【畢業(yè)學(xué)位論文】（Word原稿）微生物除草劑菌種的原生質(zhì)體融合微生物學(xué)研究論文

密級 : 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 微生物除草劑菌種的原生質(zhì)體融合研究 on on y I 摘 要 雜草化學(xué)防治是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展標(biāo)志，它節(jié)省勞動力、有利于機械化作業(yè)、是節(jié)本增效的最重要措施。但 農(nóng)藥污染是我國影響范圍最大的一種有機污染，我國每年使用農(nóng)藥的面積在 公頃以上，每年使用的農(nóng)藥量在 50噸，其中除草劑年使用量為 噸。平均有 80%的農(nóng)藥直接進入環(huán)境，擴散到大氣和土壤中，影響地下水和地表水水質(zhì)。無論是出口農(nóng)產(chǎn)品，還是國內(nèi)需求的農(nóng)產(chǎn)品，農(nóng)藥殘留的門檻將愈來愈高，大幅度減少農(nóng)藥的使用是未來農(nóng)業(yè)發(fā)展趨勢。 發(fā)展微生物除草劑，實現(xiàn)雜草生物防治，可以大幅度降低化學(xué)除草劑的用量，為生態(tài)安全和糧食安全，以及有害生物的可持續(xù)控制作出貢獻。 突臍蠕孢（ 彎孢 (中國水稻研究所從自然感病的稗草上分離得到的兩株病原真菌，它們是稗草生物防治的潛力菌。 稗草致 病力強，但孢子產(chǎn)量低，而 子產(chǎn)量高，但對稗草的致病力弱。本研究根據(jù)這兩個菌株的特性，采用滅活原生質(zhì)體融合技術(shù)，對突臍蠕孢與彎孢進行原生質(zhì)體的融合及融合子的篩選，目的是期望培育成功孢子產(chǎn)量高、代謝產(chǎn)毒能力強、適合工業(yè)化發(fā)酵的優(yōu)良工程菌株。 論文獲得以下主要研究結(jié)果： 1采用紫外線誘變處理 和 ，用含制霉菌素和放線菌酮的抗性培養(yǎng)基平板篩選獲得具有抗生素抗性的突變菌株。 2確定了原生質(zhì)體制備與融合的最佳條件： 靜置培養(yǎng) 24h 和 靜置培養(yǎng) 18h，培養(yǎng)菌絲體；用 2蝸牛酶 2%溶壁酶復(fù)合酶酶 解 4h，制備原生質(zhì)體；選擇再生培養(yǎng)基 高原生質(zhì)體再生率；紫外照射 4活 ， 55水浴 5活 ， 40濃度、 件下促融。 成功獲得 3 株融合子 3觀察到 融合子在孢子形態(tài)和菌落形態(tài)上與親株比較存在明顯差異，融合子的生長速度和孢子產(chǎn)量等生物學(xué)特性介于兩親株之間。并 利用 法分析鑒定了融合子的 態(tài)性，初步鑒定出融合子 有雙親的 帶特征。 融合子 稗草根長的抑制效果顯著高于出發(fā)菌株 ，而與 的效果相當(dāng)。 關(guān)鍵詞 ：突臍蠕孢菌（ 彎孢菌（ 原生質(zhì)體融合，稗草（ L.) , 生物防治 he of an to of as as of 0080 of 2580% on as as on No or is of of of in of to of of by of s EM to L to of to a M L as as to of of as 1. M L on M L to M L 4 h 8 h of % % 0 h, of e3 L M by 5 as as EG 0% at 1、 F2 c of of NA of of NA c of 2 L to M. L.) , 錄 第一章 文獻綜述 . 1 生質(zhì)體融合技術(shù)發(fā)展概況 . 1 生質(zhì)體融合的程序與方法 . 2 生質(zhì)體制備及再生 . 2 生質(zhì)體融合方法 . 3 合子的選擇及標(biāo)記 . 4 生質(zhì)體融合技術(shù)在新菌株培育中的應(yīng)用 . 6 生物除稗劑的研究現(xiàn)狀 . 7 外生物除稗劑的研究進展 . 7 內(nèi)微生物除稗劑的研究進展 . 9 題意義與目的 . 10 第二章 材料與方法 . 11 料 . 11 種 . 11 養(yǎng)基 . 11 . 11 透壓穩(wěn)定劑 . 