免疫比濁法測C反應蛋白

精品文檔免疫比濁法是抗原抗體結合動態(tài)測定方法。其基本原理是：當抗原與抗體在特殊稀釋系統(tǒng)中反應而且比例合適(一般規(guī)定抗體過量)時，形成的可溶性免疫復合物在稀釋系統(tǒng)中的促聚劑（聚乙二醇等）的作用下，自液相析出，形成微粒，使反應液出現(xiàn)濁度。當抗體濃度固定時，形成的免疫復合物的量隨著檢樣中抗原量的增加而增加，反應液的濁度也隨之增加。通過測定反應液的濁度與一系列標準品對照，即可計算出檢樣中抗原的含量?？贵w（Ab）與可溶性抗原（Ag）反應，形成一定結構的免疫復合物，成為懸浮于反應溶液中的微粒。在沉淀反應中形成的復合物微粒具有特殊的光學性質(zhì)，可用儀器檢測，提高了檢測的速度、靈敏度和易操作性。 免疫比濁測定注意事項： 1、抗原或抗體量大大過剩，可出現(xiàn)可溶性復合物，造成誤差。 2、應維持反應管中抗體蛋白始終過剩。 3、易受到脂血的影響。分類1.免疫透射比濁法 抗原抗體結合后，形成免疫復合物，在一定時間內(nèi)復合物聚合出現(xiàn)濁度。當光線通過溶液時，可被免疫復合物吸收。免疫復合物量越多，光線吸收越多。光線被吸收的量在一定范圍內(nèi)與免疫復合物的量成正比。利用比濁計測定光密度值，復合物的含量與光密度值成正比，同樣當抗體量一定時，光密度值也與抗原含量成正比。本法較單向瓊脂擴散試驗和火箭電泳等一般免疫化學定量方法敏感、快速簡便，但要求免疫復合物的數(shù)量和分子量達到一定高度，否則就難以測出。 2.免疫散射比濁法 一定波長的光沿水平軸照射，通過溶液使遇到抗原抗體復合物粒子，光線被粒子顆粒折射，發(fā)生偏轉(zhuǎn)，光線偏轉(zhuǎn)的角度與發(fā)射光的波長和抗原抗體復合物顆粒大小和多少密切相關。散射光的強度與復合物的含量成正比，即待測抗原越多，形成的復合物也越多，散射光也越強。散射光的強度還與各種物理因素，如加入抗原或抗體的時間、光源的強弱和波長、測量角度等密切相關。散射比濁法又分為速率散射比濁法和終點散射比濁法。 3.免疫膠乳比濁法 膠乳比濁法即是將待測物質(zhì)相對應的抗體包被在直徑為1560nm的膠乳顆粒上，使抗原抗體結合物的體積增大，光通過之后，透射光和散射光的強度變化更為顯著，從而提高試驗的敏感性。實驗八 免疫比濁法測定C-反應蛋白【原理】血清C反應蛋白（CRP）與試劑中抗人CRP抗體結合，形成免疫復合物，一起吸光度增加，在波長340nm和700nm處測定免疫復合物濁度。根據(jù)吸光度增加量，即可定量檢測血清中CRP的含量?！驹噭?0.1 mol/L的Tris緩沖液。2羊抗人CRP抗血清。3CRP定標液?！静僮鞑襟E】 見表8-1。表8-1 免疫比濁法測定C反應蛋白操作步驟加入物空白管標準管測定管血清標本(l)15CRP定標液(l)15生理鹽水(l)15緩沖液(l)350350350混合，于37保溫5 min，在波長340nm和700nm處讀各管吸光度(A1340、A1700)抗人CRP抗血清 (l)505050混合，于37保溫5 min，在波長340nm和700nm處讀各管吸光度(A2340、A2700)【計算】 HDL-C含量 (mmol/L) 標準液濃度A(A2340A2700)(A1340A1700)【參考范圍】血清C反應蛋白4mg/L(各實驗室應有自己的參考范圍)【注意事項】1使用新鮮血清，并盡可能快地檢測。2試劑不能冷凍保存?！九R床意義】CRP是一種急性相蛋白，肝臟是其主要的合成器官。最近研究表明，人體其他部位如冠狀動脈平滑肌細胞、神經(jīng)元細胞、血管內(nèi)皮細胞、脂肪細胞、腎小管上皮細胞等在炎癥刺激或病理狀態(tài)下都能合成和分泌CRP。