木瓜蛋白酶在啤酒中的應(yīng)用.doc

木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的應(yīng)用學(xué)號 姓名 專業(yè)、班級 2011級生物技術(shù)專業(yè) 班 組學(xué) 院 生命科學(xué)與工程學(xué)院 實(shí)驗(yàn)課程名稱 酶工程實(shí)驗(yàn) 開課學(xué)期 2013至2014學(xué)年 二 學(xué)期 填寫時(shí)間 2014 年 06 月 02 日 木瓜蛋白酶在啤酒澄清中的應(yīng)用一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、理解蛋白酶澄清啤酒的原理。2、學(xué)會蛋白酶澄清啤酒的關(guān)鍵技術(shù)。3、能夠發(fā)現(xiàn)影響啤酒澄清的主要問題（因素），找出解決的途徑，確定最佳的澄清工藝。二、實(shí)驗(yàn)原理啤酒是以大麥為主料，以大米等淀粉質(zhì)原料為輔料，麥芽及輔料經(jīng)糖化發(fā)酵而成的酒精飲料。啤酒生產(chǎn)時(shí)，淀粉質(zhì)原料不能直接被微生物利用，需水解成可發(fā)酵性的小分子。啤酒在貯存過程中，由于環(huán)境條件的作用，如光照、氧氣、震動等，會產(chǎn)生渾濁、沉淀等現(xiàn)象。此類渾濁的形成，和啤酒中殘留的蛋白質(zhì)關(guān)系密切，嚴(yán)重影響啤酒的質(zhì)量和在市場上的競爭力。添加蛋白酶可分解啤酒中的大分子蛋白質(zhì)，可有效去除啤酒中的沉淀物。另外，麥芽汁中的蛋白質(zhì)組分，可被蛋白酶水解，提供啤酒酵母發(fā)酵過程中需要的氮源。在啤酒澄清過程中，主要用到木瓜蛋白酶、生姜蛋白酶。本實(shí)驗(yàn)采用木瓜蛋白酶消除啤酒渾濁。木瓜蛋白酶是從雙子葉植物番木瓜(Carica p ap ay a L . )的果乳中提取出來的植物蛋白酶, 具有耐高溫、活性強(qiáng)、穩(wěn)定性好、對 pH 變化和金屬離子不敏感的特性; 它的作用底物包括各種蛋白質(zhì), 如明膠、谷蛋白、酪蛋白、彈性蛋白、球蛋白和肌纖維蛋白, 且該酶是 100%純天然產(chǎn)物。因此, 將其用于對冷凍貯存過程中的啤酒進(jìn)行處理, 能水解啤酒內(nèi)的蛋白質(zhì), 而且還能部分水解一些已形成的復(fù)合物, 產(chǎn)生更多的多肽或氨基酸, 保證啤酒在冷凍貯存過程中的高清晰度; 同時(shí), 也能改善啤酒的口感及原有多肽和氨基酸的組成和比例, 從而有效地改良啤酒的品質(zhì)。木瓜蛋白酶可水解啤酒中的各種蛋白質(zhì)。將其用于處于冷凍貯存過程的啤酒中，能水解啤酒中的蛋白質(zhì)，生成更多的多肽或氨基酸，保證啤酒在冷凍貯存過程中的高澄清度，增加啤酒的泡沫，也能改善啤酒的口感，提高了啤酒泡沫覆蓋度，氨基酸含量均有不同程度的增加，從而提高了啤酒的營養(yǎng)價(jià)值。 啤酒澄清度即啤酒蛋白含量與其透光度有一定的關(guān)系，在660nm波長可由分光光度計(jì)測定其透光度T的變化來反映啤酒蛋白含量的變化，從而反映出木瓜蛋白酶對啤酒中蛋白質(zhì)水解的情況。三、實(shí)驗(yàn)設(shè)備及材料木瓜蛋白酶，啤酒，無菌水，酒精，具塞試管10支，試管架，10ml移液管1支，吸耳球，200ml三角瓶1個(gè)，50ml容量瓶，燒杯，滴管，酒精燈，移液槍，天平，分光光度計(jì)，超凈工作臺，水浴鍋。木瓜蛋白酶溶液的配制：稱取.0.05g木瓜蛋白酶用蒸餾水定容50ml。四、實(shí)驗(yàn)方法及步驟（1）木瓜蛋白酶用量對啤酒澄清效果的探究取六個(gè)具塞試管，分別編號0、1、2、3、4、5，準(zhǔn)確量取10mL同一發(fā)酵罐啤酒到六個(gè)試管中。