11 誘變劑 . 12 菌抗生素 . 12 融劑 . 12 脂 . 12 取試劑 . 12 泳緩沖液 . 12 泳載樣緩沖液 . 13 B 染液 . 13 應(yīng)試劑 . 13 器設(shè)備 . 13 法 . 14 性突變株的誘變及篩選 . 14 用雙親滅活的原生質(zhì)體融合 . 14 用抗性標(biāo)記進行原生質(zhì)體的融合 . 16 用 子標(biāo)記鑒定融合 菌株 . 16 融合子進行生物學(xué)檢測 . 17 第三章 結(jié)果與分析 . 19 性突變株的誘變及篩選 . 19 最適紫外誘變劑量的確定 . 19 菌抗生素最小抑制濃度的確定 . 20 菌的紫外誘變及抗性突變株的篩選 . 21 用雙親滅活的原生質(zhì)體融合 . 21 生質(zhì)體的制備 . 21 生質(zhì)體的再生 . 25 生質(zhì)體的滅活 . 27 生質(zhì)體融合和再生 . 28 用抗性突變株進行的原生質(zhì)體融合 . 29 用 子標(biāo)記鑒定融合菌株 . 29 合子和親株的 提取和 應(yīng) . 29 對融合子進行生物學(xué)檢測 . 31 落生長速度及形態(tài) . 31 子形態(tài)和孢子產(chǎn)量比較 . 33 合子與親株發(fā)酵液對稗草抑制率的比較 . 35 合子與親株孢子懸液對稗草抑制率 . 35 第四章 討論 . 38 第五章 結(jié)論 . 39 參考文獻 . 40 致 謝 . 48 個人簡介 . 49 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 1 第一章 文獻綜述 原生質(zhì)體融合技術(shù)是指將親株的細(xì)胞分別 脫壁形成原生質(zhì)體，再施以物理、化學(xué)或生物手段將兩種不同親株的原生質(zhì)體融合，使細(xì)胞內(nèi)的遺傳物質(zhì)發(fā)生重組交換形成重組子的技術(shù)手段。它操作簡便，克服傳統(tǒng)育種細(xì)胞壁和交配系統(tǒng)對育種的障礙，實現(xiàn)種間、屬間以至更遠(yuǎn)緣的雜交。 真菌是與人類關(guān)系密切的一類微生物 ,隨著原生質(zhì)體融合技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，其越來越多地應(yīng)用于真菌的育種中。真菌原生質(zhì)體融合主要集中于產(chǎn)抗生素菌類、釀造菌類、食用菌菌類及其它一些對人類生產(chǎn)生活有益的菌類。真菌原生質(zhì)體融合最早起源于 1974 年， 等(974)以白地霉 （ 養(yǎng)缺陷突變株為材料成功獲得融合子，隨著生物學(xué)技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，原生質(zhì)體融合技術(shù)在真菌育種中發(fā)揮了重要作用。 生質(zhì)體融合技術(shù)發(fā)展概況 原生質(zhì)體是保留完整細(xì)胞質(zhì)膜而沒有細(xì)胞壁的細(xì)胞，去壁不完全而帶有部分細(xì)胞壁的細(xì)胞叫球狀體。最初 ,人們得到原生質(zhì)體是通過機械搗碎的方法 ,但由于該方法難以得到大量原生質(zhì)體 ,因此實際應(yīng)用較少。原生質(zhì)體簡便、快捷的制備方法得益于大量工業(yè)化酶的制備 ,酶解細(xì)胞壁可以大量獲得原生質(zhì)體 ,這是原生質(zhì)體技術(shù)建立和發(fā)展的基礎(chǔ)。 在 1859 年 究某些粘菌的生活史時，發(fā)現(xiàn)該菌能夠從單核細(xì)胞融合產(chǎn)生多核核胞體（ 這是世界上第一次發(fā)現(xiàn)微生物細(xì)胞融合現(xiàn)象。細(xì)菌原生質(zhì)體的自然形成和自發(fā)融合現(xiàn)象首次發(fā)現(xiàn)于 1925 年，開始人們猜測可能是染色標(biāo)片上的贗象 ，在 1944 年用相差顯微攝影的活體觀察證實了融合事件，隨后在擬桿菌屬（ 通變形桿菌（ 及碳疽芽孢桿菌（ ，也分別用相差顯微攝影證明了原生質(zhì)體的形成及其自發(fā)融 合事件，之后在真菌的一些種中也發(fā)現(xiàn)了類似情況。 