同腦區(qū)的影響不一樣 19。據(jù)相關報道，睡眠剝奪對額葉前區(qū)的影響較大，左半球比右半球受影響大 20。額葉的作用主要與工作記憶、保持注意力、計劃、行為控制等認知功能有關 5。 將意識水平從低到高分為不同層次 21。額葉前區(qū)處于執(zhí)行功能的最高層次，作為意識加工的核心，它接受各個層次的信息輸入和監(jiān)控信息輸出。根據(jù)他的假設，睡眠剝奪導致大腦工作水平降低是整體性的，首先導致腦干的喚醒水平降低：隨著睡眠剝奪時間的延長，再導致認知過程中前額葉的意識加工能力降低 5,21。 第二，睡眠剝奪可以使機體內(nèi)分泌紊亂。 睡眠剝奪可以影響體內(nèi)激素的正常分泌，從而影響到機體各組織的正常功能。 睡眠剝奪后，皮質醇水平的會異常升高 22。皮質醇在機體應激反應中起著非常重要的作用 23機體在受 到外界刺激時，體內(nèi)產(chǎn)生的一系列反應，首先，下丘腦 腎上腺使得糖皮質激素的分泌增多，隨后機體的血壓、呼吸、心率、代謝等蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 3 均產(chǎn)生相應變化，使機體抵御外界刺激的能力增強。 5等也證明對大鼠睡眠剝奪后測定血清皮質醇水平，證實睡眠剝奪 24 小時 、 72 小時 、 120 小時 皮質醇均高于正常對照組，可見睡眠剝奪使大鼠機體處于強烈的應激狀態(tài)。許耘紅等研究發(fā)現(xiàn)，隨著 間的延長，睡眠剝奪可以引起促腎上腺皮質激素（ 皮質醇（ 紊亂 26。 腺垂體分泌的一種激素，其最主要的生 理作用是促進腎上腺皮質的生長和刺激類固醇生成。 由腎上腺分泌的應激激素，對糖代謝具有強烈調控作用，因而也被稱為糖皮質激素。 的終末產(chǎn)物，對機體的糖、脂肪和蛋白質的代謝有重要影響，因此作為研究應激的最重要指標。為這是因為在應激狀態(tài)下，機體出現(xiàn)垂體 而引起 度反應性升高，這時機體出現(xiàn)保護防御性的快速動員并處于最佳狀態(tài) 27。但隨著 間的延長，持續(xù)強烈的有害刺激將耗竭機體的抵抗能力，就會導致某些神經(jīng)內(nèi)分泌器官的損傷及功能低下（如 腎上腺皮質功能減退），使得量變化的趨勢出現(xiàn)從原來的升高，到后來的下降的波動性變化趨勢，并可能由此引發(fā)應激紊亂，出現(xiàn)應激相關的疾病、器官功能衰退 28肖雁等31提出，睡眠剝奪可導致唾液中的褪黑素水平增多。褪黑素是又名黑素細胞凝集素，俗稱為 “腦白金 ”，存在于從低等生物到人類的眾多生物中的一種胺類激素，主要由松果體 產(chǎn)生。褪黑素具有明顯的改善睡眠作用 。在睡眠剝奪的實驗中，褪黑素的水平出現(xiàn)應激性增高。 第三，睡眠剝奪影響心血管系統(tǒng)的正常功能。 睡眠剝奪的研究多集中于神經(jīng)系統(tǒng)方面，現(xiàn)在有越來越多的證據(jù)表明，睡眠不足與心血管系統(tǒng)相關疾病關系密切。 32。流行病學調查結果顯示長期睡眠不足與冠心病發(fā)病相關，每日睡眠分別為 5、 6、 7小時 的人群，其冠心病發(fā)病的相對危險度分別為 2。日本學者對超時工作、睡眠不足與非致命性心肌梗死形成的關系進行了調查，結果顯示每天睡 眠低于 5小時 和經(jīng)常性的睡眠缺乏 (每周 2小時 )的人患急性心肌梗死危險性增加 2 3倍 6。 現(xiàn)異相睡眠剝奪后大鼠甘油三酯和極低密度脂蛋白濃度降低，總膽固醇和高密度脂蛋白升高 33。相睡眠剝奪后大鼠甘油三酯水平和極低密度脂蛋白明顯降低，低密度脂蛋白、高密度脂蛋白明顯升高。說明睡眠剝奪對心血管系統(tǒng)生理機能有影響 34。 柴慧娟用大鼠為實驗材料，對其進行完全睡眠剝奪。研究發(fā)現(xiàn)，大鼠睡眠剝奪后心率加快，心臟傳導異常；且隨著睡眠剝奪時間越長，上述改變越嚴重。心肌的組織形態(tài)學結果顯示，心肌間質血管擴張、單核細胞浸潤，心肌細胞的供能系統(tǒng)線粒體結構模糊，局部閏盤結構崩解 35 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 4 第四，還有報道稱，睡眠剝奪后，影響免疫功能、血糖代謝、腎臟功能等。 有研究發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪后，脾細胞分泌的抗體明顯減少，脾臟和胸腺的重量均有所下降 8?？