60水浴24h，測T值，T值最低的為此實(shí)驗(yàn)中最佳投加酶量m編號012345加料10mL啤酒10ml啤酒20L蛋白酶液10mL啤酒+30L蛋白酶液10mL啤酒+40L蛋白酶液10mL啤酒+50L蛋白酶液10mL啤酒+60L蛋白酶液T值（2）不同反應(yīng)時(shí)間下木瓜蛋白酶對啤酒澄清效果的探究根據(jù)步驟（1）中的最適酶量加入到下表試管中，依據(jù)表中所示進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)編號012345加料10mL啤酒+40ul蛋白酶液10ml啤酒40ul蛋白酶液10mL啤酒+40ul蛋白酶液10mL啤酒+40ul蛋白酶液10mL啤酒+40ul蛋白酶液10mL啤酒+40ul蛋白酶液溫度（）6006060606060反應(yīng)時(shí)間16h20h24h28h32h36hT值 五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果及分析1、實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、數(shù)據(jù)及結(jié)果溶液T值蒸餾水100酶液27.8原啤酒66.9066.9168.6269371.1464.3563.3 時(shí)間T值1667.12070.62471.72875.332813681.52、對實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象、實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析及其結(jié)論 （加酶量與澄清度T的關(guān)系圖）實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象：由于使用啤酒本身澄清度較高，故經(jīng)過酶處理后澄清度用肉眼很難看到明顯的變化，主要借助于T值得變化來分析實(shí)驗(yàn)。由圖中可以得出結(jié)論：隨著木瓜蛋白酶的加入量增多，啤酒的澄清度升高。但超過一定量后其澄清度反而下降，可以得出加入的酶量過多影響了啤酒的澄清度。 （酶處理時(shí)間與澄清度關(guān)系圖）此圖為酶處理時(shí)間對啤酒澄清度的影響，由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)得出上圖，當(dāng)加入的酶量為5ul/ml時(shí)，在32h之前T值處于上升趨勢，超過32h后，T值處于平緩狀態(tài)，故得出最佳處理時(shí)間為32h。實(shí)驗(yàn)結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)所用啤酒澄清處理最佳工藝為：酶加量4g/m3（10萬U/g），最佳時(shí)間為32h。本實(shí)驗(yàn)啤酒澄清最佳的工藝流程啤酒原液過濾酶量：4mg每升啤酒 處理時(shí)間：32h處理溫度：待定澄清啤酒啤酒澄清工藝流程圖3、實(shí)驗(yàn)總結(jié)（1）成功之處 ：本實(shí)驗(yàn)成功之處在于實(shí)驗(yàn)方案的設(shè)計(jì)思路較好，沒有較大紕漏，能夠較好地完成實(shí)驗(yàn)任務(wù)，并且對實(shí)際生產(chǎn)的指導(dǎo)意義較大（相對于測定最佳PH而言認(rèn)為在實(shí)際應(yīng)用中不可能去調(diào)節(jié)啤酒的PH值）。 （2）不足之處：實(shí)驗(yàn)的不足之處在于實(shí)驗(yàn)條件并非實(shí)驗(yàn)室能夠完全滿足（某些試劑不全等），不得已使用澄清度才用了較為粗放的測定法，（3）個(gè)人的自我評價(jià)：在試驗(yàn)中主要參與設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)和協(xié)調(diào)督促成員完成實(shí)驗(yàn)，對本實(shí)驗(yàn)?zāi)苡休^為全面的了解，但發(fā)現(xiàn)某些方面由于各種原因（主要是時(shí)間）會出現(xiàn)偶爾的懈怠，由于實(shí)驗(yàn)時(shí)間較長，會感到不耐煩或不認(rèn)真做實(shí)驗(yàn)，使某些實(shí)驗(yàn)條件發(fā)生一些改變從而影響到實(shí)驗(yàn)的嚴(yán)謹(jǐn)性等。（4）個(gè)人收獲：由于實(shí)驗(yàn)完全由組員合作設(shè)計(jì)，這鍛煉了個(gè)人處理問題的能力，本實(shí)驗(yàn)對實(shí)際應(yīng)用有較好地指導(dǎo)意義，在試驗(yàn)中也能較好的協(xié)調(diào)成員之間的協(xié)作。六、思考題1、 影響木瓜蛋白酶活性的因素有哪些，如何提高木瓜蛋白酶的催化效率？