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小動物活體成像技術(shù)關(guān)鍵詞：動物成像分子影像學(xué)光學(xué)成像2010-04-20 00:00來源：互聯(lián)網(wǎng)點擊次數(shù)：50891、背景和原理1999年，美國哈佛大學(xué)Weissleder等人提出了分子影像學(xué)（molecular imaging）的概念應(yīng)用影像學(xué)方法，對活體狀態(tài)下的生物過程進(jìn)行細(xì)胞和分子水平的定性和定量研究。傳統(tǒng)成像大多依賴于肉眼可見的身體、生理和代謝過程在疾病狀態(tài)下的變化，而不是了解疾病的特異性分子事件。分子成像則是利用特異性分子探針追蹤靶目標(biāo)并成像。這種從非特異性成像到特異性成像的變化，為疾病生物學(xué)、疾病早期檢測、定性、評估和治療帶來了重大的影響。分子成像技術(shù)使活體動物體內(nèi)成像成為可能，它的出現(xiàn)，歸功于分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展、轉(zhuǎn)基因動物模型的使用、新的成像藥物的運用、高特異性的探針、小動物成像設(shè)備的發(fā)展等諸多因素。目前，分子成像技術(shù)可用于研究觀測特異性細(xì)胞、基因和分子的表達(dá)或互作過程，同時檢測多種分子事件，追蹤靶細(xì)胞，藥物和基因治療最優(yōu)化，從分子和細(xì)胞水平對藥物療效進(jìn)行成像，從分子病理水平評估疾病發(fā)展過程，對同一個動物或病人進(jìn)行時間、環(huán)境、發(fā)展和治療影響跟蹤。2、分子成像的優(yōu)點分子成像和傳統(tǒng)的體外成像或細(xì)胞培養(yǎng)相比有著顯著優(yōu)點。首先，分子成像能夠反映細(xì)胞或基因表達(dá)的空間和時間分布，從而了解活體動物體內(nèi)的相關(guān)生物學(xué)過程、特異性基因功能和相互作用。第二，由于可以對同一個研究個體進(jìn)行長時間反復(fù)跟蹤成像，既可以提高數(shù)據(jù)的可比性，避免個體差異對試驗結(jié)果的可影響，又不需要殺死模式動物，節(jié)省了大筆科研費用。第三，尤其在藥物開發(fā)方面，分子成像更是具有劃時代的意義。根據(jù)目前的統(tǒng)計結(jié)果，由于進(jìn)入臨床研究的藥物中大部分因為安全問題而終止，導(dǎo)致了在臨床研究中大量的資金浪費，而分子成像技術(shù)的問世，為解決這一難題提供了廣闊的空間，將使藥物在臨床前研究中通過利用分子成像的方法，獲得更詳細(xì)的分子或基因述水平的數(shù)據(jù)，這是用傳統(tǒng)的方法無法了解的領(lǐng)域，所以分子成像將對新藥研究的模式帶來革命性變革。其次，在轉(zhuǎn)基因動物、動物基因打靶或制藥研究過程中，分子成像能對動物的性狀進(jìn)行跟蹤檢測，對表型進(jìn)行直接觀測和（定量）分析；3、分類分子成像技術(shù)主要分為光學(xué)成像、核素成像、磁共振成像和超聲成像、CT成像五大類。(1) 光學(xué)成像活體動物體內(nèi)光學(xué)成像(Optical in vivo Imaging)主要采用生物發(fā)光（bioluminescence）與熒光（fluorescence）兩種技術(shù)。生物發(fā)光是用熒光素酶(Luciferase)基因標(biāo)記細(xì)胞或DNA，而熒光技術(shù)則采用熒光報告基團(tuán)（GFP、RFP, Cyt及dyes等）進(jìn)行標(biāo)記。利用一套非常靈敏的光學(xué)檢測儀器，讓研究人員能夠直接監(jiān)控活體生物體內(nèi)的細(xì)胞活動和基因行為。通過這個系統(tǒng)，可以觀測活體動物體內(nèi)腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移、感染性疾病發(fā)展過程、特定基因的表達(dá)等生物學(xué)過程。傳統(tǒng)的動物實驗方法需要在不同的時間點宰殺實驗動物以獲得數(shù)據(jù), 得到多個時間點的實驗結(jié)果。