CN103272238A基于DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料

CN103272238A基于DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料 (10)申請(qǐng)公布號(hào)103272238A (43)申請(qǐng)公布日xx.09.04103272238A*103272238A* (21)申請(qǐng)?zhí)杧x10228378.2 (22)申請(qǐng)日xx.06.08A61K47/26(xx.01)A61L27/14(xx.01)C12N5/00(xx.01) (71)申請(qǐng)人北京大學(xué)地址100871北京市海淀區(qū)頤和園路5號(hào) (72)發(fā)明人梁德海周繼寒文豪石棟牛林殷雨丹 (74)專利代理機(jī)構(gòu)北京萬象新悅知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙)11360代理人李稚婷 (54)發(fā)明名稱基于DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料 (57)摘要本發(fā)明公開了一種基于DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料。 將DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷類分子溶液中，液滴或液柱表層的DNA與氨基糖苷類分子相互作用，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，從而得到膠囊狀或管狀包覆的生物材料。 該生物材料具有可以調(diào)控的大小和形狀，并可以包載不同的藥物和功能分子，還可以形成生物細(xì)胞和組織工程中的支架材料，實(shí)現(xiàn)多樣的功能。 (51)Int.Cl.權(quán)利要求書1頁說明書4頁附圖3頁 (19)中華人民共和國(guó)國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局 (12)發(fā)明專利申請(qǐng)權(quán)利要求書1頁說明書4頁附圖3頁 (10)申請(qǐng)公布號(hào)103272238A103272238A*103272238A*1/1頁21.一種DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合的生物材料，具有DNA和氨基糖苷類分子形成的復(fù)合物外殼，通過如下方法制備得到將DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷類分子溶液中，液滴或液柱表層的DNA與氨基糖苷類分子相互作用，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，得到膠囊狀或管狀包覆的生物材料。 2.如權(quán)利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA是大于800bp的雙鏈DNA。 3.如權(quán)利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA溶液和氨基糖苷類分子溶液的溶劑為1TE緩沖液或水。 4.如權(quán)利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述DNA溶液的濃度為550mg/mL；所述氨基糖苷類分子溶液的濃度為10100mg/mL。 5.如權(quán)利要求1所述的生物材料，其特征在于，所述氨基糖苷類分子是氨基糖苷類抗生素。 6.如權(quán)利要求5所述的生物材料，其特征在于，所述氨基糖苷類分子選自卡那霉素、卡內(nèi)多霉素、鏈霉素、慶大霉素和阿米卡星中的一種或多種。 7.一種包載生物功能物質(zhì)的方法，將需要包載的生物功能物質(zhì)與DNA溶液混合，再將該混合溶液以液滴或液柱的形式加入氨基糖苷類分子溶液中，形成包載生物功能物質(zhì)的生物材料。 8.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA是大于800bp的雙鏈DNA；所述氨基糖苷類分子是氨基糖苷類抗生素。 9.如權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述DNA溶液的濃度為550mg/mL；所述氨基糖苷類分子溶液的濃度為10100mg/mL。 10.權(quán)利要求1所述的DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合的生物材料作為生物細(xì)胞和組織工程中的支架材料的用途。 