【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）玉米黃早四基因組細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建生物化學(xué)與分子生物學(xué)碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 碩士學(xué)位論文 玉米黃早四基因組細(xì)菌人工染色體文庫的構(gòu)建 of i of i 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 摘要 2 摘 要 玉米是我國主要的糧食作物之一，隨著社會的發(fā)展和環(huán)境的變化，我國玉米生產(chǎn)受各種逆境脅迫如鹽堿、干旱、低溫、病蟲害的影響日趨嚴(yán)重，而我國目前現(xiàn)有大多數(shù)玉米品種對逆境脅迫適應(yīng)性不強(qiáng)。因此，培育新的具有優(yōu)良抗逆性的玉米品種尤為關(guān)鍵 . 目前我國傳統(tǒng)雜交育種進(jìn)展緩慢，鮮有優(yōu)良品種出現(xiàn)。而隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的飛速發(fā)展，基因工程輔助育種取得了傳統(tǒng)、常規(guī)育種難以達(dá)到的效果和效益，并且應(yīng)用日益廣泛。因此，利用基因工程手段，分離玉米抗逆相關(guān)基因，并轉(zhuǎn)化為優(yōu)良的抗逆品種是改善我國玉米育種與生產(chǎn)現(xiàn)狀的有效途徑。 黃早四是我國育種界公認(rèn)的最優(yōu)秀的中早熟玉米自交系，它具有配合力高、植株緊湊以及綜合農(nóng)藝性狀好的突出特點，因而被廣泛利用。黃早四的育種利用率最高，其改良系數(shù)目超過了國內(nèi)外任何一個自交系，用其組配的玉米雜交種數(shù)目和累計推廣面積超過了任何一個國內(nèi)育成及國外引進(jìn)的親本系。黃早四的選育成功對我國玉米育種和生產(chǎn)做出了巨大的貢獻(xiàn)。 本研究以優(yōu)良玉米自交系黃早四為材料構(gòu)建了基于其基因組的細(xì)菌人工染色體文庫。該文庫以單克隆形式保存，包含約 153,600 個克隆子。通過對隨機(jī)選取的 300 個 隆插入片段的分析表明：該文庫平均插入片段約 92組率 98%，空載率 2%。該文庫細(xì)胞器污染少，穩(wěn)定性好，覆蓋了玉米基因組的 。在此基礎(chǔ)上，本研究 將 隆制備成高密度膜， 采用抗逆相關(guān)的 探針 標(biāo)記對 高密度膜進(jìn)行菌落原位雜交的方法對 該文庫進(jìn)行了初步篩選， 初步 得到了 一些 陽性克 隆 ，這些結(jié)果有待于進(jìn)一步分析和研究 。 本研究 通過對重要玉米品種黃早四的 庫的構(gòu)建， 為我國主要玉米品種的基因組研究以及抗逆相關(guān)基因的分離搭建了一個技術(shù)平臺 ，并對抗逆基因的分離作了初步的探索。這對我國的玉米優(yōu)良品種的培育和玉米生產(chǎn)有著非常重要的意義。 關(guān)鍵詞 玉米， 黃早四 ， 細(xì)菌人工染色體文庫 ， 抗逆基因中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 is of in of of of is by as of in to So it is to of By in in By of t So it is an to to of i is as in It As a it i to We a in on of i is a 53,600 by 00 28% % is It .6 on we by of AC i, a of on we a is of 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 目錄 4 目 錄 摘 要 . 2 . 3 目 錄 . 4 英文縮略表 . 6 第一章 緒論 . 7 國玉米育種與生產(chǎn)的發(fā)展情況 . 7 國玉米育種生產(chǎn)概況及所面臨問題 . 7 物技術(shù)在玉米育種工作中的應(yīng)用 . 8 米優(yōu)良自交系黃早四 . 8 早四在玉米育種與生產(chǎn)中的重要地位 . 9 因工程方法分離基因 . 10 菌人工染色體文庫的研究進(jìn)展 . 