青霉素生產(chǎn)工藝操作手冊(cè).doc

青霉素生產(chǎn)仿真用戶手冊(cè)青霉素生產(chǎn)使用手冊(cè)北京東方仿真技術(shù)有限公司2007年5月目錄第一章 背景知識(shí)51.1 青霉素的發(fā)現(xiàn)51.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)51.3青霉素的單位61.4作用機(jī)理61.5青霉素的應(yīng)用7第二章 發(fā)酵工藝過(guò)程72.1 菌種介紹72.2 菌種的保藏72.3 孢子的制備82.4 種子制備82.5 發(fā)酵培養(yǎng)基介紹82.6 滅菌102.7 發(fā)酵102.7.1發(fā)酵的過(guò)程控制102.7.2防止染菌的要點(diǎn)122.7.3空氣系統(tǒng)的要求122.7.4蒸汽系統(tǒng)的要求12第三章 提煉工藝過(guò)程133.1發(fā)酵液預(yù)處理133.2提取133.3精制153.3.1 脫色和去熱原質(zhì)153.3.2 結(jié)晶153.4成品鑒定163.5成品分裝16第四章 主要工藝指標(biāo)17第五章 主要設(shè)備列表及仿真操作設(shè)備19第六章 操作規(guī)程216.1發(fā)酵工藝過(guò)程216.1.1正常發(fā)酵（過(guò)程）216.1.2出料226.1.3發(fā)酵過(guò)程中PH值低226.1.4發(fā)酵過(guò)程中PH值高226.1.5發(fā)酵過(guò)程中溶解氧低226.1.6殘?zhí)菨舛鹊?26.1.7發(fā)酵過(guò)程中溫度高226.1.8泡沫高226.2提煉工藝過(guò)程226.2.1預(yù)處理操作236.2.2一次BA萃取操作236.2.3一次反萃取操作246.2.4二次BA萃取操作246.2.5脫色罐操作256.2.6結(jié)晶罐及抽濾、干燥操作25第七章 主要操作畫(huà)面277.1青霉素工藝流程界面277.2菌種介紹界面287.3孢子制備界面287.4種子制備界面297.5滅菌界面297.6培養(yǎng)基制備界面307.7發(fā)酵工藝操作界面307.8發(fā)酵罐操作界面317.9菌種曲線界面317.10預(yù)處理界面327.11提取流程總貌327.12一次BA萃取界面337.13精制流程總貌337.14脫色操作界面347.15結(jié)晶操作界面347.16抽濾、干燥操作界面357.17成品鑒定界面357.18成品分裝界面36第一章 背景知識(shí)1.1 青霉素的發(fā)現(xiàn)1928年，英國(guó)細(xì)菌學(xué)家Fleming發(fā)現(xiàn)污染在培養(yǎng)葡萄球菌的雙蝶上的一株霉菌能殺死周圍的葡萄球菌。他將此霉菌分離純化后得到的菌株經(jīng)鑒定為點(diǎn)青霉，并將這菌所產(chǎn)生的抗生物質(zhì)命名為青霉素。1940年，英國(guó)Florey和Chain進(jìn)一步研究此菌，并從培養(yǎng)液中制出了干燥的青霉素制品。經(jīng)實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)證明，它毒性很小，并對(duì)一些革蘭氏陽(yáng)性菌所引起的許多疾病有卓越的療效。1.2青霉素分類及分子結(jié)構(gòu)青霉素是6氨基青霉烷酸（6-aminopenicillanic acid, 6-APA）苯乙酰衍生物。側(cè)鏈基團(tuán)不同，形成不同的青霉素，主要是青霉素G。工業(yè)上應(yīng)用的有鈉、鉀、普魯卡因、二芐基乙二胺鹽。青霉素發(fā)酵液中含有5種以上天然青霉素（如青霉素F、G、X、K、F和V等），它們的差別僅在于側(cè)鏈R基團(tuán)的結(jié)構(gòu)不同，其中青霉素G在醫(yī)療中用得最多，它的鈉或鉀鹽為治療革蘭氏陽(yáng)性菌的首選藥物，對(duì)革蘭氏陰性菌也有強(qiáng)大的抑制作用。青霉素的結(jié)構(gòu)通式可表示為1.3青霉素的單位目前國(guó)際上青霉素活性單位表示方法有兩種：一是指定單位（unit）；二是活性質(zhì)量（g），最早為青霉素規(guī)定的指定單位是：50mL肉湯培養(yǎng)基中恰能抑制標(biāo)準(zhǔn)金葡萄菌生長(zhǎng)的青霉素量為一個(gè)青霉素單位。在以后，證明了一個(gè)青霉素單位相當(dāng)于0.6g青霉素鈉。因此青霉素的質(zhì)量單位為: 0.6g青霉素鈉等于1個(gè)青霉素單位。由此，1mg青霉素鈉等于1670個(gè)青霉素單位(unit)。1.4作用機(jī)理已有的研究認(rèn)為，青霉素的抗菌作用與抑制細(xì)胞壁的合成有關(guān)。細(xì)菌的細(xì)胞壁是一層堅(jiān)韌的厚膜，用以抵抗外界的壓力，維持細(xì)胞的形狀。細(xì)胞壁的里面是細(xì)胞膜，膜內(nèi)裹著細(xì)胞質(zhì)。細(xì)菌的細(xì)胞壁主要由多糖組成，也含有蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。革蘭氏陽(yáng)性菌細(xì)胞壁的組成是肽聚糖占細(xì)胞壁干重的5080（革蘭氏陰性菌為110）、磷壁酸質(zhì)、脂蛋白、多糖和蛋白質(zhì)。