讘c勝選取 48 名某醫(yī)院臨床醫(yī)師作為研究對象，在受試者連續(xù)正常上班3d 后，再連續(xù)值班 24 小時，期間沒有 睡眠行為。試驗結束后靜脈采血，檢測血細胞的數(shù)量和比例、 T 細胞亞群的細胞周期、脾淋巴細胞的細胞周期結果。結果顯示，睡眠剝奪組的白細胞、淋巴細胞、中性粒細胞數(shù)量、以及 T 細胞數(shù)量均明顯減少，且具有顯著性差異 37。這說明睡眠剝奪可以一定程度影響體內(nèi)免疫功能。章茜等也發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪還可以使 胞活性降低，遲發(fā)性變態(tài)反應降低， T 細胞功能減退等 38 綜上所述，長時間的睡眠不足，會引起機體狀態(tài)發(fā)生一系列改變，進而產(chǎn)生諸多健康問題。一般而言，成年人每天需要保證睡 7小時的睡眠。而未成年人每天應睡 8 小時以上 。 常狀態(tài)下體內(nèi)保持氧化平衡 氧化本身是生命體內(nèi)的一項基本活動，細胞都是通過氧化來產(chǎn)生所需的能量。但是在產(chǎn)生能量的同時也會產(chǎn)生自由基，自由基含量過多就會造成機體的氧化應激損傷。正常狀態(tài)下，機體內(nèi)的氧化和抗氧化處于動態(tài)平衡中。但是在特殊條件下（譬如長時間的睡眠剝奪），平衡就會被打破，機體就會產(chǎn)生不利損傷。 體內(nèi)較為常見的自由基主要有以下幾種：超氧陰離子自由基 ( 羥基自由基 (、烷氧基自由基（ 等。這些物質都是由于氧氣在體內(nèi)失去電子后 才產(chǎn)生。他們都具備非?；顫姷幕瘜W特性，統(tǒng)稱為活性氧（ 其中，超氧陰離子自由基 ( 成最早 , 羥基自由基 (作用最強 , 連鎖反應循環(huán)最持久 40。 機體內(nèi)存在一套抗氧化的系統(tǒng)，可以清除過多的自由基，以維持體內(nèi)氧化的平衡。這套系統(tǒng)包括：如超氧化物歧化酶 ( 、谷胱甘肽過氧化物酶（ 、過氧化氫酶 (、維生素 C（ V C）、維生素 E（ V E） 等。 超氧化物歧化酶（ 泛分布于從原核生物到動物、植物和微生物 的各類生物體中。根據(jù)金屬輔基的不同可分成三類：第一是含銅、鋅的超氧化物歧化酶 (這也是最常見的 二類是含錳的超氧化物歧化酶 (存在于真核細胞線粒體中；第三是含鐵的超氧化物歧化酶，僅存在于原核細胞中。 存在于生物體內(nèi)的重要的抗氧化酶系 , 能有效地清除氧自由基 , 催化超氧化自由基分解成 而在過氧化氫酶的作用下分解成 以通過氧自由基的歧化反應從而使其清除，并且可以及時修復氧自由基對細胞造成的損傷，被稱為是體內(nèi)氧自由基的頭號殺手。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 5 谷 胱甘肽過氧化物酶（ 機體內(nèi)分布廣泛的過氧化物分解酶。硒是谷胱甘肽過氧化物酶的活性中心。谷胱甘肽由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸組成，在體內(nèi)既有氧化又有還原作用，分成氧化型和還原型兩種存在形式。其中還原型谷胱甘肽過氧化物酶在保護細胞膜的完整性上起著重要的作用。 過氧化氫酶 (又稱觸酶。其主要作用就是將過氧化氫（ 解成水（ 氧氣 (從而阻斷（ 成（ 過程。過氧化氫酶 (通常定位于細胞中的過氧化物酶體（ 正 常狀態(tài)下，體內(nèi)的過氧化氫酶水平很低。哺乳細胞中，主要還是有過氧化物還原酶（ 責清除過氧化氫。 維生素 C 可以防治壞血病，化學名稱為抗壞血酸（ 維生素 又稱生育酚（ 此外還是很重要的抗凝血劑。二者都是體內(nèi)重要的抗氧化劑。維生素 C 和維生素 E 發(fā)揮最佳功效的有效部位不同。維生素 C 可以溶解于水，故而在細胞液內(nèi)和血液內(nèi)都可以循環(huán)流動，維生素 E 可以溶于脂肪和有機溶劑，不溶于水。對于保護線粒體膜上的磷脂有重要作用。維生素C 是一種 強氧化劑，通過自身的氧化，使氧化型谷胱甘肽還原為還原型谷胱甘肽，從而發(fā)揮抗氧化作用。另外，維生素 C 還可以使雙硫鍵（ 原為（ （ 一些酶類保持活性的必須基團。維生素 C 由此通過提高相關酶的活性而發(fā)揮抗氧化作用。