11 片段基因組文庫的發(fā)展 . 11 庫的發(fā)展 . 13 庫的常用分析方法 . 16 庫的應(yīng)用 . 16 題意義及技術(shù)路線 . 19 題意義 . 19 術(shù)路線 . 20 第二章 材料與方法 . 21 驗材料 . 21 試材料 . 21 體與菌株 . 21 要實驗試劑及配制方法 . 22 驗儀器 . 28 驗方法 . 29 純度、高分子量細(xì)胞核 制備 . 29 片段 獲得 . 30 片段 載體的連接與轉(zhuǎn)化 . 32 大批量轉(zhuǎn)化、挑菌、存儲 . 33 庫的保存與復(fù)制 . 33 庫的檢測 . 34 插入片段的檢測 . 34 隆穩(wěn)定性的檢測 . 35 其它細(xì)胞器對 庫污染狀況的檢測 . 35 庫的雜交 檢測 . 37 交探針的制備 . 37 密度雜交膜的制備 . 38 密度膜菌落原位裂解 . 39 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 目錄 5 密度膜與探針的雜交 . 39 性克隆的鑒別 . 39 第三章 結(jié)果與分析 . 40 效 庫構(gòu)建技術(shù)體系的建立 . 40 米黃早四高質(zhì)量大片段 制備 . 40 分酶切用量的確定和大量酶切 . 40 片段 析袋回收后的濃度檢測 . 41 接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化 . 42 庫插入片段大小的檢測 . 43 定性檢測 . 43 測 否有細(xì)胞器污染 . 45 庫的雜交 檢測 . 46 交探針的制備 . 46 交探針與高密度膜的雜交 . 46 第四章 討論 . 47 庫的構(gòu)建 . 47 分子量 塊的制備 . 47 塊 酶切 . 47 切產(chǎn)物的回收 . 47 接及轉(zhuǎn)化 . 47 庫的保存 . 48 庫的鑒定 . 48 庫插入片段大小檢測 . 48 定性檢測 . 48 染的檢測 . 48 庫的覆蓋率 . 48 庫 的雜交 檢測 . 49 第五章 全文結(jié)論 . 50 米黃早四 庫的構(gòu)建 . 50 庫的雜交檢測 . 50 參考文獻(xiàn) . 51 致 謝 . 55 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 英文縮略表 6 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 菌人工染色體 血清白蛋白 蒸去離子水 甲基 甲 酰胺 氧核搪核苷三磷酸 硫蘇糖醇 EB 化乙錠 二胺四乙酸 HB 漿緩沖液 NA 分子量 丙基硫代 熔點 乙二醇 沖 電 場 凝膠 電泳 甲基磺酞氟 二烷基硫酸鈉 準(zhǔn)檸檬酸鹽溶液 43 吲哚 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 7 第一章 緒論 國玉米育種與生產(chǎn)的發(fā)展情況 國玉米育種生產(chǎn)概況及所面臨問題 我國是世界三大 “玉米帶 ”之一，玉米產(chǎn)量和消費(fèi)量都僅次于美國，居世界第二位。玉米是我國的第二大糧食作物。 1949 年我國玉米種植面積 為 1, 總產(chǎn)量為 1,噸，單產(chǎn)為 2005 年種植面積為 2,641 萬 總產(chǎn)量為 13,450 萬噸，單產(chǎn)為5,100kg/過了小麥，僅次于水稻，居第二位 1。 現(xiàn)代玉米育種的主流是雜交優(yōu)勢育種，基本途徑是先選育純合的親本自交系，再將親本自交系雜交，選育出雜種優(yōu)勢強(qiáng)的雜交種。 玉米最主要的特征是天然異花傳粉，天然授粉群體的田間組成處于高度的異質(zhì)狀態(tài)，個體基因型處于高度的雜合狀態(tài)，這決定了在玉米天然授粉的群體中，株間表現(xiàn)型比較的意義不大，必須通過一定 的基因型選擇過程才能正確地決定取舍；同時由于個體基因型高度雜合，造成表型選擇不可靠，必須對大量個體做測交或后代鑒定才能確認(rèn)表型是否真實遺傳 2。由于這些特點，造成了玉米育種的以下兩個特殊性： 1) 育種過程較長：它包含分離篩選自交系和組配鑒定雜交種兩個步驟。要使眾多雜合的基因位點經(jīng)過自交分離和選擇獲得大多數(shù)有利基因位點達(dá)到純合或基本純合的的自交系，通常需要 6。要對雜交種的生產(chǎn)力和適應(yīng)性做出較為準(zhǔn)確的鑒定，一般需要 3。 