木瓜蛋白酶本身是一種蛋白質(zhì)，凡是能夠影響蛋白質(zhì)活性的因素都可能是影響木瓜蛋白酶活性的因素，比如：溫度，PH值，重金屬離子，溶劑等等因素。為了提高酶的效率可以探究酶的最佳催化溫度，用量及PH。本實(shí)驗(yàn)中若探究PH值，如果最佳PH不是啤酒的自然PH，則需要調(diào)節(jié)PH，待反應(yīng)結(jié)束后，即使恢復(fù)其啤酒的自然PH，也相當(dāng)于向啤酒中加入了某種鹽，對啤酒的口味會產(chǎn)生影響，故PH值只能在啤酒的自然PH值下催化。另外為了提高酶的效率可以通過設(shè)計(jì)溫度梯度和酶用量梯度探究酶的最佳催化參數(shù)。除此之外還可以考慮采用固定化酶來提高酶的催化效率。總之要在成本和效率之間權(quán)衡考慮。2、 除本實(shí)驗(yàn)用到的酶解法消除啤酒的渾濁外，生產(chǎn)中還有什么方法可消除啤酒中的渾濁？啤酒渾濁的成因有很多，比如蛋白質(zhì)引起渾濁，多酚引起的渾濁等等因素。生產(chǎn)中可以采用微孔過濾，配合硅膠 單寧對蛋白的吸附等方法。七、參考文獻(xiàn)1許彥,張平. 酶制劑在啤酒生產(chǎn)中的應(yīng)用及原理J . 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2013,19(09):42432乙引,陳平,王茜,王明勇,柯波. 木瓜蛋白酶改良啤酒品質(zhì)的研究J . 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2000, 28(4): 1416.3李海芹，李娜，劉毅等.啤酒混濁問題如何解決J .中外食品,2006,7: 5458.4 陳飛,吳生文,張志剛蛋白酶在酒類生產(chǎn)中的應(yīng)用現(xiàn)狀J2010.37(6)9-11 一：名詞解釋現(xiàn)代發(fā)酵工程 種子的擴(kuò)大培養(yǎng) 露點(diǎn) 底物親和常數(shù)KS 比生長速率 代謝控制發(fā)酵臨界稀釋率二簡答發(fā)酵工業(yè)的發(fā)展歷程工業(yè)微生物育種的基本方法空氣除菌的方法及流程發(fā)酵工業(yè)菌種應(yīng)具備的條件種子的擴(kuò)大培養(yǎng)及影響種子質(zhì)量的因素發(fā)酵工業(yè)消除泡沫的方法發(fā)酵生產(chǎn)中如何調(diào)節(jié)pH發(fā)酵過程中溶解氧的控制方法及意義谷氨酸發(fā)酵產(chǎn)量的影響因素及調(diào)控機(jī)制從土壤中篩選一株高產(chǎn)淀粉酶的細(xì)菌，設(shè)計(jì)方案，重要操作步驟、鑒定思路發(fā)酵工業(yè)污染的原因及防治策略發(fā)酵工業(yè)培養(yǎng)基的基本要求，設(shè)計(jì)優(yōu)化的一般過程發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選、選育的步驟溫度、pH、溶解氧、泡沫等對發(fā)酵的影響及控制鈣調(diào)蛋白基因cDNA克隆及序列分析一 摘要鈣調(diào)蛋自是生物細(xì)胞內(nèi)一種重要的調(diào)控蛋自，通過其與靶酶的相互作用，控制細(xì)胞正常的生長和發(fā)育。從小麥葉片中提取總RNA,以O(shè)ligo aT ( lsbp)為引子合成cDNA第一鏈，以水稻鈣調(diào)蛋白墓因兩端的寡聚核替駿為引物，用PCR方法可以擴(kuò)增小麥鈣調(diào)蛋白基因。酶切分析和測定DNA全序列，將該序列與幾種植物的鈣調(diào)蛋白基因作比較，同源性高達(dá)81.900-95.3%。鈣調(diào)蛋白基因的分離、克隆對于闡明鈣調(diào)蛋白的作用機(jī)制和從分子水平上闡明植物對環(huán)境反應(yīng)及其它重要生理過程的機(jī)制均有十分重要的意義，因而受到人們廣泛重視。迄今，已在甘蔗、水稻、玉米、馬鈴薯、碗豆、擬南芥等作物(植物)上克隆鈣調(diào)蛋白基因或cDNA，1本實(shí)驗(yàn)以番茄為實(shí)驗(yàn)材料通過反轉(zhuǎn)錄來構(gòu)建北方小麥cDNA文庫，并擴(kuò)增出小麥的鈣調(diào)蛋白基因。2、 研究背景及意義 鈣調(diào)蛋白(CaM)作為一種多功能的調(diào)節(jié)蛋白引起人們廣泛的興趣，對它的結(jié)構(gòu)及功能表達(dá)的研究仍方興未艾。