正常情況下，CRP以微量存在于健康人的血清中，但在機體有細菌感染、組織損傷、腫瘤形成等急性相刺激時，CRP水平可升至正常的100倍甚至更高。測定CRP對于鑒別感染、監(jiān)測疾病活動情況及嚴重程度、器質(zhì)性疾病的篩檢、監(jiān)測器官移植受體排斥反應及療效觀察、冠心病等急性血管意外事件的預測與診治等有很好的導向作用?！驹u價】CRP的檢測方法從靈敏度較低的免疫擴散法、火箭電泳法、膠乳凝集試驗到高靈敏度、高精密度的放射免疫、酶免疫、免疫比濁等定量試驗。多數(shù)情況下，半定量的膠乳凝集試驗適合于篩查，但其影響因素多、靈敏度較差和不能精確定量。對于需作較精確的CRP定量測定，免疫濁度法較為合適。其他方法如ELISA、免疫發(fā)光法和化學發(fā)光法雖然靈敏度和精確度都較高，但其成本也較高,故不是理想的臨床實驗室的常規(guī)方法。1材料與方法1.1兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳的制備1.1.1兔抗人白蛋白抗體的制備采用25人血漿白蛋白注射液，按常規(guī)免疫新西蘭純種白兔，獲得兔抗人白蛋白免疫血清（效價1:32），經(jīng)飽和硫酸銨沉淀后，過DE52層析柱，IgG峰部洗脫液用Follin酚法于540nm處定量測定IgG蛋白含量，并用聚丙烯酰胺凝膠圓盤電泳鑒定，僅出現(xiàn)一條區(qū)帶。1.1.2兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳的制備取10羧化聚苯乙烯膠乳懸液（軍事醫(yī)學科學院動物中心產(chǎn)品，=0.6m），用pH8.2甘氨酸緩沖液（GBS）稀釋成1濃度，將其于兔抗人白蛋白IgG按適當比例混合，以常規(guī)物理吸附法致敏膠乳2。1.2敏感性試驗取25人血漿白蛋白20l，加入生理鹽水180l，再經(jīng)系列稀釋成10個濃度，其濃度范圍在25mg/ml3.125ng/ml之間，用兔抗人免疫羧化膠乳做3次重復檢測。1.3特異性試驗將牛、馬、羊、豚鼠血清分別稀釋至5、2.5和1.25，用兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳檢測。1.4重復性試驗用四批兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳，對5份糞微量白蛋白陽性糞便標本和2份已知濃度白蛋白溶液平行檢測，并在有效期內(nèi)用同一批免疫羧化膠乳先后7次重復檢測，同時設陰性對照。3討論兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳試劑對糞微量白蛋白的檢測，是針對糞便中由于病變部位出血后的血漿蛋白，或組織滲出液中的白蛋白。而檢測糞微量白蛋白作為大腸腫瘤的篩檢手段之一，最早是在1987年，日本中山拓郎等曾用ELISA法對糞潛白蛋白（Occultalbmin）進行定量檢測，并認為其敏感性優(yōu)于便潛血。1993年，我們制備和建立了兔抗人白蛋白免疫羧化膠乳試劑和反向膠乳凝集試驗，檢測了378例已知患者和正常人糞便標本，其臨床結果顯示：56例大腸癌診斷敏感性55.4，特異性82.6；132例正常人陽性率17.4。近來我們增加了已知患者數(shù)量，重新檢測了161例正常人糞微量白蛋白，結果表明：在增加受檢人數(shù)后，提高了大腸癌的診斷敏感性（76.8），而特異性則無顯著差別（80.0）；161例正常人陽性率為19.2，比原來的132例正常人陽性率高1.8。實驗結果顯示：在受檢人數(shù)增多的情況下，用該試劑檢測糞微量白蛋白可能會達到提高診斷敏感性，保持特異性的良好效果。