真菌自發(fā)融合主要有以下特點： 融合主要發(fā)生在原生質(zhì)體形成期； 融合頻率低，難以計算； 融合子雙親為野生型，具有各自的遺傳背景； 到了 20 世紀(jì) 50 年代，人們開始關(guān)注原生質(zhì)體技術(shù)， 1953 年 次利用融菌酶酶解制備了巨大芽孢菌的原生質(zhì)體；受細(xì)菌原生質(zhì)體融合的啟發(fā)，到了 1957 年， 首次用蝸牛酶酶解制備了酵母菌的原生質(zhì)體； 60 年代捷克的 西班牙的 個研究中心對原生質(zhì)體技術(shù)做了大量基礎(chǔ)性工作，前者主要應(yīng) 用原生質(zhì)體研究酵母細(xì)胞的生活史與細(xì)胞分裂，后者主要研究能夠有效降解絲狀真菌細(xì)胞壁的溶菌酶 (牛艷芳， 2004)。 人工誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合的工作最初起源于人工誘導(dǎo)無細(xì)胞壁動物細(xì)胞融合的嘗試。在將動物細(xì)胞人工誘導(dǎo)融合成功之后五年左右，這一技術(shù)很快擴展到動物種間與屬間細(xì)胞融合，并進行了某些基因在染色體上的粗定位，進而又?jǐn)U展到目間細(xì)胞融合的成功。 1970 年植物原生質(zhì)體融合首次獲得成功。 1976 年 個研究小組也分別報道了細(xì)菌原生質(zhì)體融合成功的事例。該技術(shù)在真菌方面的探索最早始于 1957 年 用蝸牛酶酶解酵母菌細(xì)胞壁制備原生質(zhì)體，1974 年， 等以白地霉（ 養(yǎng)缺陷型突變株為材料，采用離中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 2 心方法進行原生質(zhì)體融合，其融合率低于 10后，人們又利用一些化學(xué)試劑，如a(,進行融合，效果得到改進 。 1976 年 把用聚乙二醇（ 導(dǎo)植物原生質(zhì)體融合的方法引入到真菌原生質(zhì)體融合中來，使融合率達到 10量級。 導(dǎo)原生質(zhì)體融合的成功， 推動了真菌原生質(zhì)體融合的發(fā)展。 1979 年匈牙利的 et 1979）首先報道了融合育種提高青霉素產(chǎn)量，從而開創(chuàng)了原生質(zhì)體融合在真菌育種中的應(yīng)用。隨后一些新的方法和技術(shù)不斷在原生質(zhì)體融合中引進。 生質(zhì)體融合的程序與方法 真菌原生質(zhì)體融合技術(shù)包括三個關(guān)鍵程序：（ 1）足夠數(shù)量的原生質(zhì)體的分離和再生。（ 2）誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合。（ 3）融合子的篩選。 生質(zhì)體制備及再生 1）液體培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)菌絲； 2）取出一定量菌絲離心并用緩沖液洗滌菌絲； 3）加入酶液酶解； 4）用尼龍 膜過濾除去菌絲碎片； 5）離心收集原生質(zhì)體并用高滲緩沖液洗滌； 6）用液體再生培養(yǎng)基懸浮原生質(zhì)體； 7）將懸浮原生質(zhì)體涂高滲再生平板。 真菌原生質(zhì)體分離常用的酶包括纖維素酶（ 新生酶（ 34）、溶壁酶（ 蝸牛酶（ 崩潰酶（ ，酵母類常以蝸牛酶為主，再配合其它酶輔助組成混合酶。食用菌類不同種之間有差異（ 劉祖同， 2002），其它絲狀真菌在制備原生質(zhì)體過程中通常選取上述酶中的 2混合使用。酶的濃度通常在 W/V)。酶解溫度范圍控制在 25酶解時間在一定程度上取決于酶的濃度和菌絲生長狀況，通常選取 酶液 一般保持在 個別情況下如林肯鏈霉菌的原生質(zhì)體制備過程中采用 羅立新， 2004）。用 磷酸緩沖液配制合適 的酶液。酶液中需要添加滲透壓穩(wěn)定劑防止原生質(zhì)體膜破裂。真菌原生質(zhì)體制備過程中選取的常用為硫酸鎂和氯化鉀等，濃度。 真菌的菌齡在原生質(zhì)體的分離和再生中也是重要影響因子，酵母菌齡選擇在對數(shù)生長期，而絲狀真菌的 菌齡則不易判斷，可根據(jù)菌絲球大小、緊密程度、菌絲量來選擇最佳生長時期，有的采用生長不同時期 來判斷是否為最佳生長時期。