2) 從大量材料中分離篩選：由于優(yōu)異的自交系和突出的雜交組合出現(xiàn)的頻率都極低，因此幾乎沒 有例外，任何一個成功的玉米育種工作都是從豐富的原始材料或種質(zhì)庫中分離大量的自交系，又組配大量的雜交組合進(jìn)行試驗，最后只選出個別優(yōu)異的雜交種投入生產(chǎn)利用。概括地說，利用豐富的種質(zhì)資源分離大量的自交系，配制大量的雜交組合，經(jīng)認(rèn)真的鑒定篩選，育成少數(shù)優(yōu)異的自交系和強(qiáng)優(yōu)勢的雜交種， 是 國內(nèi)外玉米育種的共同經(jīng)驗 3。 我國玉米主產(chǎn)區(qū)的種質(zhì)分為瑞德黃馬牙 (唐四平頭、旅大紅骨、蘭卡斯特 (金皇后、獲嘉白馬牙和其他七大類群 4。我國玉米主產(chǎn)區(qū)大面積使用的種質(zhì)基礎(chǔ)基本 是以唐四平頭、旅大紅骨、蘭卡斯特、瑞德黃馬牙這四個類群為主。其組配模式為 :唐四平頭 蘭卡斯特 ， 蘭卡斯特 旅大紅骨 ， 唐四平頭 瑞德黃馬牙 ， 旅大紅骨 瑞德黃馬牙，占我國玉米種質(zhì)的 80%，這也就造成了現(xiàn)有自交系遺傳基礎(chǔ)狹窄 5。 鑒于以上玉米常規(guī)育種中存在的問題，近 10 年來我國玉米單產(chǎn)雖有提高，但幅度不大，效果不明顯，品種的抗逆性不全面， 新的優(yōu)良品種不多， 且遺傳基礎(chǔ)狹窄和遺傳單一化的問中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 8 題日益嚴(yán)重 6。 物技術(shù)在玉米育種工作中的應(yīng)用 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的迅速發(fā)展，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)方興未艾。植物轉(zhuǎn)基因技 術(shù)是指利用重組 術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)或種質(zhì)系統(tǒng)轉(zhuǎn)化技術(shù)將目的基因?qū)胫参锘蚪M并能在后代中穩(wěn)定遺傳同時賦予植物新的農(nóng)藝性狀，如抗蟲、抗病、抗逆、高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)等的植物。植物基因工程育種與其它育種途徑相比具有能夠定向地培育新品種、創(chuàng)造新類型等優(yōu)點。常規(guī)育種由于受有性雜交親和性的制約，影響外來基因型廣泛利用，而生物技術(shù)具有這方面的優(yōu)勢，它可以打破物種界限、克服有性雜交障礙，快速有效地創(chuàng)造遺傳變異，大大縮短新品種育成年限 等 。 玉米轉(zhuǎn)基因技術(shù) 7主要有： 1) 載體轉(zhuǎn)化技術(shù) 玉米主要是農(nóng)桿菌 粒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。 2) 接導(dǎo)入轉(zhuǎn)化技術(shù) 包括基因槍法、 、電擊法、超聲波法等。 3) 種質(zhì)轉(zhuǎn)化技術(shù) 包括花粉管通道法、子房注射法等。 90 年代中期，轉(zhuǎn)基因技術(shù)在玉米育種中得到廣泛的應(yīng)用。自 1992 年起，轉(zhuǎn)基因玉米包括轉(zhuǎn) 因抗螟玉米，轉(zhuǎn) m 基因抗除草劑玉米和轉(zhuǎn) 因耐除草劑玉米已在美國玉米帶大量種植并取得增產(chǎn)效益 8。我國也進(jìn)行了玉米轉(zhuǎn)基因抗蟲的研究，取得了一定的成果 910。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)的日趨進(jìn)步，基因工程輔助育種成為了一種高效、省時的育種方法。 因此，針對我國玉米現(xiàn)狀，利用基因工程手段，分離玉米抗逆、高產(chǎn)相 關(guān)基因，并利用以上方法轉(zhuǎn)化為優(yōu)良的玉米品種，豐富我國玉米的種質(zhì)資源，不失為改善我國玉米育種與生產(chǎn)現(xiàn)狀的有效途徑?？鼓?