C-反應蛋白檢測試劑盒（全量程）試制工作總結一、概 述C反應蛋白（C-reactive protein）是一種能與肺炎鏈球菌C多糖體反應形成復合物的急性時相反應蛋白，半衰期19小時；血清CRP由肝臟合成，白細胞介素1b、6以及腫瘤壞死因子是其合成的最重要的調(diào)節(jié)因子；CRP的分子量為105 500，由含有五個相同的未糖基化的多肽亞單位組成，每個亞單位含有187個氨基酸，這些亞單位間通過非共價鍵連結成環(huán)狀的五聚體，并有一個鏈間二硫鍵。1930年，Tillett和Francis首次在急性大葉性肺炎患者的血清中發(fā)現(xiàn)一種能 在Ca2+存在時與肺炎球菌細胞壁中的C多糖發(fā)生特異性沉淀反應的物質(zhì)。1941年， Avery等測知它是一種蛋白質(zhì)，故稱為C反應蛋白(CRP)。1944年，Jones將其作為臨床風濕熱診斷標準的次要指標之一。后來，人們在非感染性疾病和感染性疾病患者的急性期血清中都測到了CRP，于是人們認為，CRP是組織損傷的一種非特異性反應。進一步研究發(fā)現(xiàn)：病毒或細菌感染、梗塞、免疫復合物沉積等因素都可導致組織損傷。在組織損傷的急性期，肝臟合成的一些血漿蛋白顯著增加，這些蛋白質(zhì)通稱為急性時相蛋白，其中CRP是急性時相蛋白中變化最顯著的一種。CRP在正常人血清中其含量極微；在組織受到損傷、炎癥、感染或腫瘤破壞時CRP可以在數(shù)小時內(nèi)急劇上升，可增高數(shù)倍或數(shù)百倍，2-3天達峰值，待病情改善時逐漸下降，恢復正常。CRP被廣泛應用于臨床疾病的早期診斷及鑒別診斷，其升高可見于：1、組織損傷、感染、腫瘤、心肌梗塞及一系列急慢性炎癥性疾病，如風濕性關節(jié)炎、全身性血管炎、多肌痛風濕病；2、術后感染及并發(fā)癥的指標：手術后病人CRP升高，術后710天CRP水平應下降，如CRP不降低或再次升高，提示可能并發(fā)感染或血栓栓塞；3、可作為細菌性感染和病毒性感染的鑒別診斷：大多數(shù)細菌性感染會引起患者血清CRP升高，而病毒性感染則多數(shù)不升高。 超敏C反應蛋白（ High sensitivity C-reactive protein）與CRP并不是兩種蛋白，只是從靈敏度上加以區(qū)分, 超敏C反應蛋白(Hs-CRP)最低檢測限達0.1 mg/l; 原先認為CRP是正常的血清卻發(fā)現(xiàn)同未來發(fā)生心血管疾病密切相關,大量研究資料表明,動脈粥樣化的血栓去除了是脂肪堆積的過程外也是一個慢性炎癥過程,；Hs-CRP輕度升高與冠狀動脈事件、中風及周圍血管病相關，是一項獨立的危險因素； HS-CRP已被證實是由慢性炎癥引發(fā)心血有較高的靈敏度但線性較低，這樣就出現(xiàn)了一種試劑兩種名稱，用途也有所區(qū)別；近幾年來，隨著檢驗技術的發(fā)展，開始出現(xiàn)了一種全量程CRP，這種CRP即能滿足較高的靈敏度，又能滿足較高的線性，如日本一化，申索佑福等，我公司通過與中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程CRP的試制，經(jīng)公司自檢與醫(yī)院試用，結果表明與免疫散射比濁法一致性好；公司已計劃于近期完成臨床與注冊，正式推向市場；二、國內(nèi)外研究情況2.1臨床研究CRP作為一種急性時相反應蛋白，被廣泛應用于臨床。2.1.1用于細菌和病毒感染的鑒別診斷當細菌感染引發(fā)炎癥，在炎癥進程開始47小時就可開始升高，且升高的幅度與細菌感染的嚴重程度相一致，病毒感染時CRP不增高，以此鑒別感染的性質(zhì)，指導臨床治療，減少不管疾病的獨立危險因素，檢測其濃度對心血管疾病的干預及預后起重要作用而被臨床重視。