一些物質(zhì)可影響菌絲對酶的影響敏感程度，所以可以用來提高菌絲產(chǎn)原生質(zhì)體的數(shù)量。如在絲狀真菌酶液中加二硫蘇糖醇（ 甘氨酸，在靈芝原生質(zhì)體制備中加巰基乙醇，酵母類通常用巰基乙醇對酶解前的菌絲進行預(yù)處理。 原生質(zhì)體再生是指酶解后形成的原生質(zhì)體在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件下重新生長細(xì)胞壁的過程，影響再生率的因素很多，包括菌齡、酶及酶解條件、滲透壓穩(wěn)定劑及再生培養(yǎng)基 ( 郝勃 ,1997;002)。真菌原生質(zhì)體的再生率在 80%之間，不同屬、種的真菌在不同的培養(yǎng)條件下再生率差別顯著，而較高的再生率是原生質(zhì)體融合成功的關(guān)鍵。 再生培養(yǎng)基是在菌絲體正常生長的培養(yǎng)基中添加營養(yǎng)因子和滲透壓穩(wěn)定劑。有液體再生培養(yǎng)基、固體再生培養(yǎng)基和半固體再生培養(yǎng)基。培養(yǎng)方法包括液體培養(yǎng)、固體培養(yǎng)和雙層培養(yǎng)。雙層培養(yǎng)通常是在培養(yǎng)皿下層鋪固體培養(yǎng)基，上層鋪原生質(zhì)體和半固體培養(yǎng)基混合液。 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 3 用于再生培養(yǎng)的滲透壓穩(wěn)定劑有 無機離子和蔗糖、山梨醇、甘露醇、肌醇和琥珀酸等有機物質(zhì)，研 究發(fā)現(xiàn) 存在可以顯著提高原生質(zhì)體的再生率，對真菌采用蔗糖等有機物質(zhì)的效果優(yōu)于無機離子。一些促進細(xì)胞壁再生的物質(zhì)如纖維二糖、菌絲壁的碎片也常作為輔助物質(zhì)加入再生培養(yǎng)基中（ 2000）。 生質(zhì)體融合方法 酶解后相鄰的原生質(zhì)體能發(fā)生自融合，這就給基因的交流提供了可能性。自融合的頻率較低，大約在 10間，因此要通過生物、化學(xué)或物理的方法促使融合。原生質(zhì)體融合方法有以下幾種。 (1) 仙臺病毒促融法 最早的人工促進融合的方法， 1960 年，日本學(xué)者岡 田善雄（ 察到仙臺病毒（ 引起細(xì)胞融合的現(xiàn)象，并對影響融合的相關(guān)因子進行了詳細(xì)研究。其它一些致癌、致病病毒如天花病毒、皰疹病毒等也都可以誘導(dǎo)細(xì)胞融合。但病毒誘導(dǎo)細(xì)胞融合存在病毒制備困難、操作復(fù)雜、滅活效價差異大等原因，影響了病毒作為誘導(dǎo)劑的發(fā)展。 (2)化學(xué)促融法 20 世紀(jì) 70 年代后，化學(xué)融合劑得到了廣泛發(fā)展，主要包括鹽類、葡萄糖、聚乙烯醇、合成磷脂、聚乙二醇（ 二甲基亞砜（ 。其中效果顯著的是聚乙二醇（ ， 1974年，匈牙利科學(xué)家 先報道 使真菌融合，以后酵母、霉菌也相繼成功取得融合子。這也是目前原生質(zhì)體融合的主要方法 (et 001)。 (3)合法 是由 1974 年創(chuàng)立的 , 聚乙二醇 (一種多聚化合物 ,其相對分子量在 20000 之間 ,小分 子量的 大分子量的 融合效 率低 ,大 分子量的 造成較多的多體融 合 ,因 此融合用的 常選擇分子量 1000 度則選擇在 25% 導(dǎo)融合的機理尚不太清楚，初步認(rèn)為 結(jié)合溶液中的水分子，使原生質(zhì)體處在脫水狀態(tài)并發(fā)生凝集，不同程度的凝集使得原生質(zhì)體細(xì)胞膜與膜之間緊密結(jié)合并發(fā)生變形。相互緊密接觸的大分子蛋白質(zhì)與脂類發(fā)生移動和重排，導(dǎo)致細(xì)胞膜局部融合形成細(xì)胞質(zhì)橋，隨著融合區(qū)域的逐漸增大，最終兩個原生質(zhì)體融合（ 羅立新， 2004）。 處理方法有很多種 ,可以單層的覆蓋在培養(yǎng)皿上處理 ,也可以懸浮在離心管中。處理時間通常在 10鐘 ,取決于原生質(zhì)體的濃度和 分子量大小。