發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作后遠期學習記憶障礙及海馬神經(jīng)元可塑性的研究.doc

發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作后遠期學習記憶障礙及海馬神經(jīng)元可塑性的研究作者：羅平香,唐洪麗單位：東南大學臨床醫(yī)學院 兒科學教研室，江蘇 南京 210009【摘要】 目的 探討發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作對大鼠成年后學習記憶及海馬神經(jīng)元可塑性的影響。方法 生后10 d SD大鼠32只，隨機分為實驗組16只和對照組16只。實驗組用戊四氮(PTZ)反復腹腔注射5 d，制成反復癇性發(fā)作模型，對照組腹腔注射等量生理鹽水。在生后第60天用Morris水迷宮評價大鼠的學習記憶功能，用RTPCR方法檢測大鼠海馬神經(jīng)元可塑性標志物神經(jīng)生長相關蛋白43(GAP43)mRNA的表達變化。結(jié)果 與對照組比較,實驗組在Morris水迷宮測試中平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05),原平臺所在象限的游泳時間明顯縮短(P<0.05);海馬組織GAP43 mRNA的表達顯著增多(P<0.05)。結(jié)論 發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作可引起遠期學習記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)元可塑性改變，而GAP43表達增多可能是學習記憶功能和可塑性變化的分子機制。 【關鍵詞】 癲癇;發(fā)育;學習記憶;神經(jīng)生長相關蛋白43;可塑性 Longterm effects on learning and memory and hippocamus neuroplasticityin immature rats following recurrent seizuresLUO Pingxiang,TANG Hongli(Department of Pediatrics,School of Clinical dicine,Southeast University,Nanjing 210009,China)bstract:Objective To explore the effects of recurrent seizures in immature rats on learning and memory and hippocamus neuroplasticity when the animals were in adulthood.Methods Rats at postnatal day 10(n=32)were divided into experimental group (n=16) and control group (n=16).Rats in the experimental group were treated with pentylenetetrazol(PTZ) daily by intraperitoneal injection for 5 consecutive days to induce recurrent seizure and rats in the control group were injected with normal saline for 5 consecutive days.All rats at postnatal day 60 were tested for spatial learning and memory by Morris water maze task.The expressions of GAP43mRNA,the marker for neuroplasticity in hippocampus were detected by reverse transcription polymerase chain reaction.Results In the experimental group, the mean escape latency of searching the platform significantly prolonged (P<0.05) and swimming time in the original platform region significantly shortened (P<0.05) in Morris water maze.The expression of GAP43 mRNA in hippocampus in the experimental group was significantly increased than that in the control group(P<0.05).Conclusion These findings indicate that recurrent seizure in immature rats have longterm detrimental effects on learning and memory and changes of hippocamus plasticity, such as synaptic reoganization and the action of neuron.GAP43 increasing may be the molecular mechanisms for learning and memory and hippocamus neuroplasticity.Key words:epilepsy;development;learning and memory;neuronalgrowth associated protein43;neuroplasticity(Modern Medical Journal,2009,37:333336)對成年動物的研究發(fā)現(xiàn),反復癇性發(fā)作可引起海馬神經(jīng)元壞死、代償性苔蘚纖維發(fā)芽，導致突觸重組,形成異常通路，造成學習、記憶和行為的長期缺陷1。