相比之下，可見光體內(nèi)成像通過對同一組實驗對象在不同時間點進(jìn)行記錄，跟蹤同一觀察目標(biāo)（標(biāo)記細(xì)胞及基因）的移動及變化，所得的數(shù)據(jù)更加真實可信。另外, 這一技術(shù)對腫瘤微小轉(zhuǎn)移灶的檢測靈敏度極高，不涉及放射性物質(zhì)和方法, 非常安全。 因其操作極其簡單、所得結(jié)果直觀、靈敏度高等特點, 在剛剛發(fā)展起來的幾年時間內(nèi)，已廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)研究及藥物開發(fā)等方面。乳動物生物發(fā)光，是將Fluc基因整合到細(xì)胞染色體DNA上以表達(dá)熒光素酶，當(dāng)外源（腹腔或靜脈注射）給予其底物熒光素(luciferin)，即可在幾分鐘內(nèi)產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象。這種酶在ATP及氧氣的存在條件下，催化熒光素的氧化反應(yīng)才可以發(fā)光，因此只有在活細(xì)胞內(nèi)才會產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，并且光的強(qiáng)度與標(biāo)記細(xì)胞的數(shù)目線性相關(guān)。對于細(xì)菌，lux操縱子由編碼熒光素酶的基因和編碼熒光素酶底物合成酶的基因組成，帶有這種操縱子的細(xì)菌會持續(xù)發(fā)光，不需要外源性底物?；?、細(xì)胞和活體動物都可被熒光素酶基因標(biāo)記。標(biāo)記細(xì)胞的方法基本上是通過分子生物學(xué)克隆技術(shù), 將熒光素酶的基因插到預(yù)期觀察的細(xì)胞的染色體內(nèi)，通過單克隆細(xì)胞技術(shù)的篩選, 培養(yǎng)出能穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞株。目前, 常用的細(xì)胞株基本上都已標(biāo)記好, 市場上已有銷售。 將標(biāo)記好的細(xì)胞注入小鼠體內(nèi)后, 觀測前需要注射熒光素酶的底物熒光素，為約280道爾頓的小分子。熒光素脂溶性非常好, 很容易透過血腦屏障。注射一次熒光素能保持小鼠體內(nèi)熒光素酶標(biāo)記的細(xì)胞發(fā)光30-45分鐘。每次熒光素酶催化反應(yīng)只產(chǎn)生一個光子，這是肉眼無法觀察到的，應(yīng)用一個高度靈敏的制冷CCD相機(jī)及特別設(shè)計的成像暗箱和成像軟件，可觀測并記錄到這些光子。光在哺乳動物組織內(nèi)傳播時會被散射和吸收，光子遇到細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)時會發(fā)生折射現(xiàn)象，而且不同類型的細(xì)胞和組織吸收光子的特性并不一樣。在偏紅光區(qū)域, 大量的光可以穿過組織和皮膚而被檢測到。利用靈敏的活體成像系統(tǒng)最少可以看到皮下的500個細(xì)胞，當(dāng)然，由于發(fā)光源在老鼠體內(nèi)深度的不同可看到的最少細(xì)胞數(shù)是不同的。在相同的深度情況下, 檢測到的發(fā)光強(qiáng)度和細(xì)胞的數(shù)量具有非常好的線性關(guān)系?？梢姽怏w內(nèi)成像技術(shù)的基本原理在于光可以穿透實驗動物的組織并且可由儀器量化檢測到的光強(qiáng)度，同時反映出細(xì)胞的數(shù)量。熒光發(fā)光是通過激發(fā)光激發(fā)熒光基團(tuán)到達(dá)高能量狀態(tài)，而后產(chǎn)生發(fā)射光。常用的有綠色熒光蛋白(GFP)、紅色熒光蛋白DsRed 及其它熒光報告基團(tuán)，標(biāo)記方法與體外熒光成像相似。熒光成像具有費用低廉和操作簡單等優(yōu)點。 同生物發(fā)光在動物體內(nèi)的穿透性相似，紅光的穿透性在體內(nèi)比藍(lán)綠光的穿透性要好得多，近紅外熒光為觀測生理指標(biāo)的最佳選擇。雖然熒光信號遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但非特異性熒光產(chǎn)生的背景噪音使其信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于生物發(fā)光。