維生素 E 除了自身有著很強的抗氧化能力外，還可以防止其他抗氧化劑如硒（ 維生素 A 和維生素 C 的氧化。由此可見，體內(nèi)各種維生素共同作用，才可以為全身構建起完善的保護體系。 以上這些抗氧化劑通過抑制過氧自由基、脂質過氧化和細胞膜上不飽和脂肪酸（ 氧化變性 ,從而維持細胞結構 與功能的完整性 , 預防和治療相關疾病 40。 以上都是體內(nèi)主要的自由基和抗自由基氧化的抗氧化劑，兩類物質此消彼長，相互制約，保持動態(tài)平衡。 睡眠剝奪屬于強應激源之一， 可以對身體健康機體造成多方面危害；氧化損傷就是最重要的一方面。 氧化損傷的主要后果是產(chǎn)生脂質過氧化。脂質過氧化就是活性氧（ 化細胞膜上的不飽和脂肪酸（ 反應。不飽和脂肪酸（ 生物膜的基本組成成分。由于 學性質不穩(wěn)定，其極易被活性氧（ 化。當 化損傷時，鑲嵌于細胞內(nèi)外膜系統(tǒng)的諸多酶類的空間構型結構被改變 , 以至酶內(nèi)的孔隙空間擴大、通透性增加。 進而使各種細胞器膜如內(nèi)質網(wǎng)膜、線粒體膜、等膜系統(tǒng)的流體鑲嵌結構也發(fā)生相應變化，最終導致整個膜系統(tǒng)的損傷和病變?；钚匝酰?僅可以造成生物膜結構的損傷，還可以對其他大分子造成多種損傷。例如造成 斷裂 40蛋白 蛋白之間的異常交聯(lián) 42、蛋白 間的蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 6 異常交聯(lián)等 43脂質過氧化造成的損傷與多種慢性疾病密切相關。例如衰老 45、腫瘤 46、心血管疾病、阿爾茨海默癥和 帕金森病等。 睡眠剝奪引起的氧化應激可以發(fā)生于多種組織。已經(jīng)有一些研究發(fā)現(xiàn)，不同程度的睡眠剝奪，可以引起實驗動物血液、心、腦等多個組織的氧化應激水平的提高。 第一 睡眠剝奪可以引起腦組織的氧化應激。 人對大鼠進行了 5 至 11 天的睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)腦干和海馬的 47。熊雅婷等在實驗中發(fā)現(xiàn)：睡眠剝奪 24 小時 后， 性沒有顯著變化， 量有所降低；睡眠剝奪 48 小時 后， 含量均增加明顯。同時出現(xiàn)死亡例數(shù)。作者認為， 量增多是由于腦內(nèi)脂質過氧化程 度加深； 量增多則是因為腦組織內(nèi)抗氧化體系因為自由基過多而產(chǎn)生的應對結果，是腦組織對自身的保護作用 48。吳興曲對睡眠剝奪后的大鼠額葉、海馬、中腦及下丘腦的 性進行了測定，發(fā)現(xiàn)睡眠剝奪 72 小時 后，大鼠各個腦區(qū)的性均出現(xiàn)增高；睡眠剝奪 120 小時 后，大鼠中腦和下丘腦的 性增高明顯，額葉及海馬則出現(xiàn)下降 49。吳興曲還對全腦進行了氧化指標的檢測，在其研究中發(fā)現(xiàn)，全腦組織的 性在睡眠剝奪 1d 和 3d 時都升高，至 5d 時則出現(xiàn)下降趨勢，達到正常對照組的水平 50。以上實驗都證實，睡眠 剝奪可以引起腦的某些區(qū)域氧化應激，但是為何選擇性地引起不同腦區(qū)抗氧化能力的下降，仍然沒有合理的解釋。雖然機制仍然不明了，但是各方面實驗都顯示：睡眠剝奪可以使腦損傷，進而引起學習記憶，情緒等高級神經(jīng)活動 51。 王新興改良多平臺水環(huán)境（ 立模型發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 3d 的大鼠血漿中神經(jīng)元特異性烯醇化酶（ 水平高于對照組；睡眠剝奪 5d 的大鼠血漿乳酸脫氫酶（ 性也高于對照組；對大鼠海馬組織的 色顯示，睡眠剝奪 3場試驗用于測試實驗動物的自主行為和探索能力 ，結果顯示睡眠剝奪 5d 和 7d 的大鼠探究能力下降 52。張?？档鹊膶嶒灠l(fā)現(xiàn) 4 對工作記憶不造成明顯損傷 53。王螈等比較同一只大鼠實驗前后結果的不同，發(fā)現(xiàn) 1d 至 3d 的睡眠剝奪，對認知能力的損傷明顯 54。 對人的實驗發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 1d 和 2d 的受試者，其需要集中注意力和快速反應的能力（例如用視覺觀察方面的能力）受損傷明顯 55。 第二 睡眠剝奪可以引起心肌的氧化應激。 