、高產(chǎn)等優(yōu)良性狀的基因的獲得是整個途徑得以進(jìn)行的前提條件，這其中有兩個關(guān)鍵所在： 1) 選擇何種玉米材料作為目的基因來源：所選玉米材料本身需要有優(yōu)秀的農(nóng)藝性狀和抗逆性，且 應(yīng) 在我國玉米育種中 占 有重要地位，具有很強(qiáng)的代表性 。 2) 基因工程方法分離基因：通過最有效的、最實用的基因工程技術(shù)進(jìn)行目的基因的分離，并鑒定基因功能，以便用于轉(zhuǎn)基因操作。 米優(yōu)良自交系黃早四 自交系選育是玉米育種的重要環(huán)節(jié) 。 優(yōu)良自交系的育成是選配優(yōu)良雜交 種 的基礎(chǔ) 11。在我國雜交種的親本自交系中，自 330、獲白、 黃早四這四個骨干自交系占有突出的地位，俗稱四大自交系 12。四大自交系組成的雜交種播種面積在 1 萬 上的占雜交種面積的 50%左右。近年來，為了改變玉米種質(zhì)基礎(chǔ)狹窄的狀況，我國育種工作者 做 了大量工作，利用多種種質(zhì)材料選育新系。在第三輪全國玉米區(qū)試參試品種中，四大系比重已明顯減少，僅為第一輪的 1/3， 但 是 還沒有出現(xiàn)能夠替代 黃早四的優(yōu)良系。 黃早四是由北京市農(nóng)林科學(xué)院作物所與中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物所于 1975 年共同選育的優(yōu)良自交系 13，是我國育種界公認(rèn)的最優(yōu)秀的中早熟玉米自交系。它具有配合力高、植株緊湊中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 9 以及綜合農(nóng)藝性狀好的突出特點，因而被廣泛利用。黃早四的育種利用率 是最 高 的 ，其改良系數(shù)目超過了國內(nèi)外任何一個自交系，用其組配的玉米雜交種數(shù)目和累計推廣面積超過了任何一個國內(nèi)育成及國外引進(jìn)的親本系 14。黃早四的選育成功極大地促進(jìn)了我國玉米育種和生產(chǎn)的發(fā)展，成為我國玉米育種和種子生產(chǎn)中最重要的骨干材料之一，它具有以下突出特點： 1) 配合力高 選育期間的大量測配以及后來的試驗證明黃早四的一般配合力高而穩(wěn)定。如 黃早四與 796、黃 141 等系組配，均表現(xiàn)高產(chǎn)量。黃早四 羅系 3 則是特殊配合力高的一個突出組合 ； 2) 抗病性強(qiáng) 黃早四高抗小斑病，較抗大斑病，因為另一親本為高抗、抗或輕感大小斑病，所以其雜交種均表現(xiàn)抗病性 ； 3) 綜合穗部性狀好 黃早四的穗型短粗，呈圓錐形，具有較多的行數(shù)、較高的出籽率和較好的結(jié)實性，又具有一定的雙穗性 ； 4) 葉片上沖、株型緊湊 黃早四具有葉片挺立、葉片數(shù)多的株型，且遺傳傳遞力強(qiáng)。黃早四葉片數(shù)多、出葉速度快，有利于迅速建成較大的營養(yǎng)面積 ； 5) 生育期適中，適應(yīng)性廣 黃早四屬于中早熟類 型，中熟、中晚熟系與之組配的雜交種適于套種或春播；中早熟、早熟系與之組配的雜交種適于夏播。因此，黃早四在春夏播玉米區(qū)均可應(yīng)用。 早四在玉米育種與生產(chǎn)中的重要地位 1) 使我國玉米生產(chǎn)發(fā)生了更新?lián)Q代的變化 據(jù)不完全統(tǒng)計，由黃早四組配的雜交種，經(jīng)省市以上審定委員會審定的就有 42 個，未審定但已應(yīng)用的有 9 個，沒有統(tǒng)計面積的還有 17 個，從 1982 年到 1993 年這些雜交種的累計推廣面積達(dá)到 畝。從東北吉林到西南四川都有黃早四的雜交種，特別是黃淮海流域的山東、河北、河南、江蘇、安徽、陜西這一玉米主產(chǎn)區(qū)，黃早 四的雜交種更是主宰了玉米生產(chǎn)，使這些地區(qū)的玉米生產(chǎn)發(fā)生了更新?lián)Q代的變化，玉米產(chǎn)量有了很大的提高。從黃早四組合歷年種植情況看， 1982 年起就超過 1,000 萬畝，以后逐年發(fā)展， 1986 年至今歷年種植面積均在 5,000 萬畝以上，占全國玉米雜交種的 20%可見其在我國玉米生產(chǎn)中的重要性。 2) 開創(chuàng)了緊湊型玉米育種和生產(chǎn)的新局面 黃早四雜交種的大面積成功推廣證明了采用緊湊型玉米雜交種，增加種植密度，提高葉面 積 指數(shù)，充分?jǐn)U大光能利用效率，是進(jìn)一步提高玉米產(chǎn)量的有效途徑。有力地推動了我國玉米育種和栽培科學(xué)的發(fā)展。 