其中肽聚糖是一種含有乙酰基葡萄糖胺和短肽單元的網(wǎng)狀生物大分子，在它的生物合成中需要一種關(guān)鍵的酶即轉(zhuǎn)肽酶。青霉素作用的部位就是這個(gè)轉(zhuǎn)肽酶。現(xiàn)已證明青霉素內(nèi)酞胺環(huán)上的高反應(yīng)性肽鍵受到轉(zhuǎn)肽酶活性部位上絲氨酸殘基的羥基的親核進(jìn)攻形成了共價(jià)鍵，生成青霉噻唑?；?酶復(fù)合物，從而不可逆的抑制了該酶的催化活性。通過(guò)抑制轉(zhuǎn)肽酶，青霉素使細(xì)胞壁的合成受到抑制，細(xì)菌的抗?jié)B透壓能力降低，引起菌體變形，破裂而死亡。1.5青霉素的應(yīng)用臨床應(yīng)用：40多年，主要控制敏感金黃色葡糖球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、淋球菌、腦膜炎雙球菌、螺旋體等引起感染，對(duì)大多數(shù)革蘭氏陽(yáng)性菌（如金黃色葡萄球菌）和某些革蘭氏陰性細(xì)菌及螺旋體有抗菌作用。優(yōu)點(diǎn)：毒性小，但由于難以分離除去青霉噻唑酸蛋白（微量可能引起過(guò)敏反應(yīng)），需要皮試。各種半合成抗生素的原料：青霉素的缺點(diǎn)是對(duì)酸不穩(wěn)定，不能口服，排泄快，對(duì)陰性菌無(wú)效。氨芐青霉素耐酸廣譜；對(duì)抗綠膿桿菌的磺芐青霉素，耐酸、耐酶、口服的乙氧萘青霉素等。提供頭孢菌素母核。第二章 發(fā)酵工藝過(guò)程2.1 菌種介紹 青霉是產(chǎn)生青霉素的重要菌種。廣泛分布于空氣、土壤和各種物上，常生長(zhǎng)在腐爛的柑桔皮上呈青綠色。目前已發(fā)現(xiàn)幾百種，其中產(chǎn)黃青霉(Penicillum chrysogenum)、點(diǎn)青霉(Penicillum nototum)等都能大量產(chǎn)生青霉素。青霉素的發(fā)現(xiàn)和大規(guī)模地生產(chǎn)、應(yīng)用，不僅對(duì)抗生素工業(yè)的發(fā)展起了巨大的推動(dòng)作用，而且加上其他抗生素的廣泛使用，比如像磺胺藥物，使人類的平均壽命，再次延長(zhǎng)了四歲。此外，有的青霉菌還用于生產(chǎn)灰黃霉素及磷酸二酯酶、纖維素酶等酶制劑和有機(jī)酸。1981年報(bào)導(dǎo)，癘孢青霉是纖維素酶的新來(lái)源，它能分解棉花纖維。2.2 菌種的保藏菌種的保藏方法有：斜面菌種低溫保藏法、砂土管保藏法、甘油封藏法、真空冷凍干燥法。斜面菌種低溫保藏法 利用低溫對(duì)微生物生命活動(dòng)有抑制作用的原理進(jìn)行保藏。把斜面菌種、固體穿刺培養(yǎng)物或菌懸液等，直接放入45冰箱中。保藏時(shí)間一般不超過(guò)3個(gè)月，到時(shí)必須進(jìn)行移接傳代，再放回冰箱。砂土管保藏法 將干燥砂粒與細(xì)土混合后滅菌制成砂土管，然后接種保藏。若把砂土管放在低溫或抽氣后密封，效果更佳。此法適用于產(chǎn)孢子及芽孢菌種的保藏。保藏期110年。甘油封藏法 向培養(yǎng)好的菌種斜面上，加入滅菌甘油，高出斜面1cm，然后蠟封管口，放入冰箱。該法既可防止培養(yǎng)基水分蒸發(fā)，又能使菌種與空氣隔絕。保藏期12年。真空冷凍干燥法 是目前比較理想的一種方法。在低于-15下，快速將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后 在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中，微生物的生長(zhǎng)和代謝都暫時(shí)停止，不易發(fā)生變異，故可長(zhǎng)時(shí)間保存，一般為510年，最多可達(dá)15年之久。此法兼?zhèn)淞?低溫、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以保存較長(zhǎng)時(shí)間，但過(guò)程較麻煩，需要一定的設(shè)備。2.3 孢子的制備這是發(fā)酵工序的開(kāi)端，是一個(gè)重要環(huán)節(jié)?？股禺a(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。生產(chǎn)用的孢子需經(jīng)過(guò)純種和生產(chǎn)能力的檢驗(yàn)，符合規(guī)定的才能用來(lái)制備種子。保藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無(wú)菌手續(xù)接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長(zhǎng)的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面。對(duì)于產(chǎn)孢子能力強(qiáng)的及孢子發(fā)芽、生長(zhǎng)繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基孢子，孢子可直接作為中子罐的種子。2.4 種子制備種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過(guò)程，其目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。