張亞晶等對大鼠分別進行 24 小時 、 72 小時 、 120 小時 和 168 小時 的睡眠剝奪 試驗后，取心肌組織檢測各種氧化指標。結果顯示：從第 1d 開始，大鼠心肌組織 示心肌組織的脂質過氧化程度開始加深； 量從第3d 起逐漸升高，表明心肌的代償能力在此時還足以抵御睡眠剝奪產(chǎn)生的氧化應激；量則在第 1d 時增加，從第 3d 起則不斷下降。這說明隨著剝奪時間的延長。心肌的代償能力已不足以補充自由基引起的 性下降 56。柴慧娟的結果基本蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 7 類似，還在電鏡下觀察到星級各部位以及間質中都出現(xiàn)不同程度的脂質過氧化。特別是在心肌間質血管的內(nèi)皮細胞中也發(fā)現(xiàn)了由脂質過氧化引起的損傷 。這種損傷使血小板積聚，引起官腔變窄，使形成血栓的可能性增加。這證實了睡眠不足可以增加因心肌缺血缺氧而造成心力衰竭的可能 35方舟等發(fā)現(xiàn)用 法，進行三天實驗后，大鼠的心肌 量逐漸升高， 3d 和 5d 增加明顯； 性則先升后降：在第 1d 升高，第 3d 降為與正常組相當?shù)乃街?，?5 天則繼續(xù)下降，且與正常組相比差異明顯 41。 第三 睡眠剝奪可以引起血液組織的氧化應激。徐孝平發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 3d 的大鼠血清 性明顯降低， 量顯著升高 57。唐慶娟等采用轉盤水平臺睡眠剝奪方法，對 大鼠進行了 2d 和 4d 的睡眠剝奪，發(fā)現(xiàn)大鼠血漿 量在 2d 和4d 時依次增高，差異顯著；血漿 性在 2d 和 4d 時均無顯著性變化。作者認為睡眠剝奪限制在 48h,對大鼠機體的氧化損傷比較小 58 第四 睡眠剝奪可以引起其他組織的氧化應激。 睡眠剝奪的損傷主要發(fā)生于腦組織和相關神經(jīng)行為，其次為心血管系統(tǒng)，也有報道顯示睡眠剝奪可以影響其他組織，例如肝臟。 在實驗中發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 5d 至 10d 時，大鼠肝臟的谷胱甘肽水平，較正常對照組下降 30%以上。肺組織也有類似的發(fā)現(xiàn) 60。 睡眠剝奪可以誘發(fā)機體的氧化應激。江波等總結出三種主要機制 61： 第一 能量代謝及自由基產(chǎn)量的增加 睡眠剝奪后，由于能量代謝的增加，導致自由基的增加，造成氧化應激。 0 天后的大鼠，其體重較實驗前下降超過 10%。但是在此期間的進食量卻增加 70%以上 62。 有類似發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 20 天的大鼠，體重較實驗前減少 11%，攝食量增加 120%63。 食欲的增加是因為控制食欲的激素活性被改變。體內(nèi)與食欲相關的激素有兩種：瘦素（ 食欲素 (前者可以降低食欲，后者可以促進食欲。從睡眠剝奪后的實驗動物發(fā)現(xiàn)，血漿中抑制食欲的瘦素減少，促進食欲的食欲素增加，綜合結果就是攝食量的增加 64 有學者認為，線粒體是細胞內(nèi)自由基的源泉。體內(nèi) 95%以上的自由基都是來自于線粒體的呼吸鏈。在呼吸鏈產(chǎn)生能量的同時，電子傳遞中的單電子漏給分子氧或過氧化氫，后者就變成不穩(wěn)定的活性氧（ 。必然使線粒體中活性氧（ 加。由此可見，睡眠剝奪使得能量的消耗大為增加，動物只有通過增加攝食量來滿足機體的能量需要。但是伴隨著能 量的大量產(chǎn)生，活性氧（ 大量積累，積累到一定程度，氧化平衡就被打破了。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 8 第二 機體抗氧化防御系統(tǒng)能力降低 實驗顯示，睡眠剝奪可以一定程度抑制體內(nèi)抗氧化酶的活性，而使機體的抗氧化能力減弱，具體說就是引起抗氧化酶活性的降低，從而加劇氧化應激。許多實驗表明：在氧化應激中，過量的氧自由基（ 以抑制 抗氧化酶的活性。 發(fā)現(xiàn)大鼠睡眠剝奪 96 小時 后，下丘腦谷胱甘肽水平較正常組相比，下降 31%66。 對大鼠睡眠剝奪 5 至 11 天后，發(fā)現(xiàn)大鼠海馬和腦干的 活性有所下降 67。 