碳氮代謝測(cè)定.doc

谷氨酰胺合成酶（GS）和谷氨酸脫氫酶（GDH）是碳氮代謝的關(guān)鍵酶。淀粉酶，轉(zhuǎn)化酶，硝酸還原酶，谷氨酰胺合成酶活性測(cè)定原理 谷氨酰胺合成酶（GS）是植物體內(nèi)氨同化的關(guān)鍵酶之一，在ATP 和M g 2+ 存在下，它催化植物體內(nèi)谷氨酸形成谷氨酰胺。在反應(yīng)體系中，谷氨酰胺轉(zhuǎn)化為谷氨?；惲u肟酸，進(jìn)而在酸性條件下與鐵形成紅色的絡(luò)合物，該絡(luò)合物在540nm 處有最大吸收峰，可用分光光度計(jì)測(cè)定。谷氨酰胺合成酶活性可用產(chǎn)生的谷氨?；惲u肟酸與鐵絡(luò)合物的生成量來(lái)表示，單位molmg 1 proteinh 1 。也可間接用540nm 處吸光值的大小來(lái)表示，單位Amg 1 proteinh 1 。 【儀器與用具】 冷凍離心機(jī)；分光光度計(jì)；天平；研缽；恒溫水??；剪刀；移液管（2 ml、1ml）。 【試劑】 提取緩沖液： 0.05mol/L Tris-HCl，pH8.0，內(nèi)含2mmol/L Mg 2+ ，2mmol/L DTT，0.4 mol/L 蔗糖。稱取Tris（三羥甲基氨基甲烷）1.5295g，0.1245g MgSO 4 7 H 2 O，0.1543g DTT（二硫蘇糖醇）和34.25g 蔗糖，去離子水溶解后，用0.05 mol/L HCl 調(diào)至pH8.0，最后定容至250ml； 反應(yīng)混合液A（0.1mol/L Tris-HCl 緩沖，pH7.4）： 內(nèi)含80mmol/L Mg 2+ ，20mmol/L 谷氨酸鈉鹽，20mmol/L 半胱氨酸和2 mmol/L EGTA，稱取3.0590g Tris，4.9795 gMgSO 4 7H 2 O, 0.8628g 谷氨酸鈉鹽，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去離子水溶解后，用0. 1mol/L HCl 調(diào)至pH7.4，定容至250ml； 反應(yīng)混合液B（含鹽酸羥胺，pH7.4）： 反應(yīng)混合液A 的成分再加入80mmol/L 鹽酸羥胺，pH7.4； 顯色劑（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl 3 和0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA（三氯乙酸），10.1021g FeCl 3 6H 2 O，去離子水溶解后，加5ml 濃鹽酸，定容至100ml； 40mmol/L ATP 溶液：0.1210g ATP 溶于5ml 去離子水中（臨用前配制）。 【方法】 1.粗酶液提取 稱取植物材料1g 于研缽中，加3ml 提取緩沖液，置冰浴上研磨勻漿，轉(zhuǎn)移于離心管中，4下15,000g 離心20min，上清液即為粗酶液。 2.反應(yīng) 1.6ml 反應(yīng)混合液B，加入0.7ml 粗酶液和0.7ml ATP 溶液，混勻，于37下保溫半小時(shí)，加入顯色劑1ml，搖勻并放置片刻后，于 5,000g 下離心10min，取上清液測(cè)定540nm 處的吸光值，以加入1.6ml 反應(yīng)混合液A 的為對(duì)照。 3.粗酶液中可溶性蛋白質(zhì)測(cè)定 取粗酶液0.5ml，用水定容至100ml，取2ml 用考馬斯亮藍(lán)G-250 測(cè)定可溶性蛋白質(zhì)（見實(shí)驗(yàn)28）。 4.原始數(shù)據(jù)記載 5.結(jié)果計(jì)算： GS 活力(Amg 1 proteinh 1 ) 式中 A540nm 處的吸光值； P粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V反應(yīng)體系中加入的粗酶液體積（ml）； T反應(yīng)時(shí)間（h）。 