未成熟腦處于不斷生長發(fā)育、功能逐步完善的動態(tài)變化之中，與成熟腦有很大的區(qū)別，目前對于發(fā)育鼠的研究國內(nèi)外報道尚少。本研究以戊四氮(pentylenetetrazol，PTZ)誘導生后10 d大鼠建立反復癇性發(fā)作模型，追蹤至大鼠成年后用Morris水迷宮評價大鼠的學習記憶功能，用RTPCR方法檢測大鼠海馬組織神經(jīng)元可塑性標志物神經(jīng)生長相關蛋白(neuronalgrowth associated protein,GAP43) mRNA的表達變化，探討發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作可否引起遠期學習記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)元可塑性的改變，并探討可能的分子機制。1 材料與方法1.1 材料及儀器PTZ(美國Sigma公司);GAP43、GADPH引物由上海生物工程公司合成，序列如下：GAP43上游引物5′ATGATGCTCCCGTTGCTGAT3′,下游引物5′GCACATCGGCTTGTTTAGGC3′，產(chǎn)物片段長度276 bp;GADPH上游引物5′CGGGAAGCTTGTCATCAATGG3′，下游引物5′GGCAGTGATGGCATGGACTG3′，產(chǎn)物片段長度358 bp;RNA提取試劑Trizol(美國Invitrogen公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Promega公司);Taq酶(日本TaKaRa公司);大鼠Morris水迷宮(中國藥科大學)。1.2 動物分組及模型制備生后10 d健康清潔級SD大鼠32只(由東南大學醫(yī)學院實驗動物中心提供,12 h光亮/黑暗條件,2225 環(huán)境溫度,由母鼠喂養(yǎng)，每窩崽數(shù)不超過10只),隨機分為PTZ模型組16只和生理鹽水對照組16只。參照文獻2提供的方法，模型組首次腹腔注射驚厥閾下劑量PTZ 40 mg•kg-1，10 min后注射20 mg•kg-1，以后每10 min注射10 mg•kg-1，直至出現(xiàn)4級以上的驚厥發(fā)作(發(fā)作的嚴重程度按照Lado幼鼠癲癇發(fā)作分級標準3：0級，無發(fā)作;1級，機械性咀嚼;2級，連續(xù)性點頭;3級，單側(cè)前肢陣攣;3.5級，前肢交替陣攣;4級，雙側(cè)前肢陣攣、后退;5級，雙側(cè)前肢陣攣、后退、摔倒;6級，狂奔嘶叫;7級，強直發(fā)作)，如此反復注射5 d。對照組給予腹腔注射等量的生理鹽水。1.3 Morris水迷宮測試大鼠進入成年(第60天)后，對模型組16只和對照組16只行Morris水迷宮測試，連續(xù)5 d，以評價其空間學習和記憶能力。程序包括：(1)定位航行實驗:用于檢測大鼠對水迷宮的學習和記憶能力。歷時4 d,每天8次,將大鼠從4個入水點面向池壁放入水中,記錄大鼠從入水到爬上平臺所需的時間(逃避潛伏期)。如果大鼠在120 s內(nèi)不能找到平臺，就將其引至平臺，將逃避潛伏期記為120 s。每次放大鼠入水前都要將其放在平臺上停留30 s，使其熟悉水迷宮周圍的標志物，以便記憶平臺的位置。每次訓練間隔60 s，取8次的平均值進行統(tǒng)計。(2)空間探索實驗:用于檢測大鼠學會尋找平臺后對平臺空間位置的記憶能力。定位航行實驗結(jié)束后撤除平臺,然后將大鼠任選一入水點放入水中,測其120 s內(nèi)在原放有平臺的象限內(nèi)停留的時間。1.4 用RTPCR檢測海馬組織GAP43mRNA的表達完成Morris水迷宮測試后，直接斷頭取雙側(cè)海馬,生理鹽水沖洗后，置-80 冰箱中保存。采用Trizol一步法提取總RNA,按試劑盒說明書進行操作。PCR擴增條件：94 預變性5 min;94 變性45 s，55 (以引物序列后退火溫度為主)復性45 s，72 延伸1 min，這樣反復循環(huán)35次;72 延伸10 min。反應結(jié)束后，取反應液10 μl進行瓊脂糖凝膠電泳，確認PCR反應產(chǎn)物。用ImageMaster VDS圖像分析處理系統(tǒng)掃描，以GAP43/GAPDH吸光度比值作為GAP43 mRNA的相對表達水平。1.5 統(tǒng)計學處理用SPSS 11. 5軟件進行處理,數(shù)據(jù)用x-±s表示,組間均數(shù)的比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2 結(jié) 果2.1 Morris水迷宮實驗結(jié)果2.1.1 定位航行實驗結(jié)果 隨著大鼠學習次數(shù)增加,兩組大鼠尋找平臺的潛伏期逐漸縮短。與對照組比較,模型組大鼠平均逃避潛伏期明顯延長(P<0.05)。見表1。表1 兩組大鼠逃避潛伏期的比較(2.1.2 空間探索實驗結(jié)果 模型組大鼠120 s內(nèi)在原放有平臺的象限內(nèi)停留的時間為(35.63±5.17) s，而對照組為(52.59±6.98) s，兩組比較有顯著性差異(t=2.543,P<0.05)。2.2 海馬組織GAP43 mRNA的表達模型組GAP43 mRNA的相對吸光度值為0.628±0.103，與對照組(0.306±0.087)比較差異有統(tǒng)計學意義(t=2.701,P<0.05)，見圖1。M.Marker; 1.對照組; 2.模型組圖1 大鼠生后第65天海馬GAP43 mRNA表達3 討 論大量臨床研究表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當高的比例可追問到兒童早期有反復癇性發(fā)作史，因此，幼年早期有過癇性發(fā)作對個體生長發(fā)育有何長遠影響，一直是備受關注的問題。