在人口激增的現(xiàn)時(shí)代，人們對糧食的需求量也劇增，鈣調(diào)蛋白的研究對揭示鈣調(diào)蛋白的結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)植物的功能代謝具有重大意義。通過科學(xué)家近年不斷的努力鈣調(diào)蛋白的研究取得了重大進(jìn)展，主要集中在1. CaM的三維結(jié)構(gòu)2. CaM活化靶酶的分子模型3. CaM調(diào)節(jié)的體系4. CaM拮抗劑研究5. CaZ+, CaM與疾病5大領(lǐng)域上。三、可行性分析1、由基因bank數(shù)據(jù)庫中可以查找到某些部分的鈣調(diào)蛋白基因序列，并且很大一部分的植物的鈣調(diào)蛋白的基因同源性高達(dá)90%，2這給該基因的cDNA文庫的構(gòu)建提供了便利。但是由于物種的不同，其核苷酸的微小差別都可能使引物出現(xiàn)錯(cuò)誤而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。2、由于水稻的鈣調(diào)蛋白基因的克隆已有報(bào)道，并且基因測序也已經(jīng)完成，本實(shí)驗(yàn)選取了和水稻親緣關(guān)系較近的小麥為實(shí)驗(yàn)材料通過PCR克隆出小麥的鈣調(diào)蛋白基因并分析序列。3、技術(shù)路線小麥葉片全RNA的提取逆轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈的合成cDNA雙鏈的合成 PCR擴(kuò)增目的基因（北方小麥鈣調(diào)蛋白基因）基因的序列分析4實(shí)驗(yàn)方案小麥葉片RNA的提取3用異硫氰酸胍法提取。剪碎一70保存的小麥葉片，加液氮研磨成粉狀，加異硫氰酸孤溶液勻漿，水飽和酚，氯仿/異戊醇抽提，上清液用異丙醇沉淀，再用異硫氰酸胍溶液溶解，異丙醇沉淀，溶于無RNase的水中，65保溫l0min后，乙醇沉淀，抽干，溶于DEPC處理過的水中，- 70保存。取15l作RNA的甲醛變性電泳檢查。逆轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA :參考北京康為世紀(jì)公司cDNA第一鏈合成試劑盒上的方法，以小麥全RNA為模板，Oligo dT為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA的第一條鏈，一20保存?zhèn)溆谩２襟E：a將RNA模板、引物、dNTP Mix. DTT. RT Buffer. HiFi-MMLV和RNase-Free Water溶解并置于冰上備用。b根據(jù)以下表格配制反應(yīng)體系，總體積為20l。c 渦旋震蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。d 42 0C孵育30-50分鐘，850C孵育5分鐘。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻。e 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于一20長期保存。用PCR方法擴(kuò)增小麥鈣調(diào)蛋白基因:參考已發(fā)表的水稻鈣調(diào)蛋白基因序列(或者在NCBI搜索水稻鈣調(diào)蛋白基因符號：OsMSR2 登錄號：Os01g0955100 查詢其基因序列，并利用primer3設(shè)計(jì)引物來擴(kuò)增小麥鈣調(diào)蛋白cDNA)，人工合成兩段分別含有26個(gè)和24個(gè)核普酸的寡聚核普酸作為引物，序列分別為:5端引物，5-GGCATGGCGGATCCGCTCACCGACGA-3, 3端引物，5-TCCCTAGGCCATCATGACCTTGAC-3。4以合成的cDNA第一條鏈為模板，加Taq DNA Polymerase合成。反應(yīng)為93變性30s, 45 C退火1min30s, 70 0C延伸2min，共30個(gè)循環(huán)。4保存。（具體步驟可參考北京康為世紀(jì)公司的PCR試劑盒）具體步驟如下：反應(yīng)體系的構(gòu)建PCR反應(yīng)條件的控制目的基因的檢測（凝膠電泳法檢測）參考文獻(xiàn)1張成,王喆之.丹參鈣調(diào)蛋白cDNA的克隆及其反義表達(dá)載體的構(gòu)建.分子植物