蔗糖合成酶的測(cè)定方法一、儀器設(shè)備冷凍離心機(jī)、恒溫水浴、分光光度計(jì)二、試劑HEPES-NaOH（50mmol/L，pH7.5）緩沖液，包括50mmol/L MgCI2；2mmol/LEDTA；0.2%(W/V)BSA；2%PVP；0.1%間苯二酚：稱取0.1g溶解并定溶于100ml 95%乙醇中。30%鹽酸、2mol/L NaOH、100mmol/L UDPG、100mmol/L6-磷酸果糖、100mmol/L果糖三、操作方法1、粗酶液制備稱取0.5g樣品（植物葉片去掉主葉脈），洗凈剪碎，置于預(yù)冷的研缽中，加3ml Hepes-NaOH緩沖液，冰浴研磨，10000g離心10min。2、酶活性測(cè)定依次加入 50L粗酶液，50LHepes-NaOH緩沖液pH7.5，20L 50 mmol/LMgCI2，20L 100mmol/L UDPG，20L 100mmol/L6-磷酸果糖（20L 100mmol/L果糖），30中反應(yīng)30min后，加入200L 2mol/L NaOH終止反應(yīng)，沸水煮10min，流水冷卻，加入1.5ml 30%鹽酸和0.5ml 0.1% 間苯二酚，搖勻后置于80水浴保溫10min，冷卻后置于480nm處，以提前殺死酶活性為空白比色測(cè)定蔗糖含量。同時(shí)取50L粗酶液，加入200L 2mol/L NaOH，以下同上操作，測(cè)定蔗糖含量。3、蔗糖標(biāo)線制作：取0、40、80、120、160、200g/ml的蔗糖溶液50L，操作同上，然后以蔗糖濃度為縱坐標(biāo)，以吸光值為橫坐標(biāo)，得方程。4、計(jì)算樣品中酶活性（gg1h1）= 式中 C反應(yīng)液催化產(chǎn)生的蔗糖總量（g）； V1提取酶液時(shí)加入的緩沖液體積（ml）； V2酶反應(yīng)時(shí)加入的粗酶液體積（ml）淀粉酶活性的測(cè)定1方法1.1試劑配制淀粉酶提取緩沖液：0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6);1%的淀粉溶液：用0.1mol/L-1的檸檬酸緩沖液(pH 5.6)配制；標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液(1mg/mL-1);3,5-二硝基水楊酸試劑(DNS試劑):稱取6.5 g 3,5-二硝基水楊酸溶于少量水中，移入1000 mL容量瓶中，加入325 mL 2molL-1 NaOH溶液，再加入45g丙三醇，搖勻，冷卻后定容到1000 mL。淀粉和麥芽糖為Sigma產(chǎn)品，其余試劑為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?.2測(cè)定方法1.2.1酶液的提取 將每一個(gè)重復(fù)的3個(gè)果實(shí)去皮后切碎混勻，稱取其果肉1g，置于預(yù)冷的研缽中，加2mL預(yù)冷的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH5.6)和少量石英砂研磨，將勻漿移入7mL的離心管中，再分別用1mL的0.1mol/L-1檸檬酸緩沖(pH 5.6)沖洗2次,于4下以15000g離心15min，上清液轉(zhuǎn)移入另一個(gè)5mL離心管中，作為酶提取液備用。1.2.2酶活性的測(cè)定取潔凈的試管18支，作標(biāo)記，每一個(gè)樣品設(shè)1個(gè)對(duì)照?？偡磻?yīng)體積為0.5mL，測(cè)定管含0.2mL的酶提取液和0.3mL的1%淀粉溶液；對(duì)照管含0.2 mL的酶提取液和0.3mL的0.1mol/L-1檸檬酸溶液(pH 5.6,不含底物淀粉)將試管放入恒溫40的水浴鍋中，保溫30min后取出，立即加入1.5mL的DNS試劑終止反應(yīng)再將試管置于沸水浴中10min，取出后冰浴冷卻。取反應(yīng)液稀釋10倍，測(cè)定波長(zhǎng)520nm處的吸光值，同上做麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出麥芽糖的含量，計(jì)算淀粉酶的總活性。周蓓云.-和-淀粉酶活性的測(cè)定.