權(quán)利要求書103272238A21/4頁3基于DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料技術(shù)領(lǐng)域0001本發(fā)明涉及復(fù)合生物材料，特別涉及基于聚電解質(zhì)復(fù)合原理，利用生物可降解的DNA和氨基糖苷類分子(抗生素)之間的相互作用形成的復(fù)合物材料，屬于生物材料領(lǐng)域。 背景技術(shù)0002聚電解質(zhì)復(fù)合物在生命和材料科學(xué)中起著巨大的作用，諸如絮凝劑、潤(rùn)滑劑、涂層材料以及基于陰陽離子靜電沉積技術(shù)的表面修飾等等領(lǐng)域。 最近二十年來，聚電解質(zhì)復(fù)合物更被視為潛在的有效藥物和基因傳載體系而受到廣泛關(guān)注，因?yàn)閹щ姷腄NA、藥物或者蛋白可以很容易被整合到復(fù)合物的顆粒之中(A.F.Thunemann，M.Muller，H.Dautzenberg，J.F.O.Joanny andH.Lowen，in Polyelectrolyteswith DefinedMolecular Architecture+i，ed.M.Schmidt，Springer-Verlag Berlin，Berlin，Editon edn.，xx，vol.166，pp.113-171.)。 大量的帶正電陽離子化合物，包括聚陽離子、正電磷脂、殼聚糖、白蛋白、樹枝狀大分子以及多肽等，被利用成為基因和藥物的傳遞載體。 但是由于聚電解質(zhì)復(fù)合物的載體體系存在穩(wěn)定性的問題(JihanZhou，Jie Liu，Tao Shi，Yuqiong Xia，Ying Luo，and DehaiLiang，Phase Separationof siRNA/polycation Complexand ItsEffect onTransfection Efficiency，soft matter，xx，9，2262-2268)，還有不少的陽離子型載體具有較強(qiáng)的毒性，這都限制了聚電解質(zhì)復(fù)合物載體的臨床使用。 0003DNA是一種帶電密度很高的剛性強(qiáng)聚電解質(zhì)，作為生命的遺傳物質(zhì)，它不僅在許多生命過程(DNA的轉(zhuǎn)錄與翻譯)和生物傳承(基因的半保留復(fù)制)中起著重大功能，而且還越來越多被用作納米材料在納米工程中得到使用。 例如利用DNA折紙術(shù)進(jìn)行組裝，形成各種各樣的納米結(jié)構(gòu)(Chenxiang Lin，Yan Liu，and HaoYan，Designer DNANanoarchitectures Biochemistry，xx，48，1663-1674)。 氨基糖苷類分子(Aminoglycosides)，是由氨基糖與氨基環(huán)醇通過氧橋連接而成的糖苷，是一種帶氨基的糖分子，可以抑制細(xì)菌蛋白的合成，主要可以用作有氧類細(xì)菌的抗生素，在醫(yī)藥方面得到了廣泛的應(yīng)用。 帶負(fù)電的DNA和帶正電的氨基糖苷類分子的復(fù)合物材料還未見報(bào)道。 發(fā)明內(nèi)容0004本發(fā)明的目的在于利用帶負(fù)電的DNA和帶正電的氨基糖苷類分子之間的靜電相互作用，以及糖苷分子上的羥基與DNA之間的羥基作用，通過一定的方法，由比例、濃度等條件的調(diào)控，形成尺寸、形貌各不相同的復(fù)合物材料，可以用來包載藥物分子、脂質(zhì)體以及細(xì)胞，還可以用作組織修復(fù)以及細(xì)胞工程的支架材料。 本發(fā)明的技術(shù)方案如下0005一種DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合的生物材料，具有DNA和氨基糖苷類分子形成的復(fù)合物外殼，通過如下方法制備得到將DNA溶液以液滴或液柱的形式加入到氨基糖苷類分子溶液中，液滴或液柱表層的DNA與氨基糖苷類分子相互作用，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，得到膠囊狀或管狀包覆的生物材料。 0006本發(fā)明所采用的DNA是堿基對(duì)長(zhǎng)過一定數(shù)目的雙鏈DNA，優(yōu)選大于800bp，但DNA說明書103272238A32/4頁4的長(zhǎng)度不對(duì)整個(gè)材料功能產(chǎn)生決定性影響。 DNA帶有足夠的負(fù)電荷，可以和帶正電的氨基糖苷類分子形成復(fù)合物作為生物材料的柔性外殼；而DNA液滴或液柱內(nèi)部提供大量的水環(huán)境，可以容納足夠的包覆物。 0007本發(fā)明所采用的氨基糖苷類分子帶有大量羥基和氨基，主要是指氨基糖苷類抗生素，例如卡那霉素、卡內(nèi)多霉素(Kanamycin B)、鏈霉素、慶大霉素、阿米卡星等，它們可以快速與DNA形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，其羥基與DNA之間強(qiáng)相互作用使得復(fù)合物殼層高度疏水，從而保證形成的膠囊或管狀包覆物的穩(wěn)定性。 