種子罐級(jí)數(shù)是在指制備種子需逐級(jí)擴(kuò)大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長(zhǎng)特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素種子制備一般為二級(jí)種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)。2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基介紹培養(yǎng)基是供微生物生長(zhǎng)繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長(zhǎng)、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。碳源的主要作用是：為微生物菌種的生長(zhǎng)繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目的產(chǎn)物提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國(guó)家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過(guò)一定限度時(shí)，會(huì)過(guò)分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致pH下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長(zhǎng)河產(chǎn)物的合成。氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進(jìn)一步合成青霉素。主要有機(jī)氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣及氧的傳遞，因而利用率較高。固體有機(jī)氮源原料一般需粉碎至200目以下的細(xì)度。有機(jī)氮源還可以提供一部分有機(jī)磷，供菌體生長(zhǎng)。無(wú)機(jī)氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。碳酸鈣用來(lái)中和發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的pH值，為菌體提供營(yíng)養(yǎng)的無(wú)機(jī)磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。由于現(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過(guò)程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液。發(fā)酵時(shí)間愈長(zhǎng)，則鐵離子愈多。鐵離子在50g/ml以上便會(huì)影響青霉素的合成。采用鐵絡(luò)合劑以抑制鐵離子的影響，但實(shí)際對(duì)青霉素產(chǎn)量并無(wú)改進(jìn)。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反應(yīng)。添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素G的生產(chǎn)強(qiáng)度，添加苯氧乙酸則產(chǎn)生青霉素V。因此前體的加入成為青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問(wèn)題之一。但苯乙酸對(duì)發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點(diǎn)是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營(yíng)養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價(jià)格較貴。前體要在發(fā)酵開(kāi)始20h后加入，并在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中控制在50g/ml左右由于在發(fā)酵過(guò)程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機(jī)氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會(huì)產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個(gè)好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑（如聚酯、聚醇類消沫劑）代替豆油。2.6 滅菌“滅菌”指的是用化學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。滅菌實(shí)質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶化、消失的現(xiàn)象。