現(xiàn)剝奪大鼠睡眠 5d 后，肝臟內(nèi)的谷胱甘肽（ 平比正常組下降 30%，過氧化氫酶活性下降 23%。繼續(xù)剝奪到10d 時，肝臟的谷胱甘肽水平比正常組下降 30%，而過氧化氫酶活性繼續(xù)下降，達到 36%68。國內(nèi)研究也基本類似。唐慶娟等用大鼠睡眠剝奪 72 小時 后發(fā)現(xiàn)，谷胱甘肽過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶的活性均有所降低。以上實驗結果可以說明睡眠剝奪可以使機體的抗氧化能力降低 69。 第三 睡眠剝奪引起內(nèi)質網(wǎng)應激，后者再激活氧化應激。 內(nèi)質網(wǎng)是合成蛋白質和脂質的主要場所 ，細胞內(nèi)幾乎全部的脂類和多種重要蛋白都于此處合成，此外，蛋白質的折疊、安裝也在此處進行 70。在大鼠的研究中發(fā)現(xiàn)，睡眠剝奪 6 小時 后，內(nèi)質網(wǎng)上 白的表達量有所增加，并且隨著時間的延長而繼續(xù)增多 71。 發(fā)現(xiàn)長時間的睡眠剝奪可以引起內(nèi)質網(wǎng)的功能紊亂，使 白的表達量先上升，再下降。 葡萄糖調控蛋白，又稱分子伴侶，可以恢復蛋白質的正確構象，對細胞具有一定的保護作用 72。在內(nèi)質網(wǎng)遇到應激時，達量會增加增加，故而可以其作為內(nèi)質網(wǎng)應激的標記物質 73。在上述實驗中可 以看到，睡眠剝奪可以引起內(nèi)質網(wǎng)的應激反應。 內(nèi)質網(wǎng)的應激進而可以激活氧化應激。細胞內(nèi)的自由基主要來自線粒體，但是實驗證實，內(nèi)質網(wǎng)也可以直接產(chǎn)生氧自由基（ 74。 用對氧自由基（ 感的熒光標記技術，研究發(fā)現(xiàn)：內(nèi)質網(wǎng)持續(xù)應激伴隨著細胞內(nèi)氧自由基（ 劇烈增多 75。 認為內(nèi)質網(wǎng)氧化應激過量可以引起哺乳動物細胞的氧化應激 76。 在動物界，尤其是在高等動物中，性別差異的現(xiàn)象比比皆是。雌雄個體在外部形態(tài)及生理功能之間都存在 一定的差異。在睡眠方面也是如此。譬如，一直以來，有大量研究發(fā)現(xiàn)，女性相對于男性更加容易失眠 77人們都非常好奇為何如此。但是至今也沒有令人信服的解釋。此外，一些睡眠研究者（例如 出，睡眠模式的性別差異或許有助于解釋更加重要的問題。例如為何女性通常比男性更加健康長壽。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 9 隨著生活水平的提高，人們對包括睡眠在內(nèi)的健康問題越來越重視，性別差異對睡眠的影響逐漸引起科研工作者的關心。相對于其他的熱門課題，睡眠之性別差異的相關研究仍然非常有限，但是已經(jīng)有一些研究表明：在人類中，男 女兩性的平均睡眠時間、睡眠質量、入睡時間快慢、睡眠節(jié)律等的確不同?？傮w而言，女性的晝夜周期更短 89，平均睡眠時間更長 90，入睡更快 91、深度睡眠更多 92。以下就對相關研究內(nèi)容做一總結。 性的生物節(jié)律比男性短 生物節(jié)律就是以某個時間長度為單位，出現(xiàn)的周期性、規(guī)律性變化，包括日節(jié)律、月節(jié)律和年節(jié)律。這里的生物節(jié)律指的是近似于 24 小時的周期變化 ，對應于英文的 “簡而言之即睡眠活動以及覺醒活動的周期循環(huán)。絕大多數(shù)人類的生物節(jié)律，都不會完全一致于天文概 念的 “一天 ”。大約在 24 小時 左右浮動，或略大于或略小于 24 小時 。 其他哺乳動物的節(jié)律狀況與此類似。 157名調查對象（其中有 105 名男性， 52 名女性，年齡跨度從 18 歲至 74 歲）進行了為期一個月的研究。他們用體溫和褪黑素水平來確定生物節(jié)律的時間長短。在美國召開的美國睡眠醫(yī)學學會上公布研究結果稱，女性的生物節(jié)律明顯比男性短。女性的生物節(jié)律為 時 （即 24 小時 5 分鐘），上下變化幅度為 12性的生物節(jié)律為 時 （即 24 小時 11 分鐘），上下變化幅度同樣為 12果顯 示，男性和女性的生物節(jié)律有所不同，女性的節(jié)律周期比男性短 6然只有短短 6分鐘的差異，但是研究者認為，在漫長的一生中，這種微小的差異會日復一日的積累起來，最終在生命后期引起很大的不同。