見：中國(guó)科學(xué)院上海植物生理研究所，上海市植物生理學(xué)會(huì)編.現(xiàn)代植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)指南.北京：科學(xué)出版社，1999.123124轉(zhuǎn)化酶的測(cè)定轉(zhuǎn)化酶又稱蔗糖酶，是一種水解酶，植物體的庫(kù)組織中，一般含有較高活性的轉(zhuǎn)化酶，它能將植物體內(nèi)的主要同化產(chǎn)物蔗糖不可逆的水解為葡萄糖和果糖，為細(xì)胞的可溶性糖貯庫(kù)提供可利用六碳糖，以用于細(xì)胞壁、貯藏多糖及果聚糖的生物合成，并通過(guò)與呼吸作用偶聯(lián)的氧化磷酸化產(chǎn)生能量，所以，轉(zhuǎn)化酶與植物組織的生長(zhǎng)有密切關(guān)系，是衡量同化產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化和利用、植物細(xì)胞代謝及生長(zhǎng)強(qiáng)度的指標(biāo)。試劑：1、10%蔗糖溶液2、葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（500g/ml）3、0.05mol/l的磷酸緩沖液4、（DNS）3，5二硝基水楊酸：將6.3g二硝基水楊酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸鉀鈉的熱水溶液中，再加5g結(jié)晶酚和5g亞硫酸鈉，攪拌溶解，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，貯于棕色瓶中備用。方法：1、酶的提?。?g樣品剪碎后，用預(yù)冷的蒸餾水在冰浴中研磨成勻漿，定容至100ml，在冰箱中浸提3小時(shí)，4000轉(zhuǎn)離心15分鐘，上清液即為酶的粗提液。2、酶活性的測(cè)定：吸酶液2ml，放入試管中，再加入pH6.0的緩沖液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保溫30分鐘，取出后立即按3，5二硝基水楊酸法測(cè)定還原糖的含量。以煮沸酶液10分鐘鈍化酶的試管作對(duì)照。3、還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及還原糖含量的測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線：取6支20ml刻度試管，編號(hào)，按下表配置不同濃度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液：管號(hào)123456葡萄糖原液量（ml）00.40.81.21.62.0加蒸餾水量（ml）2.01.61.20.80.40葡萄糖濃度（g/ml）0100200300400500在上述各管中分別加入1.5ml 3，5二硝基水楊酸試劑，在沸水浴中加熱5分鐘，取出后立即放入盛有冷水的燒杯中冷卻至室溫，加蒸餾水定容至20ml，混勻，以1號(hào)管為空白，測(cè)540nm波長(zhǎng)下的OD值。以O(shè)D值為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。酶反應(yīng)液中還原糖的含量的測(cè)定：吸取2ml反應(yīng)液，加入1.5ml 3，5二硝基水楊酸試劑，沸水浴中煮沸5分鐘，冷卻定容至20ml ，測(cè)定540nm波長(zhǎng)下的OD值，查標(biāo)準(zhǔn)曲線得酶反應(yīng)液中還原糖的濃度。4、結(jié)果計(jì)算：A=(N-N)*V/(T*W*1000)A：轉(zhuǎn)化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反應(yīng)液中還原糖的濃度(g/ml)N：鈍化酶反應(yīng)液中還原糖的濃度(g/ml) V：酶反應(yīng)液的總體積T：反應(yīng)時(shí)間 W：材料鮮重 試劑：谷氨酰胺合