工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過(guò)濾除菌等幾種。在青霉素的生產(chǎn)中，對(duì)培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過(guò)濾除菌的方法。2.7 發(fā)酵這一過(guò)程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開(kāi)始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過(guò)滅菌，后接入種子。接種量一般為520%。發(fā)酵周期一般為45天，但也有少于24小時(shí)，或長(zhǎng)達(dá)二周以上的。在整個(gè)過(guò)程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時(shí)間取樣進(jìn)行生化分析和無(wú)菌試驗(yàn)，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生情況和有無(wú)雜菌污染。2.7.1發(fā)酵的過(guò)程控制1、碳源控制：青霉菌能利用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄糖也是比較好的碳源，但必須控制其加入的濃度，因?yàn)槠咸烟且妆痪w氧化并產(chǎn)生抑制抗生素合成酶形成的物質(zhì)，從而影響青霉素的合成，所以可以采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G的側(cè)鏈前體。菌體對(duì)前體的利用有兩個(gè)途徑：直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中或作為養(yǎng)料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。前體究竟通過(guò)哪個(gè)途徑被菌體利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。通過(guò)比較苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取決于培養(yǎng)基的pH和前體的濃度。堿性時(shí)，苯乙酰胺有毒；酸性時(shí)，苯乙酸毒性較大；中性時(shí)，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體用量大于0.1%時(shí)，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在0.1%為宜。在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速率隨培養(yǎng)基pH上升而增加。年幼的菌絲不氧化前體，而僅利用它來(lái)構(gòu)成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力逐漸增加。培養(yǎng)基成分對(duì)前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對(duì)前體的氧化量少。為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產(chǎn)上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。 2、pH控制：在青霉素發(fā)酵過(guò)程中，pH是通過(guò)下列手段控制的：如pH過(guò)高，則添加糖、硫酸或無(wú)機(jī)氮源；若pH過(guò)低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。另外，也可利用自動(dòng)加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液pH維持在6.87.2，以提高青霉素產(chǎn)量。 3、溫度控制：青霉菌生長(zhǎng)的適宜溫度為30，而分泌青霉素的適宜溫度是20左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在271左右；二級(jí)種子的培養(yǎng)溫度控制在251左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在26左右；發(fā)酵后期的溫度控制在24左右。 4、補(bǔ)料控制：發(fā)酵過(guò)程中除以中間補(bǔ)糖控制糖濃度及pH外，補(bǔ)加氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)試驗(yàn)證實(shí)：若在發(fā)酵6070h開(kāi)始分次補(bǔ)加硫酸銨，則在90h后菌絲含氮量幾乎不下降，維持在6%7%，且60%70%的菌絲處于年幼階段，菌絲呼吸強(qiáng)度維持在二氧化碳量近30l/（mg菌絲h），抗生素產(chǎn)率為最高水平的30%40%；而不加硫酸銨的對(duì)照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為7%，以后逐級(jí)下降。