另外，在一些以動物為對象的實驗中也有類似發(fā)現(xiàn)，即雌性的生物節(jié)律短于雄性動物 93 性的睡眠習慣與男性不同 節(jié)律周期超過 24 小時的人群，往往會選擇每天晚睡晚起，而節(jié)律周期不到 24小時的人群，往往更愿意每天早睡早起。具體原因還不得而知。同樣在 物節(jié)律短于 24 小時的 女性比生物節(jié)律短于 24 小時的男性要明顯多。相對于男性而言，女性在晚上睡得更早，早晨醒來的也更早。女性更愿意將自己看成夜鶯型人士（ 2005 年，全美睡眠基金會 (行過的一次全美范圍的睡眠調查。調查對象總共涉及 1506 人。調查結論顯示，總體而言女性的睡眠時間比男性更長。大約 30%的女性在工作日的睡眠超過 8 小時 ，只有 22%的男性稱自己的睡眠時長超過 8 小時 （這個結論與上述 研究結果并不矛盾。 出睡眠連同覺醒的周期時長較短，而此研究則僅僅說明睡眠時間較長）。此次調查同時顯示女性入睡也較男性快。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 10 同樣在 2005 年的一項研究得出類似結論。這項研究的調查對象全部是健康年輕人。包括 15 位女性和 16 位男性。主要是針對健康年輕人的睡眠狀況展開研究。研究者對 31 位研究對象連續(xù)進行了 3 個晚上的跟蹤調查。結果顯示，年輕女性每晚的平均睡眠時長達到 7 小時 43 分鐘，男性的平均睡眠時長達到 7 小時 24 分鐘。女性比男性長 19 分鐘。同時，研究顯示女性入睡平均需要 9 分鐘 ，而男性需要 23 分鐘，女性比男性短 14 分鐘。 有研究者稱，男性夜晚醒來的次數(shù)比女性更多。但是確切的原因尚不得而知。只是有一些證據(jù)顯示：這種現(xiàn)象與男性罹患阻塞性睡眠窒息癥的可能性較大密切相關。 性對缺少睡眠的耐受能力、抗睡眠干擾的能力均比男性強。 最近的研究顯示，女性比男性更能夠忍受缺覺的影響，可能是因為她們的深度睡眠時間更長。美國睡眠醫(yī)學學會年會上曾宣讀過一項研究報告，這項研究的研究對象包括 16 位男性和 18 位女性，模擬了人們在平時工作日睡眠不足，在周末進行補覺的做法。研究結果顯示，在連續(xù) 5 夜只有 6 個小時睡眠后，男性和女性在電腦上完成一項測量其反應時間和速度的任務時，其表現(xiàn)均不如前。但是，女性分數(shù)下降的幅度沒有男性那么大；而且在兩個晚上的 8 小時充足睡眠后，女性恢復的程度要好于男性。該研究報告作者 ， “我認為我們的數(shù)據(jù)顯示，女性應付缺覺的能力比男性強。 ” 2對 66 名年輕志愿者進行了睡眠干擾的實驗，這些受試者在平時的睡眠情況都十分正常良好。他們在實驗室中度過一個晚上；在這個晚上受試者的睡眠受到外界因素不同程度 的打擾（打擾次數(shù)從 2不等）。接著進行檢測。檢測方法是從靜脈導管中（ an 續(xù)監(jiān)測、采取血樣（ ，結果發(fā)現(xiàn)女性相應指標的變化較男性少，說明女性抗外界干擾的能力比男性強。作者考慮是否由于年輕女性在實驗室環(huán)境中，免于操持家務和育嬰的打擾，但隨后否定了這種解釋。因為其發(fā)現(xiàn)沒有育嬰責任、年紀較大的女性，其睡眠質量和抗干擾能力也比相對應男性好。作者將這種現(xiàn)象的解釋與深度睡眠聯(lián)系起來。實驗發(fā)現(xiàn)：睡眠受到 限制的女性，其淺睡期（一期睡眠， 短，而其深睡期（慢波睡眠三、四期和異相睡眠）相對較長。這說明其睡眠的效率可能更高。 眾所周知，正常的睡眠由兩個時相組成，一個是慢波睡眠，另一個是異相睡眠。慢波睡眠又分為 4 個不同的期：由一期至四期，伴隨著睡眠由淺入深的過程。在這個過程中，意識逐步喪失、血壓降低、心率和呼吸減慢、體溫下降、尿量減少等。一般認為，第一、二期代表淺睡，第三、四期代表深睡（第三期時間較短，以第四期為主）。第四期具有消除疲勞的作用，因為在早期的試驗中證實，長時間睡眠剝奪后，在 恢復蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 11 睡眠中，第四期持續(xù)時間最久。異相睡眠是睡眠周期中出現(xiàn)的一種活躍狀態(tài)。在此時相，雖然機體仍然處于睡眠狀態(tài)，但是自主神經(jīng)活動增強，如心率和呼吸增強、血壓增高、腦內(nèi)血流和耗氧量增加。