近年來發(fā)育腦癲癇點燃模型研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)育腦反復點燃后海馬神經(jīng)元并無明顯損傷，發(fā)育鼠經(jīng)歷比成熟鼠更長的驚厥發(fā)作,神經(jīng)元脫失卻明顯低于成熟鼠,提示發(fā)育鼠腦內(nèi)可能存在保護機制4。但這種保護機制并不是絕對的。本實驗結(jié)果顯示,在Morris水迷宮測試中,與對照組比較,模型組大鼠平均逃避潛伏期顯著延長,原平臺所在象限的游泳時間明顯縮短，可見發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作可引起遠期學習記憶損害。GAP43是神經(jīng)元特異性胞膜磷酸蛋白，廣泛分布在神經(jīng)元中，特別在生長、分化、再生的軸突末端含量極高，在神經(jīng)纖維的生長、發(fā)育、軸突再生以及突觸功能的維持方面起著重要作用，是當今研究腦損傷修復和神經(jīng)可塑性的一種首選標志物5。研究已證實大體有兩種類型突觸可塑性變化與GAP43的表達相關:(1)突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)變化可導致GAP43表達的升高;(2)由長時程增強(longterm potentiation,LTP)和長時程抑制(longtermdepression,LTD)所引發(fā)的突觸效能的變化,可影響GAP43的磷酸化狀態(tài)和其mRNA的表達6。動物過度表達高水平的外源基因編碼GAP43會導致異常的突觸聯(lián)系形成。將GAP43基因整合到非神經(jīng)細胞中可以誘導形成神經(jīng)突起樣偽足。癲癇動物模型研究發(fā)現(xiàn)，在伴隨動物點燃后海馬苔蘚纖維出芽的同時，GAP43有明顯的表達增高。病理研究發(fā)現(xiàn)，癲癇患者神經(jīng)元壞死后隨之將有神經(jīng)元異常的側(cè)枝出芽及反應性突觸再生，此時，GAP43的表達也明顯增加。轉(zhuǎn)基因鼠研究發(fā)現(xiàn)GAP43過量表達可引起神經(jīng)元異常重組的自發(fā)形成。在注射海人酸致大鼠癇性發(fā)作后2個月，在齒狀回內(nèi)分子層可出現(xiàn)較強的GAP43染色，與用Timm染色在內(nèi)分子層檢出的苔蘚纖維出芽有關7。本研究用RTPCR檢測海馬神經(jīng)可塑性標志物GAP43，結(jié)果顯示模型組大鼠GAP43 mRNA表達明顯高于對照組，提示海馬有苔蘚纖維出芽和新突觸的形成，說明發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作后可引起遠期海馬突觸重組及神經(jīng)元可塑性的改變。本實驗結(jié)果說明，未成熟腦經(jīng)過反復癇性發(fā)作后導致遠期海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等海馬神經(jīng)元可塑性改變，而GAP43可能是這種可塑性變化的分子基礎。學習記憶是一個復雜的過程，癲癇對學習記憶功能損害的確切機制還不清楚。神經(jīng)系統(tǒng)的突觸可塑性是學習記憶功能的基礎，大量研究證明，改變突觸可塑性形成機制可影響學習和記憶，且在學習記憶的相關腦區(qū)可見突觸重塑8。本實驗發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作后引起認知功能障礙可能與海馬神經(jīng)元之間形成異常的突觸聯(lián)系，建立病理性神經(jīng)環(huán)路等神經(jīng)元可塑性的改變有關。模型組大鼠學習記憶功能損害的同時，海馬組織GAP43過度表達，猜測GAP43可能通過改變突觸形態(tài)結(jié)構(gòu)的可塑性以及由LTP和LTD所引發(fā)的突觸效能的可塑性,來參與體內(nèi)學習記憶過程中的一系列環(huán)節(jié),它們對于突觸可塑性的作用是一個綜合、復雜的過程,其內(nèi)在機制仍有待進一步深入研究。研究突觸可塑性的分子機制,對揭示學習和記憶的神經(jīng)基礎有重要意義?？傊?，本實驗結(jié)果提示發(fā)育期大鼠反復癇性發(fā)作后可導致遠期學習記憶損害及海馬神經(jīng)元激活和突觸重建等神經(jīng)可塑性改變，提醒人們應該關注早期腦發(fā)育中反復癇性發(fā)作的長期結(jié)果。嬰幼兒時期大腦處于不斷生長發(fā)育、功能逐步完善的動態(tài)變化之中，神經(jīng)元可塑性較大，是各種腦損傷康復治療的最佳時期。但海馬齒狀回神經(jīng)元的再生過程和機制尚不清楚，目前認為受眾多因素的調(diào)節(jié)和影響。本實驗結(jié)果提示GAP43可能參與了神經(jīng)元再生過程的調(diào)節(jié)，可能是學習記憶功能和可塑性變化的分子機制，為嬰幼兒時期癇性發(fā)作腦損傷后康復治療提供了新的思路。而GAP43具體的表達調(diào)控機制，有待更深入的研究。【參考文獻】 1Loviter R S.Status epilepticusinduced neuronal injury and network reorganizationJ.Epilepsia，1999，40(Suppl 1)：S34S39.2Hussenet F，Boyet S，Nehlig A.Longterm metabolic effects of pentylenetetrazolinduced status epilepticus in the immature ratJ.Neuroscience，1995，67(2)：455461.3Lado F A,Sperber E F,Moshé S L.Anticonvulsant efficacy of gabapentin on kindling in the immature brainJ.Epilepsia,2001,42(4):458463.4黃亞玲，孫丹，劉亞黎.戊四氮反復點燃致不同發(fā)育期大鼠海馬損傷的病理改變J.中華兒科雜志，2005，43(12)：930934.5Bomze H M,Bulsar