至發(fā)酵結(jié)束時(shí)為4%。發(fā)酵結(jié)束時(shí)呼吸強(qiáng)度降至二氧化碳量為16l/（mg菌絲h），且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量?jī)H為試驗(yàn)罐的1/2。因此，為了延長(zhǎng)發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過(guò)程分次補(bǔ)加氮源也是有效的措施。5、鐵離子的影響：三價(jià)鐵離子對(duì)青霉素生物合成有顯著影響，一般若發(fā)酵液中鐵離子含量超過(guò)3040g/ml，則發(fā)酵單位增長(zhǎng)緩慢。鐵離子對(duì)產(chǎn)黃青霉綠色孢子合成青霉素的影響見(jiàn)下表。因此鐵罐在使用前必須進(jìn)行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹(shù)脂等保護(hù)層，使鐵離子含量控制在30g/ml以下。 2.7.2防止染菌的要點(diǎn) 染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實(shí)現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。影響染菌的因素很多，而且?guī)щS機(jī)性質(zhì)，但只要認(rèn)真對(duì)待，過(guò)細(xì)地工作，染菌是可以防止的。請(qǐng)到左邊的導(dǎo)航欄里選擇查看防止染菌的要點(diǎn)的內(nèi)容。 2.7.3空氣系統(tǒng)的要求 防止空氣帶菌主要是提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，防止空氣夾帶油和水及空氣過(guò)濾器失效。提高空壓機(jī)進(jìn)口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強(qiáng)空氣的壓縮前過(guò)濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強(qiáng)去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進(jìn)入空氣系統(tǒng)。 2.7.4蒸汽系統(tǒng)的要求 重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動(dòng)，保證生產(chǎn)時(shí)所用的蒸汽壓力在3035千帕以上。 1、連續(xù)滅菌設(shè)備：連消塔結(jié)構(gòu)要求簡(jiǎn)單，易于拆裝和清理，操作時(shí)蒸汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。 2、發(fā)酵罐：發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門(mén)都必須保證嚴(yán)密度。 3、無(wú)菌室：用超凈工作臺(tái)及凈化室代替無(wú)菌室，以提高無(wú)菌程度。 第三章 提煉工藝過(guò)程3.1發(fā)酵液預(yù)處理發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價(jià)無(wú)機(jī)離子（Fe2+、Ca2+、Mg2+）和蛋白質(zhì)在離子交換的過(guò)程中對(duì)提煉影響甚大，不利于樹(shù)脂對(duì)抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提煉時(shí)，蛋白質(zhì)的存在會(huì)產(chǎn)生乳化，使溶媒合水相分離困難。對(duì)高價(jià)離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如加磷酸（或磷酸鹽），既能降低鈣離子濃度，也利于去除鎂離子。Na5P3O10 + Mg2+=MgNa3P3O1 0+ 2Na+加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質(zhì)。此外，兩者還有協(xié)同作用。他們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對(duì)蛋白質(zhì)有吸附作用。2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2ZnFe(CN)62 + 2Na+為了有效的去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，需加入絮凝劑。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。含有很多離子化基團(tuán)（如NH2，COOH，OH）。3.2提取化學(xué)提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成品。