雖然許多公司采用不同的技術(shù)分離背景光，但是受到熒光特性的限制，很難完全消除背景噪音。這些背景噪音造成熒光成像的靈敏度較低。目前大部分高水平的文章還是應(yīng)用生物發(fā)光的方法來研究活體動物體內(nèi)成像。 但是，熒光成像有其方便，便宜，直觀，標(biāo)記靶點多樣和易于被大多數(shù)研究人員接受的優(yōu)點，在一些植物分子生物學(xué)研究和觀察小分子體內(nèi)代謝方面也得到應(yīng)用。對于不同的研究，可根據(jù)兩者的特點以及實驗要求，選擇合適的方法。最近許多文獻(xiàn)報道的實驗中，利用綠色熒光蛋白和熒光素酶對細(xì)胞或動物進(jìn)行雙重標(biāo)記，用成熟的熒光成像技術(shù)進(jìn)行體外檢測，進(jìn)行分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)研究；然后利用生物發(fā)光技術(shù)進(jìn)行動物體內(nèi)檢測， 進(jìn)行活體動物體內(nèi)研究。(2) 核素成像核素成像技術(shù)用于發(fā)現(xiàn)易于為核素標(biāo)記的既定靶目標(biāo)底物的存在，或用于追蹤小量標(biāo)記基因藥物和進(jìn)行許多藥物抵抗或病毒載體的傳送。包括微PET、微SPECT。微PET（正電子發(fā)射斷層掃描儀Positron Emission Tomography）在目前的分子影像學(xué)研究中占據(jù)著極其重要的地位。最先開始的分子影像學(xué)研究就是用PET完成的，如今，用微PET進(jìn)行的單純胞疹病毒胸苷激酶的分子影像學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于臨床試驗中。微PET技術(shù)是將正電子同位素標(biāo)記的化合物注入生物體內(nèi)作為探針，當(dāng)這些化合物參與生物體內(nèi)的代謝過程時，PET按照同位素放射性分布的絕對量進(jìn)行連續(xù)性掃描，根據(jù)動力學(xué)原理和圖像數(shù)據(jù)，對活體組織中的生理生化代謝過程作出定量分析，如血流量、能量代謝、蛋白質(zhì)合成、脂肪酸代謝、神經(jīng)遞質(zhì)合成速度、受體密度及其與配體結(jié)合的選擇性和動力學(xué)等。PET 通常使用的探針是用11C，14N， 15O 及18F 等生物組織中含量最多元素的放射性核素標(biāo)記的化合物，它們具有與體內(nèi)分子類似（包括細(xì)胞代謝）的特點。在藥理學(xué)研究中，則可以用正電子同位素直接標(biāo)記藥物，觀察其在活體中的分布和代謝，或測量生理性刺激及病理學(xué)過程中藥物分布與代謝的變化，從而對藥物劑量、作用部位、可能發(fā)生的毒副作用等做出前瞻性判斷。還可以判斷其代謝反應(yīng)的類型及產(chǎn)物，觀察藥物與其他藥物的相互作用、藥物與營養(yǎng)物質(zhì)的相互作用、藥物與受體的作用、藥物與酶的相互作用等。(3) 磁共振成像磁共振（MRI）分子影像學(xué)的優(yōu)勢在于它的高分辨率（已達(dá)到m級），同時可獲得解剖及生理信息。這些正是核醫(yī)學(xué)、光學(xué)成像的弱點。但是MRI分子影像學(xué)也有其弱點，它的敏感性較低（微克分子水平），與核醫(yī)學(xué)成像技術(shù)的納克分子水平相比，低幾個數(shù)量級。傳統(tǒng)的MRI是以物理、生理特性作為成像對比的依據(jù)。分子水平的MRI成像是建立在上述傳統(tǒng)成像技術(shù)基礎(chǔ)上，以特殊分子作為成像依據(jù)，其根本宗旨是將非特異性物理成像轉(zhuǎn)為特異性分子成像，因而其評價疾病的指標(biāo)更完善，更具特異性。MRI分子影像學(xué)成像，可在活體完整的微循環(huán)下研究病理機(jī)制，在基因治療后表型改變前，評價基因治療的早期效能，并可提供三維信息，較傳統(tǒng)的組織學(xué)檢查更立體、快速。概括起來，MRI在分子影像學(xué)的應(yīng)用主要包括基因表達(dá)與基因治療成像、分子水平定量評價腫瘤血管生成、顯微成像、活體細(xì)胞及分子水平評價功能性改變等方面。(4) 超聲成像超聲分子影像學(xué)是近幾年超聲醫(yī)學(xué)在分子影像學(xué)方面的研究熱點。