腦電圖呈現(xiàn)類似于清醒狀態(tài)的快頻低壓電波。夢境主要發(fā)生于這個時相。兩個時相中眼球的運動方式有所不同，在異相睡眠中，眼球快速運動，故又稱為快速眼動睡眠 (慢波睡眠中無此現(xiàn)象，稱為非快速眼動睡眠（ 在完整的睡眠中，慢波睡眠和異相睡眠 交替出現(xiàn)。首先進入慢波相，隨后進入異相睡眠。接著再開始慢波相，隨后轉入下一個異相睡眠。如此周而復始的進行。在正常成年人的完整睡眠中，一般會經(jīng)歷這樣 4 至 6 次轉換。而且慢波時相的時長會逐漸縮短，并以淺睡的第二期為主。簡而言之，睡眠周期包含慢波睡眠的 4 個階段以及較為活躍的異相睡眠。完整的睡眠中，這一周期交替往復。并且慢波睡眠的持續(xù)時間逐漸減少，異相睡眠長度不斷延長。 睡眠受到干擾和限制的女性，慢波睡眠（ 異相睡眠（ 對較長，說明其睡眠的效率可能更高。這或許是睡眠抗干擾能力強于男性的原因之一。 在知 覺學習方面，男性需要打個盹，而女性則不需要。這是否可以在一定程度說明：男性比女性更需要睡眠；反而言之，女性比男性更能適應睡眠缺乏？不過睡眠醫(yī)學學會年會上宣讀的另一項研究成果就傾向于這種解釋。 睡眠對于男性和女性而言，都有助于鞏固學習成果，比如幫助大學生們備考。要吸收某些類別的知識（也就是人們常說的知覺學習），男性需要打個盹，而女性則沒有這個需要。在 研究中， 126 位實驗對象要完成一項任務，即在屏幕上辨別一些運動圓點的不同。之后進行測試 ，以便檢驗他們學會了多少。研究人員發(fā)現(xiàn)，男性只有在小睡之后才能掌握，而女性無論是否睡過都能掌握。作者得出她的結論 “這可能使得女性更適合完成那些需要持續(xù)感知能力的任務，更勝任諸如航天管理員、或是要看磁共振圖像的放射科醫(yī)師的工作。 ” 綜上所述， 女性比男性的睡眠時間長，睡眠質量相對好（一期時長比重短， 抗外界干擾的能力也比男性強。女性 似乎擁有比男性更高效的睡眠能力。有些科學家提出，正是由于這種能力使得女性比男性的壽命更長，生命質量也更加健康。 何數(shù)據(jù)顯 示女性對睡眠的抱怨要多于男性？ 上述實驗的結果都顯示，女性比男性的睡眠能力強。但是于此相矛盾之處在于：在大量研究中，女性更傾向于對自己的睡眠感到不滿，抱怨自己難以入睡、無法獲得足夠的睡眠、或者難以保持理想的睡眠狀態(tài)。對于這種研究結果，研究人員表示暫時并不清楚為何 女性對睡眠的抱怨遠多于男性。 有可能是因為女性承擔更多的育嬰和照顧孩童的責任，無法連貫的睡眠；加上一些生理變化，比如懷孕和絕經(jīng)，都蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 12 有可能對女性睡眠產(chǎn)生影響。女性的抱怨可能來源于此?？傊?，對于這個問題的解釋非常模糊。 但是其他數(shù)據(jù)則比較清楚地顯示，女性存 在著睡眠障礙， 例如失眠問題。有大量實驗證實， 女性的失眠狀況明顯高于男性，甚至于到達 50%之多 77 解釋說：這或許由于失眠這種行為與情緒強烈相關。女性多愁善感，很容易產(chǎn)生焦慮和沮喪等負面情緒，故而產(chǎn)生失眠 92,95同時，一些研究結果顯示：女性和男性出現(xiàn)失眠數(shù)量的比例為 性和男性出現(xiàn)消極情緒的比例為 2:196,98,100兩相比較，反倒暗示女性有一種睡眠保護機制或者稱為睡眠平衡機制 （ ，可以保護自身免于因為沮喪焦 慮等不良情緒而影響到睡眠。 綜上所述，兩性在睡眠的各個方面都存在著很多差異。既然兩性的睡眠有如此多的不同，那么在抵抗睡眠剝奪的能力方面是否同樣存在差異，就是個值得討論的問題。本實驗就雌雄小鼠在睡眠剝奪后的行為表現(xiàn)、死亡率和氧化應激等結果進行探討，以期為進一步的研究提供基礎性資料。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 13 第二章 材料 與 方法 選取相同年齡（三月齡）的雄性和雌性 鼠，所有小鼠均已體成熟，雄性體重 38性體重 32月齡的小鼠，其身體發(fā)育已經(jīng)完全成熟。所有鼠都采購自蘭州大學動物實 驗中心。建立模型前，先將所有小鼠適應性籠養(yǎng) 1w。 小鼠天性怕水，進入水中會出現(xiàn)慌張，但是一般情況下都可以找到救生平臺并爬上平臺。