由于發(fā)酵液中青霉素濃度很低，僅0.14.5%左右，而雜質(zhì)濃度比青霉素的高幾十倍甚至幾千倍，并且某些雜質(zhì)的性質(zhì)與抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。發(fā)酵液中常見(jiàn)的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、預(yù)處理需要加入的雜質(zhì)等。在提煉過(guò)程中要遵循下面四個(gè)原則：1、時(shí)間短2、溫度低3、pH適中4、勤清洗消毒常用的提取方法有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。 1、溶媒萃取法 這是利用抗生素在不同的pH值條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)（游離態(tài)、堿或鹽）存在時(shí)，在水及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使抗生素從一種液相（如發(fā)酵濾液）轉(zhuǎn)移到另一種液相（如有機(jī)溶媒）中去，以達(dá)到濃縮和提純的目的。利用此原理就可借助于調(diào)節(jié)pH值得方法時(shí)抗生素從一個(gè)液相中被提取到另一液相中去。所選用的溶媒與水應(yīng)是互不相溶或僅很小部分互溶，同時(shí)所選溶媒在一定的pH下對(duì)于抗生素應(yīng)有較大的溶解度和選擇性，方能用較少量的溶媒使提取完全，并在一定程度上分離掉雜質(zhì)。 2、離子交換法 利用離子交換樹(shù)脂和抗生素之間的化學(xué)親和力，有選擇性的將抗生素吸附上去，然后以較少量的洗脫劑將它洗下來(lái)。 3、沉淀法 是一種分離抗生素簡(jiǎn)單而經(jīng)濟(jì)的方法，濃縮倍數(shù)高，因而也是很有效的方法。 青霉素的提取采用溶媒萃取法。青霉素游離酸易溶于有機(jī)溶劑，而青霉素鹽易溶于水。利用這一性質(zhì)，在酸性條件下青霉素轉(zhuǎn)入有機(jī)溶媒中，調(diào)節(jié)pH，再轉(zhuǎn)入中性水相，反復(fù)幾次萃取，即可提純濃縮。選擇對(duì)青霉素分配系數(shù)高的有機(jī)溶劑。工業(yè)上通常用醋酸丁酯和戊酯。萃取23次。從發(fā)酵液萃取到乙酸丁酯時(shí)，pH選擇2.8-3.0，從乙酸丁酯反萃到水相時(shí)，pH選擇6.8-7.2。為了避免pH波動(dòng)，采用硫酸鹽、碳酸鹽緩沖液進(jìn)行反萃。所得濾液多采用二次萃取，用10%硫酸調(diào)pH2.83.0，加入醋酸丁酯。在一次丁酯萃取時(shí)，由于濾液含有大量蛋白，通常加入破乳劑防止乳化。第一次萃取，存在蛋白質(zhì)，加0.05-0.1%乳化劑PPB。 3.3精制這是青霉素生產(chǎn)的最后工序。對(duì)產(chǎn)品進(jìn)行精制、烘干和包裝的階段要符合“藥品生產(chǎn)管理規(guī)范”的規(guī)定。3.3.1 脫色和去熱原質(zhì)脫色和去熱原質(zhì)是精制注射用青霉素中不可缺少的一步。色素是在發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物，它與菌種和發(fā)酵條件有關(guān)。熱原質(zhì)是在生產(chǎn)過(guò)程中由于被污染后雜菌所產(chǎn)生的一種內(nèi)毒素。生產(chǎn)中一般用活性炭脫色去熱原質(zhì)，但需注意脫色時(shí)pH、溫度、活性炭用量及脫色時(shí)間等因素，還應(yīng)考慮它對(duì)抗生素的吸附問(wèn)題，否則影響收率。3.3.2 結(jié)晶抗生素精制常用結(jié)晶法來(lái)制得高純度成品。常用的幾種結(jié)晶方法有：1、改變溫度結(jié)晶 利用抗生素在溶劑中的溶解度隨溫度變化而顯著變化的這一特性來(lái)進(jìn)行結(jié)晶。2、利用等電點(diǎn)結(jié)晶 當(dāng)將某一抗生素溶液的pH調(diào)到等電點(diǎn)時(shí)，它在水溶液中溶解度最小，則沉淀析出。3、加成鹽劑結(jié)晶 在抗生素溶液中加成鹽劑使抗生素以鹽的形式從溶液中能夠沉淀結(jié)晶。青霉素鈉鹽在醋酸丁酯中溶解度很小，利用此性質(zhì)，再二次醋酸丁酯萃取液中加入醋酸鈉乙醇溶液，并控制溫度青霉素鈉鹽就結(jié)晶析出。反應(yīng)如下：醋酸丁酯中含水量過(guò)高會(huì)影響收率，但可提高晶體純度。水分在0.9%以下對(duì)收率影響較小。得到的晶體要求顆粒均勻，有一定的細(xì)度。顆粒太細(xì)會(huì)使過(guò)濾、洗滌困難。晶體經(jīng)丁醇洗滌，真空干燥即可等到成品。3.4成品鑒定成品鑒定是根據(jù)藥典的要求逐項(xiàng)進(jìn)行分析，包括效價(jià)鑒定、毒性試驗(yàn)、無(wú)菌檢查、熱源質(zhì)試驗(yàn)、水分測(cè)定、水溶液酸堿度及混濁度測(cè)定、結(jié)晶顆粒的色澤及大小的測(cè)定等。對(duì)于藥典上未有規(guī)定的新抗生素，則可參照相近抗生素，按經(jīng)驗(yàn)規(guī)定一些指標(biāo)。酸堿度檢測(cè) 取本品，加水制成每1ml 中含30mg的溶液，測(cè)定。 pH值應(yīng)為5.0 7.5 。