0008將DNA溶液以液滴形式滴入氨基糖苷類分子溶液中，即可形成大小與液滴相近的復(fù)合物膠囊；將DNA溶液拉成液柱加入氨基糖苷類分子溶液，可形成管狀包覆物；采用微流控的方法將DNA溶液和氨基糖苷類分子溶液兩種溶液混合，通過設(shè)計(jì)管路，則可以獲得微米級(jí)別的膠囊和管狀包覆物。 0009上述制備DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合生物材料的方法中，所述氨基糖苷類分子溶液的濃度通常為10100mg/mL，優(yōu)選50100mg/mL；所述DNA溶液的濃度通常為550mg/mL，優(yōu)選1030mg/mL。 配制氨基糖苷類分子溶液和DNA溶液的溶劑優(yōu)先選擇1TE緩沖液(10mM tris，1mM EDTA)或者水。 0010基于上述DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合的生物材料，本發(fā)明還提供了一種包載生物功能物質(zhì)(分子或結(jié)構(gòu))的方法，即將需要包載的物質(zhì)(包括但不限于藥物分子、脂質(zhì)體、細(xì)胞等)與DNA溶液混合，再將該混合溶液以液滴或液柱的形式加入氨基糖苷類分子溶液中，可以形成包載藥物分子、脂質(zhì)體和/或細(xì)胞等的生物材料。 0011本發(fā)明DNA與氨基糖苷類分子復(fù)合的生物材料不僅可以用作生物功能物質(zhì)的包覆材料，還可以作為生物細(xì)胞和組織工程中的支架材料，例如通過對(duì)包覆物通透性的調(diào)節(jié)，可以實(shí)現(xiàn)將細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)有選擇地分階段釋放到細(xì)胞培養(yǎng)基質(zhì)之中；還可以將細(xì)胞包裹在具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的空泡中誘導(dǎo)細(xì)胞選擇性分化等等。 0012本發(fā)明技術(shù)效果如下0013下面以魚精DNA和卡那霉素(Kanamycin)為例，說明微膠囊的形成過程，以及幾種性質(zhì)不同的物質(zhì)(羅丹明B以及脂質(zhì)體囊泡等等)的包覆與釋放。 當(dāng)DNA溶于TE緩沖溶液的時(shí)候，會(huì)因?yàn)闈舛炔煌纬绅ざ炔煌娜芤?，將這樣的溶液液滴加入卡那霉素溶液中，液滴表層DNA的磷酸負(fù)電基團(tuán)與周圍溶液卡那霉素的氨基正電基團(tuán)相互作用，形成聚電解質(zhì)復(fù)合物，這層復(fù)合物會(huì)隨時(shí)間逐漸形成，并將內(nèi)部整個(gè)液滴包覆在內(nèi)。 加入不同形狀的液滴，可以形成不同形狀的包覆物。 這樣的包覆物既能包載羅丹明B這樣的小分子，又可以包載脂質(zhì)體囊泡這樣的大結(jié)構(gòu)。 0014綜上，本發(fā)明提出的基于DNA和氨基糖苷類分子復(fù)合物的生物材料具有可以調(diào)控的大小和形狀，并可以包載不同的藥物和功能分子，還可以形成生物細(xì)胞和組織工程中的支架材料，能夠?qū)崿F(xiàn)多樣的功能。 附圖說明0015圖1顯示了魚精DNA與Kanamycin形成的包裹泡；0016圖2顯示了魚精DNA與Kanamycin形成的管狀包覆物；0017圖3是魚精DNA與Kanamycin形成的包裹泡的動(dòng)力學(xué)變化過程圖；說明書103272238A43/4頁50018圖4是SEM測(cè)得的魚精DNA與Kanamycin形成的包裹泡的表面結(jié)構(gòu)圖，其中B、C、D分別是A圖中b、c、d框中區(qū)域的放大圖；0019圖5是魚精DNA-Kanamycin包裹泡包載羅丹明B分子的熒光變化圖；0020圖6是魚精DNA-Kanamycin包裹泡包載脂質(zhì)體囊泡的熒光變化圖；0021圖7顯示了魚精DNA與Kanamycin B形成的包裹泡。 具體實(shí)施方式0022下面通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案和有益效果，但并不因此而限制本發(fā)明的范圍。 0023實(shí)驗(yàn)儀器及樣品的配制0024 1、實(shí)驗(yàn)儀器0025為了表征DNA-氨基糖苷類分子復(fù)合的微膠囊的表面形貌與內(nèi)部結(jié)構(gòu)，利用掃描電子顯微鏡SEM(Hitachi S-4800，Hitachi，Japan)測(cè)定。 用熒光光譜儀(FL-7000，Hitachi，Japan)跟蹤熒光標(biāo)記分子羅丹明B的熒光變化。 0026 2、樣品的配制0027魚精DNA(2000bp)，小牛胸腺DNA(6000bp)，卡那霉素(Kanamycin)，卡內(nèi)多霉素(kanamycin B)，羅丹明B和帶羅丹明熒光基團(tuán)標(biāo)記的脂質(zhì)體作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象。 