3) 豐 富了我國玉米的種質(zhì)來源 黃早四的選育及其一系列衍生改良系的利用使唐四平頭成為我國重要的種質(zhì)來源之一。 鑒于玉米優(yōu)良自交系黃早四自身的優(yōu)良特性以及在我國玉米育種中的重要地位，對其進(jìn)行基因組學(xué)研究，分離其中的優(yōu)良基因有 著 重大的意義。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 10 因工程方法 分離基因 目前，克隆基因的途徑有 2 種：正向遺傳學(xué) (反向遺傳學(xué) (徑。前者是依據(jù)目的基因所表現(xiàn)的功能為基礎(chǔ)，通過鑒定其產(chǎn)物或某種表型突變而進(jìn)行的；后者則著眼于基因本身，通過特定的序列或在基因組中 的位置進(jìn)行。 傳統(tǒng)的功能克隆 (于前者范疇，它是根據(jù)已知基因的產(chǎn)物反推其核苷酸序列，再據(jù)此序列設(shè)計探針或引物從 庫或基因組文庫中篩選克隆 (如玉米組蛋白脫乙酰酶 因的分離 )15，也可以制備產(chǎn)物抗體，從表達(dá)載體構(gòu)建的 庫中篩選相應(yīng)克隆，進(jìn)而分離目的基因。另外，還有近年來發(fā)展十分迅速的表型克隆 (16，例如差別篩選法、扣除雜交技術(shù)、 異顯示技術(shù)、代表性差示分析、抑制性扣除雜交等 17-21。 表 型克隆技術(shù)都普遍存在著依賴于 術(shù)、重復(fù)性較差、假陽性率高、對實驗材料要求較高、材料間不能存在過多的差異、結(jié)果不便確證等缺點。事實上，上述方法在多數(shù)情況下， 由于基因表達(dá)產(chǎn)物不清楚，是很難進(jìn)行相關(guān)基因分離的。因此，在大部分基因產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)功能未知的情況下，人們不得不從另外的角度去尋求突破。 近年來，反向遺傳學(xué)的建立，為分離未知產(chǎn)物的基因提供了越來越多的策略和思路。如最常用的基因克隆技術(shù)有圖位克?。?22、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽 (23技術(shù)就 是基于反向遺傳學(xué)原理發(fā)展起來的。 轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)是利用轉(zhuǎn)座子從一個基因座轉(zhuǎn)到另一個基因座引起的插入突變，使插入位置的功能基因失活并誘導(dǎo)產(chǎn)生突變型，從而可以檢測突變基因的位置并分離該基因。利用轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)對尚未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)座子的植物進(jìn)行基因克隆時，需要將異源的轉(zhuǎn)座子導(dǎo)入該植物，但由于轉(zhuǎn)座子在不同的植物中轉(zhuǎn)座的頻率和活性相差很大，并且需要篩選大量的個體來鑒定轉(zhuǎn)座子突變個體，植物基因組中多拷貝基因的存在還會限制轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)的應(yīng)用，因而轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)的應(yīng)用范圍是十分有限的 24。 圖 1. 圖位克隆示意圖 25 位克隆法，又稱定位克隆 (首先由劍橋大學(xué)提出，是分離基因的非常有效的方法之一。它是根據(jù)功能基因在基因組中都有穩(wěn)定的基因座，在利用分子標(biāo)記技術(shù)對目的基因進(jìn)行精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，用與目的基因緊密連鎖的分子標(biāo)記篩選基因組文庫，進(jìn)而構(gòu)建目的基因區(qū)域的物理圖譜，再利用所構(gòu)建的物理圖譜通過染色體步移（ 國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 11 步逼近目的基因或利用染色體登陸、跳步和連接等方法最終找到包含目的基因的克隆，并通過遺傳轉(zhuǎn)化試驗驗 證目的基因的功能 (圖 1)。 