溶液的澄清度與顏色 取樣品0.3g，加水5ml使溶解，溶液應(yīng)澄清無(wú)色；如顯渾濁，與濁度標(biāo)準(zhǔn)液比較，均不得更濃；如顯色，與黃色或黃綠色標(biāo)準(zhǔn)比色液比較，均不得更深。吸光度 取樣品，加水制成每1ml 中含1.80mg的溶液，在280nm 的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，不得大于0.10；在264nm的波長(zhǎng)處有最大吸收，吸光度應(yīng)為0.800.88。細(xì)菌內(nèi)毒素 取樣品測(cè)定，每100青霉素單位中含內(nèi)毒素的量應(yīng)小于0.01EU。無(wú)菌 取樣品，用青霉素酶法滅活后或用適宜溶劑溶解后，轉(zhuǎn)移至不少于500ml的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液中，用薄膜過(guò)濾法處理后測(cè)定。效價(jià)測(cè)定 取本品適量，精密稱定，加水溶液并定量稀釋制成每1ml中約含0.5mg的溶液，搖勻，精密量取10l，注入液相色譜儀，記錄色譜圖；另取青霉素對(duì)照品適量，同法測(cè)定。按外標(biāo)以峰面積計(jì)算，其結(jié)果乘以1.0658，即為本品效價(jià)。每1mg相當(dāng)于1670青霉素單位。3.5成品分裝抗生素產(chǎn)品一般分裝為大包裝的原料藥，以供制劑廠進(jìn)行小包裝或制劑加工。也有一些抗生素工廠在無(wú)菌條件下用自動(dòng)分裝機(jī)進(jìn)行小瓶分裝。 第四章 主要工藝指標(biāo)編號(hào)指標(biāo)推薦值發(fā)酵罐1糖濃度5kg/m32氨氮含量0.250.3kg/m33PH值68-724溫度255攪拌轉(zhuǎn)速150-250rpm6溶氧濃度30%7前體濃度1kg/m38發(fā)酵液中硫氨濃度0.25kg/m39發(fā)酵罐壓力0.07MPa一次BA萃取1醋酸丁酯（BA）用量青霉素溶液的1/32PH值2.8-3.03破乳劑用量100kg4、重相液位80%一次反萃取1碳酸氫鈉用量青霉素溶液的2.52PH值6.8-7.23重相液位80%二次BA萃取1醋酸丁酯（BA）用量青霉素溶液的1/32PH值2.8-3.03重相液位80%脫色罐1活性炭用量25kg結(jié)晶罐1結(jié)晶溫度52丁醇用量500kg3青霉素鈉鹽晶體效價(jià)1670u/ml第五章 主要設(shè)備列表及仿真操作設(shè)備編號(hào)名稱備注1發(fā)酵罐發(fā)酵罐容量為170000kg，主要部件有罐體、攪拌器、擋板、軸封、空氣分布器、傳動(dòng)裝置、冷卻管、視鏡等。2進(jìn)料泵加入基質(zhì)3空氣系統(tǒng)含消毒、冷卻、過(guò)濾。4計(jì)量泵一（加氨水）操作時(shí)有開(kāi)關(guān)、調(diào)節(jié)及入罐處泵門(mén)三處要操作5計(jì)量泵二（加前體）同上6計(jì)量泵三（加消沫劑）同上7加菌種按鈕點(diǎn)擊后自動(dòng)按比例增加一次菌種8預(yù)處理罐容量為12600kg。9轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾器轉(zhuǎn)筒真空過(guò)濾機(jī)是一種連續(xù)操作的過(guò)濾機(jī)械，廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)中。設(shè)備的主體是一個(gè)能轉(zhuǎn)動(dòng)的水平圓筒，其表面有一層金屬網(wǎng)，網(wǎng)上覆蓋濾布，筒的下部浸入濾漿中，如圖3-24所示。圓筒沿徑向分隔成若干扇形格，每格都有單獨(dú)的孔道通至分配頭上。圓筒轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)，憑藉分配頭的作用使這些孔道依次分別與真空管及壓縮空氣管相通，因而在回轉(zhuǎn)一周的過(guò)程中每個(gè)扇形格表面即可順序進(jìn)行過(guò)濾、洗滌、吸干、吹松、卸餅等項(xiàng)操作。10混合罐容量為17000kg。11分離機(jī)在離心力作用下，將兩種密度不同且不相容的溶液分離，輕相由頂部溢流而出，重相由底部排出。12脫色罐容量為17000kg。13活性炭進(jìn)料按鈕點(diǎn)擊“進(jìn)料閥”按鈕，打開(kāi)進(jìn)料閥，點(diǎn)擊“選擇進(jìn)料量”按鈕，輸入進(jìn)料量，然后點(diǎn)擊“進(jìn)料”按鈕，完成進(jìn)料步驟14結(jié)晶罐冷卻結(jié)晶罐，容量為14000kg，有攪拌裝置，使結(jié)晶顆粒保持懸浮于溶液中，并同溶液有一個(gè)相對(duì)運(yùn)動(dòng)，提高溶質(zhì)質(zhì)點(diǎn)的擴(kuò)散速度，加速晶體長(zhǎng)大。15真空抽濾機(jī)通過(guò)抽真空，使晶體與濾液分離16洗滌罐容量為1200。17移出晶體按鈕點(diǎn)擊“移出晶體”按鈕，可以將晶體18真空干燥機(jī)真空干燥機(jī)是一種在真空條件下操作的接觸式干燥過(guò)程，與常壓干燥相比，真空干燥溫度低，水分可在較低的溫度下氣化蒸發(fā)，不需要空氣作為干燥介質(zhì)，減少空氣與物料的接觸機(jī)會(huì)，故適用于熱敏性和在空氣中易氧化物料的干燥。