流行病學調(diào)查也顯示,hs-CRP 水平升高者發(fā)生急性腦卒中的幾率是正常健康人的2 倍, 發(fā)生心肌梗死的幾率是正常者的3 倍 。2003 年歐洲高血壓防治指南( ESH/ESC) 正式推薦, 高血壓患者需檢測hs-CRP 水平。 目前國內(nèi)用于全自動生化儀的免疫透射比濁法試劑CRP出現(xiàn)了兩種（普通CRP與超敏CRP），普通CRP有較高的線性但靈敏度不好，超敏CRP必要的抗生素治療，有效防止抗生素的濫用。這些感染臨床上常見于肺炎、支氣管炎、咽喉炎、細菌性腦膜炎、傷寒、化膿性關節(jié)炎、尿路感染、骨盆炎、闌尾炎等等。在鑒別細菌或病毒感染方面，比白細胞計數(shù)及分類計數(shù)更準確，特別是老年人，免疫系統(tǒng)反應順應性下降，可能有感染發(fā)生但臨床上并無發(fā)熱、白細胞升高等情況，此時檢測CRP有助于檢出細菌感染。2.1.2腫瘤監(jiān)測CRP的測定用于腫瘤的治療和預后：CRP術前上升,術后下降，不受放療、化療和皮質(zhì)激素治療的影響，有助于臨床評估腫瘤的進程。2.1.3監(jiān)控病情變化及術后感染，并用于抗生素療效觀察CRP在血中升高的幅度與感染的程度正相關。有研究表明，術后6小時左右，CRP開始升高，如無并發(fā)癥應在術后三天下降直至正常，如術后出現(xiàn)感染，則CRP長時間不下降；術前CRP升高者，術后感染率也遠高于術前CRP不高者。對于燒傷病人，可檢測CRP以警示是否發(fā)生敗血癥，以便及時應對治療。對疑有敗血癥的新生兒，在2448小時內(nèi)作CRP的動態(tài)監(jiān)測，可作為是否停止抗生素治療的可靠依據(jù)，而血培養(yǎng)的時間則需更長，培養(yǎng)結果出來之前無法排除敗血癥。對細菌感染作抗生素治療時，動態(tài)檢測CRP是必要的，它比臨床體征更早作出并發(fā)癥警報和治療效果的判定，在粒細胞缺乏癥或機體免疫狀態(tài)抑制時更有臨床意義。2.1.4用于評估急性胰腺炎的嚴重程度 入院時CRP110mg/l，可能是出血性胰腺炎（臨床靈敏度，特異性）；當CRP250mg/l時,可提示為廣泛性壞死性胰腺炎。2.1.5風濕病類風濕性關節(jié)炎患者CRP與疾病相關性較大，比臨床癥狀出現(xiàn)要早4-6周。2.1.6肺部感染肺炎在年老人群中較難診斷，通常不大有發(fā)熱。在許多情況下100mg/l，提示細菌感染，如肺炎或化膿性支氣管炎。典型的病毒性肺炎不會超過50mg/l。2.1.7兒科感染性疾病：在兒童急性淋巴細胞白血病常發(fā)性細菌敗血癥，CRP超過100mg/ L,則視為有細菌感染;兒童CRP細菌性腦膜炎時平均195mg/L，而病毒性腦膜炎則低得多。2.1.8腎臟移植排異移值后8天CRP下降至正常，如發(fā)生排斥反應則血清肌酐、尿氮、CRP皆升高。CRP升高在排斥反應發(fā)生之前4天出現(xiàn)。但是，感染也可發(fā)生CRP升高，要注意兩者鑒別。2.1.9 心血管疾病隨著檢驗技術的發(fā)展,原先認為CRP是正常的血清卻發(fā)現(xiàn)同未來發(fā)生心血管疾病密切相關,大量研究資料表明,動脈粥樣化的血栓去除了是脂肪堆積的過程外也是一個慢性炎癥過程,；CRP輕度升高與冠狀動脈事件、中風及周圍血管病相關，是一項獨立的危險因素； 未來發(fā)生心血管疾病發(fā)病率和死亡率的預測指標Hs-CRP是健康人未來發(fā)生心血管事件一個有價值的預測指標，許多研究證實Hs-CRP能預測首次心肌梗死和疾病的發(fā)作，內(nèi)科健康研究（PHS）顯示，Hs-CRP位于最高四分位數(shù)的病人未來發(fā)生卒中危險增加2倍，未來發(fā)生心肌梗死危險增加3倍，未來發(fā)生周圍血管疾病的危險增加4倍。