個別小鼠進入水環(huán)境中，反應過于強烈，不停游泳，即使從平臺旁邊經(jīng)過也不上去，直至精疲力竭，溺水而死。由于鼠與鼠之間存在比較明顯的個體差異，所以為避免實驗誤差，在正式實驗前進行訓練和選鼠非常必要。正式實驗前（分組前）三天，所有小鼠每天進行落水后爬上平臺的適應學習 1 小時 。無法快速爬上平臺的小鼠（從落水到爬上平臺的時間超過 5s）則不進入實驗分組，直接剔除。最終保證所有進入實驗的小鼠，都具備 落水后快速爬上平臺的能力（體力充足的情況下），避免因為不會上平臺而溺亡的意外發(fā)生。 本實驗采用改良的多平臺睡眠剝奪法（ 立實驗模型 102試驗箱為 70 45 40 塑料水箱，其內(nèi)放置 12 個直徑 的平臺，各個平臺之間的間距在 10 以上，平臺周圍注滿水，水溫均保持 22，水面低于平臺約 。小鼠在平臺上可以自由進食和飲水，也可以在平臺之間自由活動。清醒時，小鼠可以靜臥于平臺之上，但如果發(fā)生睡眠，小鼠會因為肌肉的張力松弛而頭部觸水或者身體完全落入水中 而驚醒，通過這種方法使小鼠無法進入正常的睡眠狀態(tài)。相關文獻報道，在這種水上平臺實驗條件下，動物的腦電圖中幾乎沒有慢波睡眠和異相睡眠，意味著動物無法進入深度睡眠狀態(tài) 104。多平臺睡眠剝奪法（ 由單平臺睡眠剝奪法（ 進而來，其優(yōu)點還在于：既避免了個體動物與群體隔離而產(chǎn)生孤獨和恐懼，又使其活動范圍增加。多平臺睡眠剝奪法（ 現(xiàn)今睡眠剝奪實驗的主要方法 105 選取適應學習合格的雌雄小鼠各 36 只，隨機分為雄性實驗組（ n=18)、雄性空白對照組（ n=18)、 雌性實驗組（ n=18)和雌性空白對照組（ n=18)。所有小鼠都進行了相同的適應學習，且都已經(jīng)具備快速爬上平臺的自救能力。無論雄性還是雌性小蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 14 鼠，都完全隨機分成實驗組和空白對照組，以滿足本實驗的前提假設 實驗組和對照組是同樣性質的小鼠群體。 雄性實驗組和雌性實驗組的小鼠進行睡眠剝奪試驗，每個水箱中放置 3 只小鼠，自由飲食進水（食物和水都放置于試驗箱頂面，小鼠抬頭即可獲?。?。每天定時換水，保持實驗箱內(nèi)環(huán)境衛(wèi)生。雄性空白對照組和雌性空白對照組的小鼠常規(guī)籠養(yǎng)，自由飲食進水，不進行睡眠剝奪實驗。所有小鼠的環(huán)境溫度均保持 為 22，光照周期為 08:0020:00。實驗持續(xù)時間為 72 小時 ，起止時間均為早晨 8： 00。 統(tǒng)計其落水頻次和各組的死亡率：在實驗過程中，觀察記錄小鼠的行為和精神狀態(tài)；每天在不同的時間段（實驗開始后第 4時 、第 10時 、第 28時 、第 34時 、第 52時 、第 58時 ）記錄每組小鼠的平均落水次數(shù)（平均落水次數(shù) =每組所有小鼠總的落水次數(shù) /存活只數(shù)）。每天 2 次，每次 2 小時 。全部試驗結束后，統(tǒng)計各組的死亡率。 檢測 所有動物于實驗 72 小時 后眼眶取血，用肝素抗凝后取血漿。之后剪頭剝腦。同時將小鼠身體仰臥固定，迅速開胸摘取心臟。心、腦組織加預冷的生理鹽水，漂洗干凈，濾紙拭干。取組織放入小燒杯中，倒入預冷的生理鹽水中，用眼科剪盡量剪碎組織，再用玻璃勻漿器充分勻漿，離心取上清液待用。血漿和組織勻漿都于 4暫時保存。檢測指標如下：超氧化物歧化酶（ 用黃嘌呤氧化酶法測定。脂質過氧化產(chǎn)物丙二醛（ 采用那種硫代巴比妥酸法檢測。所有試劑均采購自于南京建成生物工程研究所。所有操作嚴格按照其試劑盒的說明進行。 氧化應激的檢測數(shù)據(jù)采用 件進行描述性分析和 t 檢驗，試驗結果以平均數(shù) 標準差（ 錯誤 !未找到引用源。 s ）的形式表示。其中，直接用 t 檢驗分析雌性實驗組和雌性空白組數(shù)據(jù)的顯著性差異，以及雄性實驗組和雄性空白組的顯著性差異；由于不方便直接比較雌雄兩性實驗前后變化值的顯著性差異，故而先對兩對實驗數(shù)據(jù)進行處理，具體方法為：用雌雄實驗組的數(shù)據(jù)減去各自對照組的平均數(shù)，得出雌雄兩組實驗前后的變化值，再以兩組變化值進行顯著性檢驗。 蘭州大學碩士研究生學位論文 睡眠剝奪對不同性別小鼠氧化應激反應的研究 15 第三章 結果 鼠睡眠剝奪后的一般狀態(tài)觀察 雄性實 驗組和