19輸入時(shí)間系統(tǒng)點(diǎn)擊時(shí)間顯示屏，彈出一個(gè)對(duì)話框，輸入時(shí)間，然后點(diǎn)擊“確定”按鈕，進(jìn)入倒計(jì)時(shí)狀態(tài)。第六章 操作規(guī)程6.1發(fā)酵工藝過(guò)程6.1.1正常發(fā)酵（過(guò)程）1、 進(jìn)料(基質(zhì))，開(kāi)備料泵 2、 開(kāi)備料閥 3、 備料后（罐重100000KG）關(guān)備料閥 4、 關(guān)備料泵 5、 開(kāi)攪拌器 6、 設(shè)置攪拌轉(zhuǎn)速為200轉(zhuǎn) 7、 開(kāi)通風(fēng)閥 8、 開(kāi)排氣閥 9、 投加菌種 10、 補(bǔ)糖，開(kāi)補(bǔ)糖閥 11、 補(bǔ)氮，開(kāi)加硫銨閥 12、 開(kāi)冷卻水，維持溫度在25 13、 PH值保持在一定范圍內(nèi) 14、 前體超過(guò)1KG/M3（扣分步驟，出現(xiàn)則扣分）6.1.2出料1、 停止進(jìn)空氣 2、 停攪拌 3、 關(guān)閉所有進(jìn)料，開(kāi)閥出料 6.1.3發(fā)酵過(guò)程中PH值低調(diào)節(jié)PH值開(kāi)大氨水流量 PH值指標(biāo) 6.1.4發(fā)酵過(guò)程中PH值高關(guān)閉進(jìn)氨水 開(kāi)大補(bǔ)糖閥 調(diào)節(jié)PH值 6.1.5發(fā)酵過(guò)程中溶解氧低開(kāi)大進(jìn)空氣閥V02 調(diào)節(jié)溶解氧大于30% 6.1.6殘?zhí)菨舛鹊烷_(kāi)加糖閥補(bǔ)糖 6.1.7發(fā)酵過(guò)程中溫度高開(kāi)通冷卻水進(jìn)水冷卻 溫度指標(biāo) 6.1.8泡沫高添加消泡劑 泡沫高度降低到30CM 6.2提煉工藝過(guò)程6.2.1預(yù)處理操作1、 打開(kāi)閥V14，加發(fā)酵液。2、 待加料至5000kg時(shí)，關(guān)閉閥V14。3、 打開(kāi)預(yù)處理罐攪拌器4、 打開(kāi)閥V13，加黃血鹽，去除鐵離子。5、 觀察鐵離子濃度變化，待鐵離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V13。6、 打開(kāi)閥V12，加磷酸鹽，去除鎂離子。7、 觀察鎂離子濃度變化，鎂離子濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V12。8、 打開(kāi)閥V11，加絮凝劑，去除蛋白質(zhì)。9、 觀察蛋白質(zhì)濃度變化，蛋白質(zhì)濃度為零時(shí)，關(guān)閉閥V11。10、 打開(kāi)閥V16、V17及泵P5，同時(shí)打開(kāi)轉(zhuǎn)筒過(guò)濾器開(kāi)關(guān)及后閥V18。11、 待發(fā)酵液經(jīng)過(guò)濾排至混合罐B101后，關(guān)閉閥V16、V17、泵P5以及轉(zhuǎn)筒過(guò)濾器開(kāi)關(guān)及后閥V18。12、 停止預(yù)處理罐攪拌器。6.2.2一次BA萃取操作1、 打開(kāi)混合罐B101攪拌器2、 打開(kāi)閥V19，加BA（醋酸丁酯）質(zhì)量為發(fā)酵液的1/41/3倍。3、 關(guān)閉閥V19。4、 打開(kāi)閥V22，加稀硫酸調(diào)節(jié)PH值。5、 待PH值調(diào)節(jié)至23時(shí)，關(guān)閉閥V22。6、 打開(kāi)閥V21，加破乳劑。7、 加破乳劑量為100kg時(shí)，關(guān)閉閥V21。8、 打開(kāi)閥V23、V24及泵P6，向分離機(jī)注液。9、 待分離機(jī)中有液位時(shí)，迅速打開(kāi)A101開(kāi)關(guān)。10、 打開(kāi)萃余相回收閥V26，調(diào)節(jié)V26閥門(mén)開(kāi)度，控制重相液位在總液位的80%左右，使輕相液能充分的溢流至B102。11、 待混合罐B101液體排空后，關(guān)閉閥V23、V24及泵P6。12、 停止混合罐B101攪拌器。13、 待分離機(jī)A101中液體排盡后，關(guān)閉閥V26。14、 關(guān)閉分離機(jī)A101開(kāi)關(guān)6.2.3一次反萃取操作1、 打開(kāi)混合罐B102攪拌器。2、 打開(kāi)V28，加碳酸氫鈉溶液，質(zhì)量為青霉素溶液的34倍，并調(diào)節(jié)PH值為783、 待PH值調(diào)節(jié)至78時(shí)，關(guān)閉閥V28。4、 打開(kāi)閥V29、V30及泵P7，向分離機(jī)A102注液。5、 待分離機(jī)A102中有液位時(shí)，迅速打開(kāi)A102開(kāi)關(guān)。6、 打開(kāi)萃余相回收閥V32，調(diào)節(jié)V32閥門(mén)開(kāi)度，控制重相液位在總液位的80%左右，輕相液能充分的溢流出。7、 待混合罐B102液體排空后，關(guān)閉閥V29、V30及泵P7。8、 停止混合罐B102攪拌器。9、 待分離機(jī)中剩余少許重液時(shí)，關(guān)閉閥V32，防止輕液流入混合罐