這種預測作用長期穩(wěn)定存在于吸煙和非吸煙者中，且獨立于其他危險因素。Hs-CRP是已知CHD病人未來心血管病發(fā)病和死亡的預測指標，歐洲ECTA研究組的資料顯示，穩(wěn)定性心絞痛（SAP）和不穩(wěn)定性心絞痛（UAP）病人Hs-CRP濃度每升高一個標準差，非致命性心肌梗死或心臟性猝死的相對危險增加45%。 急性冠脈綜合癥（ACS）的預后指標Hs-CRP測定對ACS的預后價值，首先是在急性局部缺血和不穩(wěn)定心絞痛的病人中提出的，重度不穩(wěn)定型心絞痛（UAP）病人入院時若Hs-CRP3mg/l 比Hs-CRP3mg/l 者心絞痛復發(fā)、冠狀動脈血管置換術、心肌梗死和心血管疾病致死等心血管事件發(fā)生率高；出院時測Hs-CRP比入院時測能更好的預測90天的不良后果；檢測Hs-CRP有助于鑒別心肌鈣蛋白（cTn）陰性而病死率增高的病人,應聯(lián)合合使用cTn與Hs-CRP來評估ACS危險程度,ACS病人入院時Hs-CRP5mg/l 與半年內(nèi)嚴重心臟病發(fā)病率升高相關,而不管cTn值如何。 與TC/HDL-C聯(lián)合預測冠心病危險在冠心病的危險性研究評估時, Hs-CRP與血脂指標是獨立的變量,將兩者同時檢測并聯(lián)合分析,在諸多變量分析過程中,記錄諸多冠心病危險因素如肥胖高血壓糖尿病冠心病家族史等，各種生化指標中僅Hs-CRP與TC/HDL-C有單獨的預測價值,兩者聯(lián)合意義更大。 2.2國內(nèi)外試劑盒發(fā)展CRP的測定方法較多，一般分為定性與定量兩種。定性方法有：用純化了的肺炎球菌C-組分與病人血清反應的沉淀法、肺炎球菌莢膜腫脹試驗、特異性抗血清與CRP反應的毛細管沉淀試驗、補體結合試驗、乳膠凝集試驗、乳膠擴散沉淀試驗等，但它們的靈敏度低，只用于定性檢測。定量檢測的有：放射免疫(RIA)、熒光免疫(FIA)、酶標免疫(ELISA) 、速率散射比濁法（INA）、膠乳增強透射比濁法（ITA）； 定性與定量相結合的方法有：快速檢測卡結合儀器法；其中放射法對人傷輻射傷害較大，已較少使用，熒光免疫(FIA)或化學發(fā)光需專用儀器且成本高，ELISA法多數(shù)為半自動操作，出結果慢，不適合批量檢測；速率散射比濁法（INA）需與比濁儀搭配使用，增加了儀器成本；快速檢測卡結合儀器法只是半定量試劑，不能準確定量；膠乳增強透射比濁法（ITA）是目前醫(yī)院較多使用的方法之一。目前國內(nèi)有兩種試劑，即普通CRP與超敏CRP，一個項目，兩種試劑，給用戶帶來了不便；隨著檢驗技術的發(fā)展，近幾年已出現(xiàn)了一種即有高線性又有高靈敏度的試劑，即全量程CRP，目前國外已有Orion公司、日本一化，申索佑福等公司推出了此種試劑，我公司通過與中科院上海生物研究所合作，近期已完成全量程CRP的試制，經(jīng)公司自檢與醫(yī)院試用，結果表明與免疫散射比濁法一致性好；公司已計劃于近期完成臨床與注冊，正式推向市場；全量程CRP即有普通CRP的高線性，又有超敏CRP的高靈活敏度，因此，CRP即可作炎癥標志物，也可用作Hs-CRP用于心血管疾病的預測與預后。三、試制過程目前，測定CRP的方法有很多，定性或半定量方法由于不是準確定量，已較少使用；定量方法放射免疫(RIA)、熒光免疫(FIA)、酶標免疫(ELISA) 、速率散射比濁法（INA）、膠乳增強透射比濁法（ITA）等中以后兩種使用較多；目前國外已有Orion公司、日本一化，申索佑福等推出了膠乳增強透射比濁法試劑，國內(nèi)大多為進口試劑，我公司通過與中科院上海生研所合作，已完成小樣制備，并計劃于近期報批上市。