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免疫組化的經(jīng)驗總結(jié)（1）常見問題 生 物 谷 網(wǎng) 站 免疫組織化學的概念： 免疫組化是利用抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑 (熒光素、酶、金屬離子、同位素) 顯色來確定組織細胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對其進行定位、定性及定量的研究，稱為免疫組織化學。免疫組化實驗中常用的抗體為單克隆抗體和多克隆抗體。免疫組化實驗所用的組織和細胞標本有哪些？實驗所用主要為組織標本和細胞標本兩大類，前者包括石蠟切片（病理大片和組織芯片）和冰凍切片，后者包括組織印片、細胞爬片和細胞涂片。其中石蠟切片是制作組織標本最常用、最基本的方法，對于組織形態(tài)保存好，且能作連續(xù)切片，有利于各種染色對照觀察；還能長期存檔，供回顧性研究；石蠟切片制作過程對組織內(nèi)抗原暴露有一定的影響，但可進行抗原修復，是免疫組化中首選的組織標本制作方法。石蠟切片為什么要做抗原修復？有哪些方法？石蠟切片標本均用甲醛固定，使得細胞內(nèi)抗原形成醛鍵、羧甲鍵而被封閉了部分抗原決定簇，同時蛋白之間發(fā)生交聯(lián)而使抗原決定簇隱蔽。所以要求在進行IHC染色時，需要先進行抗原修復或暴露，即將固定時分子之間所形成的交聯(lián)破壞，而恢復抗原的原有空間形態(tài)。常用的抗原修復方法有微波修復法，高壓加熱法，酶消化法，水煮加熱法等，常用的修復液是pH6.0的0.01 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液。免疫組化常用的染色方法有哪些？根據(jù)標記物的不同分為免疫熒光法，免疫酶標法，親和組織化學法，后者是以一種物質(zhì)對某種組織成分具有高度親合力為基礎的檢測方法。這種方法敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中生物素抗生物素染色法最常用?？贵w的保存：抗體儲存容器應由不吸附蛋白質(zhì)的材料制成，常用的有聚丙烯，聚碳酸酯和硼硅酸玻璃。如儲存的抗體中蛋白濃度很低（10-100mg/L），就應另加隔離蛋白以減少容器對抗體蛋白的吸附，隔離蛋白常用0.1%-1.0%的牛血清白蛋白。絕大多數(shù)已稀釋的抗體應存在4-8條件下，以免凍融對抗體蛋白產(chǎn)生有害效應?？贵w原液和已分離的免疫球蛋白組分應保存于-20條件下，并避免反復凍融。冷凍的抗體溶液應置于室溫中緩慢地解凍，應絕對避免用高溫快速解凍。被細菌污染的抗體常會出現(xiàn)假陽性結(jié)果，應將污染的抗體溶液及其他試劑棄之。為防止細菌污染，可于抗體溶液中加入0.01%疊氮鈉?？贵w經(jīng)真空冷凍干燥后置-20以下可保存3-5年。保存稀釋后的單抗應加入0.1%疊氮鈉濃度。大多數(shù)稀釋抗體可進行冷凍保存，少數(shù)抗體可能會丟失抗原活性。大多數(shù)單抗，只要蛋白濃度適當，可在4下保存數(shù)月。多聚賴氨酸溶液（Poly-L-Lysine Solution） Cat.No.: SGP8920 Size: 10mlConc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26Thimerosal, 0.01%, added as preservative多聚賴氨酸溶液是廣泛應用的組織切片與玻片黏合劑，該多聚陽離子分子與組織切片上的陰離子相互作用會產(chǎn)生較強的黏合力。適用組織學，免疫組織化學，冰凍切片，細胞涂片，原位雜交等使用的玻片的防脫片處理，以防實驗操作過程中組織掉片。也可用于細胞培養(yǎng)，增加細胞貼壁能力。使用說明免疫學操作步驟（可直接在玻片上涂布）1 滅菌的ddH2O 1:10稀釋該多聚賴氨酸溶液。2 用之前將稀釋的多聚賴氨酸溶液放在室內(nèi)，使其溫度到室溫18-263 將玻片浸在稀釋的多聚賴氨酸溶液5分鐘。注意增加時間不會提高包被效果。4在60烘箱1小時干燥，或室溫18-26過夜干燥待用。注意1 每100mL已稀釋的多聚賴氨酸溶液要包被的玻片40-90張， 超過90張片子將影響其黏合力。2 用之前的玻片必須保持清潔。必要時用含1% HCl的70%乙醇溶液來清洗。4 釋過的多聚賴氨酸溶液要放在2-8，至少在3個月