0028將DNA和氨基糖苷類分子分別溶于TE緩沖溶液中，最終濃度分別為1030mg/mL和50100mg/mL。 羅丹明B或脂質(zhì)體溶液與DNA溶液共混形成被包載液。 0029實(shí)施例10030采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于緩沖液中，濃度為10mg/mL；將Kanamycin溶于緩沖液中，濃度為100mg/mL；利用100L移液槍將DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到復(fù)合物殼層。 如圖1所示，用肉眼可以看到明顯的宏觀小球泡狀結(jié)構(gòu)。 小球泡狀結(jié)構(gòu)的形成過程如圖3所示，kanamycin和DNA的復(fù)合物是隨著時(shí)間而逐漸形成的。 將DNA液柱加入Kanamycin溶液，則可以形成管狀包覆物，見圖2。 0031將形成的泡狀結(jié)構(gòu)冷凍干燥，然后用SEM測(cè)其表面的形貌，如圖4所示，可見形成的泡狀結(jié)構(gòu)尺寸在毫米級(jí)別(圖4A)。 A圖中框中的區(qū)域b、c、d分別對(duì)應(yīng)放大后的B、C、D圖區(qū)域，分別為復(fù)合物斷裂面、復(fù)合物殼層以及小泡內(nèi)部這三個(gè)部分。 從放大的圖上看，形成的復(fù)合物殼層為光滑的表面(圖4C)，而小泡內(nèi)部是DNA與Kanamycin形成的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)(圖4D)。 在小泡結(jié)構(gòu)斷裂處可以明顯看到，殼層與內(nèi)部之間界面的形貌變化(圖4B)。 0032實(shí)施例20033采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于緩沖液中，濃度為20mg/mL；將Kanamycin溶于緩沖液中，濃度為100mg/mL；利用100L移液槍將DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到復(fù)合物殼層，形成小泡結(jié)構(gòu)，類似于圖1。 0034實(shí)施例30035采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于緩沖液中，濃度為30mg/mL；將Kanamycin溶于緩沖液中，濃度為100mg/mL；利用100L移液槍將DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到復(fù)合物殼層，形成小泡結(jié)構(gòu)，類似于圖1。 0036實(shí)施例4說明書103272238A54/4頁60037采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于緩沖液中，濃度為10mg/mL；將Kanamycin溶于緩沖液中，濃度為50mg/mL；利用100L移液槍將DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到復(fù)合物殼層，形成小泡結(jié)構(gòu)，類似于圖1。 0038實(shí)施例1-4說明，DNA和Kanamycin的復(fù)合物小泡可以在較廣的濃度范圍內(nèi)得到。 0039實(shí)施例50040采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于含有羅丹明B(濃度0.1mg/mL)的TE緩沖液中，濃度為10mg/mL；將Kanamycin溶于TE緩沖液中，濃度為100mg/mL；利用100L移液槍將DNA液滴加入Kanamycin溶液，得到復(fù)合物殼層，液滴中包埋了羅丹明B分子。 將DNA-羅丹明B分子混合液直接加入TE緩沖液作為參照。 加入大量NaCl鹽(c4M)可以破壞整個(gè)包載小泡，將其中包載的分子完全放出，以這個(gè)總量作為樣品熒光歸一化總量。 0041用熒光光譜跟蹤小泡包埋羅丹明B分子的效率和釋放過程。 光譜用550nm激發(fā)，在560-700nm測(cè)量發(fā)射熒光，最大發(fā)射在574nm。 從圖5可以看到，不加Kanamycin的參照體系，熒光信號(hào)隨時(shí)間增長(zhǎng)，而加Kanamycin體系的小泡有一個(gè)較慢的釋放，最終能夠包裹近50的羅丹明B小分子。 0042這一實(shí)驗(yàn)證明，通過簡(jiǎn)單的混合，我們的材料就可以包載水溶性的小分子。 0043實(shí)施例60044采用1TE緩沖液，將魚精DNA溶于含有脂質(zhì)體)，的TE緩沖液中，DNA濃度為10mg/mL，其中脂質(zhì)體的組成為二棕櫚酰磷脂酰膽堿(DPPC)二棕櫚酰磷脂酰甘油(DPPG)11，且在囊泡內(nèi)加入0.1二棕櫚酰磷脂酰-N-磺化麗絲胺羅丹明的銨鹽(Rh-DPPE)作為熒光基團(tuán)，濃度為33