3.1原理與試劑成份血漿中的CRP與試劑中膠乳包被的特異性抗體相結合，形成抗原抗體復合物產(chǎn)生混濁;在一定的抗體濃度范圍內(nèi),其濁度高低與血清CRP含量成正比。通過測定特定波長的吸光度值，查標準曲線即可求出血清中CRP的含量。試劑成份： 磷酸鹽 100mM 表面活性劑復合抗體當光線通過個渾濁介質(zhì)溶液時,由于溶液中存在混濁顆粒,光線被吸收了一部分,吸收的多少與混濁顆粒的量成正比,這種測定光吸收量的方法稱為透射比濁法。因有抗原抗體反應，固稱為免疫透射比濁法，為增強靈敏度，采用膠乳增強免疫比濁法?？乖c抗體在一定條件下才能形成復合物，一定條件包括： 抗體的要求抗體要求效價高（保持高線性），純度高（如不純，則有可能含其它抗體而有非特反應從而導致結果偏高），親和力要強（親和力強生成的抗原抗體復合物才穩(wěn)定，不易解離） 抗原抗體比例要求免疫復合物形成有三個階段，第一階段是形成抗原抗體復體物，第二階段是復合物交聯(lián)形成大網(wǎng)格結構，第三階段是復合物聚合而形成沉淀。只有在抗體過量時，其濁度才會隨著CRP的增加面增加，若抗原過剩則會出現(xiàn)HOOK效應而導致結果偏低而不準； 促進劑與穩(wěn)定劑一般要求溶液中有非離子性親水性多聚體促進免疫復合物的形成，如PEG6000，含量3-4%。PH一般在6.5-8.0之間,過酸過堿均會破壞試劑中抗體與樣本中的抗原。3.2 膠乳的選擇與制備 由于測定用的波長與粒徑大小有關,因此粒徑的均一性是影響測量精密度與均確度的一個重要因素。公司選用聚苯乙烯膠乳，聚苯乙烯膠乳用乳液聚合法制備小分子納米（25-50nm），采用微孔過濾技術，保證顆粒大小的一致性，小分子納米顆粒較一般顆粒（100-300nm）顆粒更小，不易發(fā)生自沉；過濾后的膠乳進行羧化，使羧基均勻分布于膠乳的表面。再把羧化的膠乳與D-二聚體抗體結合，結合方式包含物理吸附與化學交聯(lián)兩種，以增強抗原捕獲能力，縮短反應時間，整過反應過程在3-5分鐘內(nèi)結束，且化學交聯(lián)后形成的抗原抗體復合物更緊密，不易解離，結果更準確，精密度更好。表一、小分子納米技術與化學交聯(lián)技術應用后的D-二聚體的精密度與準確度XSDCv(%)批內(nèi)（n=20）1.50.064.0012322.44批間（n=20）1.40.053.571231.61.30靶值測量值偏差相對偏差質(zhì) 控12.02.150.157.5%質(zhì) 控2109.620.383.8%質(zhì) 控3136138.52.51.84%膠乳粒子在100-300nm時，膠乳顆粒易自沉，造成瓶間差批間差過大，而且由于粒徑過大，造成反應為非均相反應，CV變異較大，我公司采用創(chuàng)新的小分子納米技術，大大的延長了定標有效期，縮小了瓶間差與批間差，為真正意義上的均相反應。表二、膠乳粒徑與定標有效期、瓶間CV、批間CV等關系膠乳粒徑（nm）定標有效期（天）是否均相反應是否自沉100-3007-14非均相自沉25-5028均相均相分布，不自沉批內(nèi)CV（%），N=20瓶間CV（%），N=20批間CV（%），N=20100-3004.55.56.825-502.83.04.1普通膠乳只通過物理吸附抗體，形成共價交聯(lián)，共價交聯(lián)結合相對不牢靠，而且吸附的抗體較少，會造成試劑線性偏或靈敏度低；我公司采用物理吸附的共價交聯(lián)與化學交聯(lián)相結合技術（化學交聯(lián)通過縮合劑炭化二亞胺將膠乳上的羧基與交聯(lián)物上的氨基縮合在一起），大大提高了試劑的穩(wěn)定性與靈敏度；表三、不同交聯(lián)膠乳試劑靈敏度與試劑穩(wěn)定性共價交聯(lián)穩(wěn)定6個月靈敏度較低反應慢，復合物不太穩(wěn)定化學交聯(lián)穩(wěn)定9個月靈敏度高反應快，復合物穩(wěn)定共價+化學交聯(lián)穩(wěn)定12個月靈敏度高反應快，復合物很穩(wěn)定3.3抗體的選擇與純化抗體的純度對測定的特異性有直接影響。不純的抗體將導致非特異反應，引起結果假性升高，測量值不準等情況。因此必須采用單克隆抗體與親和層析技術純化的抗體，并用SDS-PAGE鑒定純度，如出現(xiàn)多條電泳帶，則多明雜蛋白較多，需更進一步純化； 公司CRP抗體采用羊抗人多克克隆抗體與鼠抗人單克隆抗體的復合抗體，采用山羊或鼠體內(nèi)誘生法產(chǎn)生，產(chǎn)生的腹水用濾紙過濾，去除脂質(zhì)與大顆粒，再用離心的方法去除細胞碎片和大的蛋白質(zhì)，制成粗抗體；將粗抗原或純化抗原交聯(lián)到瓊脂糖珠SEPHAROSE 4B制成親和層析柱,將粗抗體通過親和層析柱,洗去未結合的非特異性蛋白,再用硫氰酸鉀洗脫,洗脫流出液即為純的多克隆抗體?？贵w的效價：要求效價至少大于1：16，效價為抗體能引起濁度變化的最大稀釋倍數(shù)，公司采用的復合抗體中羊抗人多克克隆抗體效價大于1:16, 鼠抗人單克隆抗體效價大于1:128;多抗保證線性與高值,單抗保證靈敏度與低值;抗體的保存：凍干抗體具有穩(wěn)定性好，保質(zhì)期長等特點，適合于長期保存，配成試劑后可加適量甘油與BSA作穩(wěn)定劑；多克隆抗體、單克隆抗體等復合抗體技術即保證了靈敏度與高線性，與普通CRP與超敏CRP兩種試劑等效，方便了醫(yī)院操作；親和層析技術的應用，大大提高了抗體的純度與效價，最大限度避免了非特異性反應，使結果準確性有了較大提高，精密度更好；表四、親和層析與復合抗體技術應用后D-二聚體的精密度與準確度XSDCv(%)批內(nèi)（n=20）1.50.053.331232.62.11批間（n=20）1.40.064.01253.02.4靶值測量值偏差相對偏差質(zhì) 控122.080.084%質(zhì) 控21010.30.33%質(zhì) 控3136134-21.5%34微孔濾膜孔徑的選擇 試劑的穩(wěn)定性因素主要有膠乳抗體的純度,緩沖液的品質(zhì),試劑中的懸浮小顆粒,此小顆粒肉眼看不到,漂浮于試劑中,影響光的吸收,且用常規(guī)過濾無法去除,其主要成份為雜質(zhì)、短纖維和細菌，這是導致瓶間與批間差大的原因之一。由于普通膠乳顆粒采用100-300nm，所以只能用常規(guī)過濾，無法去除雜質(zhì)，我公司由于采用小分子納米（20-50nm）技術，可以采用特殊微膜過濾，通過過濾膜孔徑的研究發(fā)現(xiàn)，小孔徑過濾可以顯著改善試劑的精密度，延長定標穩(wěn)定期，縮小批間差；表五、濾膜孔徑與變異系數(shù)，定標有效期的關系（n=20）孔徑（m）0.250.450.60.81.01.2CV（%）3.24.55.15.67.58.2定標有效期（天）281410875當孔徑在1m 時，基本可以除去一般的雜質(zhì)微粒，當孔徑在0.45m 時，基本可以除去短小纖維,當孔徑在0.25m 時，基本可以除細菌等微生物;實驗表明當孔徑在0.22m時 延長定標穩(wěn)定期，縮小批間差,可能與去除細菌有關,試劑更穩(wěn)定;35穩(wěn)定劑、保護劑的選擇與優(yōu)化膠乳溶液介于小分子離子溶液與粗分散體系之間，