比較而言，圖位克隆技術(shù)隨著相關(guān)配套技術(shù)的日漸成熟，已成為分離基因的常規(guī)方法，并在分離不同的植物發(fā)育基因中得到了廣泛的應(yīng)用。 菌人工染色體文庫的研究進(jìn)展 片段基因組文庫的發(fā)展 大片段基因組文庫先后出現(xiàn)了 噬菌體 載體 、 體、 體、 體、 體、 體（表 1）。 表 of 體類型 宿主 載體容量 優(yōu)缺點 參考文獻(xiàn) 噬菌體載體 大腸桿菌 17入片段太小，但具有創(chuàng)造性 1974 體 大腸桿菌 30入片段偏小，限制其應(yīng)用 1979 體 酵母 350 1000入片段很大，但穩(wěn)定性差，嵌合率高，轉(zhuǎn)化效率低 1987 體 大腸桿菌 100 300入片段不如 但穩(wěn)定性好，嵌合率低，轉(zhuǎn)化效率高 1992 體 大腸桿菌 100 300體自身偏大，使文庫構(gòu)建效率偏低 1994 體 大腸桿菌 /農(nóng)桿菌 100 300借助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物 1996 體 大腸桿菌 /農(nóng)桿菌 100借助農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞效率偏低 G， 1999 噬菌體是構(gòu)建基因組文庫中最早使用的克隆載體，其插入片段雖然僅為 20右，但此創(chuàng)造性的工作已為構(gòu)建大片段文庫奠定了基礎(chǔ)。 庫是以柯斯質(zhì)粒為載體構(gòu)建的文庫，是一類由人工構(gòu)建的含有 列和質(zhì)粒復(fù)制子的特殊類型的質(zhì)粒載體?？扇菁{ 45外源片段，這比 噬菌體載體及質(zhì)粒載體的最大克隆能力都要強(qiáng)。所以 統(tǒng)已被廣泛地應(yīng)用于植物遺傳研究中，以及基因克隆的工作中，而且有些載體經(jīng)過改造后可以直接轉(zhuǎn)化植物。但是， 庫由于其插入片段較小，對于遺傳圖譜并不密集的高等植物的基因克隆在染色體步移中步移次數(shù)太多，因此限制了它的應(yīng)用。 最早發(fā)展起來的真正意義上的人工染色體。在成功分離出復(fù)制啟動區(qū)序列元件26、端粒 27和中心粒 28等幾個保持染色體穩(wěn)定性所必需的作用元件后，人們將它們連于同一線性載體中并引入芽生酵母 細(xì)胞中，構(gòu)建成第一條人工染色體 29。隨著酵母高效轉(zhuǎn)化體系的中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 緒論 12 建立 30及大片段 沖場電泳的引進(jìn)， 獲得了能夠克隆大片段 統(tǒng)，并證明該系統(tǒng)能夠用于構(gòu)建完整的基因組文庫。 體系統(tǒng)的插入片段理論上可達(dá)2右，能夠覆蓋完整的基因組。 作為克隆載體系統(tǒng)， 庫最大的優(yōu)點就是可以容納很大的插入片段，如人的 00物的一般為 100右。然而 統(tǒng)存在著比較嚴(yán)重的缺陷，如嵌合體比例高 31、穩(wěn)定性差 32、插入片段回收困難 33和轉(zhuǎn)化效率低 34等，這些缺點嚴(yán)重限制了 統(tǒng)的應(yīng)用。 庫 35是在細(xì)菌寄主體系基礎(chǔ)上發(fā)展起來的克隆體系， 隆雖然沒有 隆的容載量大，但其有很多優(yōu)越性 (圖 2)： 1) 通過電擊的方法將大質(zhì)粒轉(zhuǎn)化 胞比酵母原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化效率高 10，這樣就減少了文庫構(gòu)建所需的 。對于原料有限的 說，這點至關(guān)重要； 2) 盡管 體是單拷貝，但其在大腸桿菌中的產(chǎn)量足以應(yīng)用傳統(tǒng)的雜交方法進(jìn)行文庫的篩選； 3) 線性的，由于線性的 剪切力非常敏感，所以從 分離完整 的分困難，而含有插入片段的 象一個大的 ，這極大的減少了對 行操作時可能帶來的損傷，而且通過脈沖電泳、 色大大提高了對克隆結(jié)構(gòu)分析的速度 36； 4) 體在大腸桿菌中復(fù)制穩(wěn)定，一般保持低拷貝（ 1 /細(xì)胞），因此減少了質(zhì)粒所攜帶 段的重組，使外源片段保持穩(wěn)定 37； 5) 隆中幾