細(xì)胞免疫熒光步驟

方法一：1. 首先需要把細(xì)胞養(yǎng)在玻璃片上（懸浮細(xì)胞需要用多聚賴氨酸包被過(guò)的玻璃片）2. 然后在4PFA里面室溫下固定30分鐘，PBS洗兩次，0.1% TX-100室溫下作用12分鐘使細(xì)胞膜通透。3. 接下來(lái)進(jìn)行熒光標(biāo)記，需要在一個(gè)大的容器（面積大，扁平狀的，比如大的培養(yǎng)皿）里面，放一張用水打濕的濾紙，以保持濕度。4. 剪一片合適大小的parafilm，在上面滴上稀釋在1BSA/TBS中的一抗（稀釋倍數(shù)依具體抗體而定），每個(gè)玻璃片30ul足夠，把玻璃片蓋在上面（細(xì)胞面朝下），室溫下孵育30分鐘，然后在PBS里洗三次。5. 接下來(lái)二抗孵育步驟同上。6. 最后，在載玻片加上mounting medium（大約每個(gè)玻璃片加10ul），把玻璃片放上去（細(xì)胞面朝下），37度30分鐘，然后就可以在熒光顯微鏡下觀察了。7. 抗體很重要，不能有非特異性結(jié)合。你可以先做WB檢測(cè)一下你的抗體，看看有沒(méi)有雜帶。8. 雙標(biāo)的話，可以把兩個(gè)一抗一起加或者分別標(biāo)記兩次（可以都試一下看看那種方法合適）。如果一個(gè)抗體需要二抗，一個(gè)是直接熒光標(biāo)記的，可以把熒光標(biāo)記的那個(gè)和另外一個(gè)的二抗一起加。方法二：1. 選取一抗時(shí)要來(lái)源于兩種不同的動(dòng)物，我用的是來(lái)源于rabbit和rat的抗體，二抗則是不同熒光信號(hào)標(biāo)記 的，我用的是donkey anti-rabbit-FITC（綠）和donkey anti-rat-Tex-Red（紅）。2. 我的做法是兩種一抗同時(shí)孵育，然后兩種二抗同時(shí)孵育?？贵w濃度、孵育時(shí)間要仔細(xì)摸索，我感覺(jué)一抗4度孵育過(guò) 夜比較好，背景比較清晰。3. 我的陽(yáng)性對(duì)照用的是陽(yáng)性組織切片，陰性對(duì)照則分別是家兔和大鼠的IgG，熒光標(biāo)記物對(duì)照是PBS+熒光標(biāo)記物。4. 封閉血清與二抗來(lái)源動(dòng)物一致，我用的是10%的正常donkey血清。5. 其余步驟同一般免疫熒光單標(biāo)操作。方法三：1. 片子的制作：可以做細(xì)胞爬片，細(xì)胞甩片，還有直接在24well/12well/96well中直接染色2. 細(xì)胞爬片的制作：直接購(gòu)買公司的已經(jīng)處理過(guò)的細(xì)胞爬片，要是自己制作的話，就用無(wú)菌的蓋玻片用多聚賴氨酸處理后讓細(xì)胞自己爬片3. 細(xì)胞甩片：需要甩片機(jī)將細(xì)胞懸液均勻甩到玻片上。4. 其實(shí)小的well的話，可以直接拿來(lái)染色，沒(méi)問(wèn)題的。5. 固定：用PBS洗去培養(yǎng)液，用固定液（如甲醇和丙酮；4%多聚甲醛；酒精。）固定細(xì)胞。6. 內(nèi)源性過(guò)氧化物酶處理，3%過(guò)氧化氫處理細(xì)胞（選作，二抗連HRP得必做，其他的如做免疫熒光染色不用做）。7. 通透（胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白需要做；細(xì)胞膜蛋白不需要做），一般選用Triton-X100來(lái)做細(xì)胞通透，濃度和時(shí)間需要摸索，一般是0.1-5%，處理時(shí)間為1-30分鐘，級(jí)個(gè)別需要到1-2小時(shí)。8. 封閉：洗去通透液，用二抗同源的血清約10%的濃度in PBS中封閉半小時(shí)，也可以選用5-10%脫脂奶粉。封閉結(jié)束后千萬(wàn)不要洗，直接上一抗。9. 一抗：具體你想做什么樣的蛋白，咨詢抗體公司如santa cruze,Abcam,sigma.。選取具體的抗體，但是一抗的稀釋濃度也是要摸索，抗體稀釋液可以購(gòu)買抗體公司現(xiàn)成的，對(duì)于新手還是挺好的。時(shí)間一般是4度過(guò)夜或者37度1小時(shí)。一抗最好還是選用外國(guó)抗體公司的抗體。10. 洗去一抗。11. 上二抗，二抗一般抗體公司會(huì)給你推薦的，你在其中選上一個(gè)就行了，自己選國(guó)產(chǎn)的也行，就是選在哪個(gè)動(dòng)物體內(nèi)做的一抗，二抗就選抗那個(gè)動(dòng)物的就行了。二抗的濃度也是需要摸索的，抗體稀釋液和一抗相同就行了。二抗的時(shí)間一般是37度半小時(shí)。12. 底物顯色（選作，二抗連得是酶的必做，按試劑盒的說(shuō)明書添加就行了，顯色時(shí)間可能需要摸索，以免顯色過(guò)度引起假陽(yáng)性；二抗連得是熒光報(bào)告的不用做）13. 洗去二抗，染核14. DAPI或者Hoechst染核15. 洗去染核液，加PBS，上鏡觀察。方法四：(1) 細(xì)胞準(zhǔn)備。對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí)，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過(guò)的蓋玻片的培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞，用PBS離心洗滌(1000rpm，5min)2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片。(2) 固定。根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4保存3個(gè)月。PBS洗滌35 min。(3) 通透。使用交聯(lián)劑(如多聚甲醛)固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì)。通透的時(shí)間一般在5-15min。通透后用PBS洗滌35 min。(4) 封閉。使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min。 (5) 一抗結(jié)合。室溫孵育1h或者4過(guò)夜。PBST漂洗3次，每次沖洗5min。 (6) 二抗結(jié)合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次沖洗5min后，再用蒸餾水漂洗一次。 (7) 封片及檢測(cè)。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。方法五：1 漂洗血清蛋白PH7.2-7.4，37度 PBS 2小時(shí).2 -20度甲醇固定20分鐘后，自然、干燥 10分鐘3 PBS洗凈：3min34 1%Triton：25min-30min.配成50ultriton+5mlpBS5 PBS洗凈：25min6 羊血清封閉：37度，20分鐘7 一抗，4度過(guò)夜，一般要大于18小時(shí)或者37度1-2小時(shí)8 4度 PBS洗凈，min5次9 二抗37度小于一小時(shí)10 37度PBS洗凈，33min11 涼干封片（封閉液PH8.5）細(xì)胞免疫熒光步驟：1.細(xì)胞爬片；首先是玻片的處理，普通的蓋玻片用砂輪劃成自己要的大小的小方塊，先用洗衣粉洗干凈，用水沖靜烤干，然后泡酸過(guò)夜，撈酸后流水洗凈，烤干，置于器皿中高壓滅菌，然后再烤箱中大約8小時(shí)烤干備用。爬片可以在培養(yǎng)皿 六孔板或24孔板中都可，我選擇在培養(yǎng)皿中爬。一為節(jié)約經(jīng)費(fèi)（培養(yǎng)皿可以重復(fù)利用）二來(lái)覺(jué)得培養(yǎng)皿口大，操作比較方便。培養(yǎng)皿消毒同上，消毒時(shí)記得消兩把鑷子具體操作是：用胰酶消化好細(xì)胞，充分吹打，使之成單細(xì)胞懸液（注意：這一點(diǎn)很重要，關(guān)系到將來(lái)爬出來(lái)片子的質(zhì)量）取出消毒的培養(yǎng)皿，可以先加少量培養(yǎng)基（以使玻片與培養(yǎng)皿緊密接觸），將玻片小心放入擺放其中，然后將單細(xì)胞懸液一滴一滴的滴到玻片上。最后蓋上培養(yǎng)皿置于37度5CO2的暖箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，24小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間適時(shí)取出爬片。爬片置于37度PBS中洗三次，每次3到5秒鐘，然后在4多聚甲醛中固定15分鐘，然后再用37度去離子水將甲醛沖干凈，注意手法輕柔，要不然掉片很厲害。同時(shí)操作過(guò)程中注意玻片的正反面，要不然真的是前功盡棄。將做好的爬片置于濾紙上晾干，然后用中性樹(shù)膠粘在載玻片上。注意一定要等中性樹(shù)膠徹底干了之后才能做后續(xù)實(shí)驗(yàn)，要不然玻片會(huì)掉下來(lái)的，就又是前功盡棄了 做好的細(xì)胞爬片可以放在20保存?zhèn)溆茫唧w能保存多長(zhǎng)時(shí)間不太清楚，當(dāng)然盡量早用。2.4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)；3.PBS漂洗5min；4.0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)；5.PBS漂洗2次，每次5min；6.1%BSA封閉30min；7.加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2h；8.PBS漂洗2次，每次5min；9.加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交1h；10.PBS漂洗2次，每次5min；11.5ug/ml DAPI染色2min；12.抗淬滅封片劑封片?？勾銣绶馄瑒?2.5% DABCO (w/v)50mM Tris(pH8.0)90%甘油細(xì)胞免疫熒光細(xì)胞爬片4%多聚甲醛固定10min(固定細(xì)胞器用預(yù)冷的70%甲醇+30%丙酮)PBS漂洗5min0.5% Triton 穿孔15min(丙酮固定法不用透化處理)PBS漂洗2次，每次5min1%BSA封閉30min加入1%BSA稀釋的一抗，于37雜交2hPBS漂洗2次，每次5min加入1%BSA稀釋的二抗，于37雜交1hPBS漂洗2次，每次5min5ug/ml D