但是最初的 理后融合原生質(zhì)體很難被培養(yǎng)液洗脫 ,后來經(jīng)修改應(yīng)用高濃度鈣鹽溶液和用高 的緩沖液稀釋。 合的一般程序為： 1）將親株原生質(zhì)體以 1： 1 混合均勻； 2）用滲透壓穩(wěn)定劑洗脫混合液，離心得原生質(zhì)體沉淀； 3）加入合適濃度及分子量的 液，在 25溫 204）離心并用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌； 5）用滲透壓穩(wěn)定劑懸浮原生質(zhì)體并涂再生培養(yǎng)基平板（ 2002）。 除了 子量大小、純度、使用濃度外， 度、 和一些輔助物質(zhì)都能影響 在保護細(xì)胞的同時促進融合，用量在 10。 一般在 上，在融合 溶液中添加伴刀豆球蛋白（ 二甲基亞砜（ 胰蛋白酶等都能在一定程度上提高融合頻率。陳五嶺（陳五嶺等， 1998）等證明了氦氖激光對原生質(zhì)體融合有促進作用，此外中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 4 還有人證明螯合劑的存在也促進 原生質(zhì)體的融合。 導(dǎo)原生質(zhì)體融合的方法操作簡便，不需要特殊儀器，不受親本原生質(zhì)體種類及大小的限制，因此在細(xì)胞融合中被廣泛使用。其缺點是對原生質(zhì)體有一定毒性，影響到原生質(zhì)體的再生。 (四 ) 電融合法 20 世紀(jì) 80 年代，德國科學(xué)家 創(chuàng)立了電融合技術(shù)，以雙相電泳和電子擊穿細(xì)胞質(zhì)膜的聯(lián)合作用使得不同的細(xì)胞發(fā)生融合。 電融合的優(yōu)點是省去融合后的洗滌過程， 且融合頻率高，對細(xì)胞無毒害。然而 電融合小室限制了原生質(zhì)體的數(shù)量 ,盡管可以用連續(xù)的小室來解決 ,但長時間的電脈沖的刺激會影響到原生質(zhì)體再生形成菌落 （ et 1983） 。 電融合法在真菌中最早廣泛應(yīng)用于酵母類的原生質(zhì)體融合。近些年來又逐漸用于曲霉和食用菌類。 1991 年 余柏松 （ 余柏松 等， 1991）通過 生米卡鏈霉菌原生質(zhì)體電融合 得到融合子。 1991年 施曉明 、 劉祖同 進行了 黑曲霉 (生質(zhì)體電 融合（ 施曉明 ， 1991） ， 1994年 余荔華 、 劉祖同 實驗了 米曲霉與黑曲霉原生質(zhì)體種間電融合 （ 余荔華 ， 1994） ， 1995 年 、 劉祖同 等對 食用菌滅活原生質(zhì)體 進行 電融合 （ 曾 容 ,1995）。 邱景蕓 等于 1995 年 進行了 鳳尾菇和桃紅平菇種間原生質(zhì)體電融合 （ 邱景蕓 ， 1995）。 合子的選擇及標(biāo)記 原生質(zhì)體在人工誘導(dǎo)下發(fā)生了廣泛的融合，在融合過程中，即包括了兩種不同原生質(zhì)體融合，也有同種原生質(zhì)體的融合，還有一部分未融合的原生質(zhì)體。同種原生質(zhì)體融合的多核原生質(zhì)體和未融合的原生質(zhì)體是我們需要排除的干擾部分。 為了順利篩選到融合子，需要對融合的親本進行遺傳標(biāo)記。常用的親本標(biāo)記方法有自然性狀標(biāo)記、顏色標(biāo)記、營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記、抗藥性標(biāo)記和單親或雙親滅活標(biāo)記。 (1) 自然性狀標(biāo)記 真菌不同種、屬其外部形態(tài)有較大差異，如菌落顏色、孢子形狀大小、孢子顏色、菌絲粗細(xì)等，如果兩親株在菌落形態(tài)上有顯著差異的話，我們可以通過觀察外部形態(tài)來初步判斷融合子。程驥等（程驥等， 2003）在選擇黑暗鏈霉菌與卡那鏈霉菌的融合子時，通過比較孢子顏色、孢子形狀、孢子大小和菌落顏色判定三種 44 株融合子，通過發(fā)酵測定其生物效價均比親株有所提高。食用菌 中也常將鎖狀聯(lián)合作為標(biāo)記選擇融合子。 (2)營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記是較為常用而準(zhǔn)確的標(biāo)記方法。通過物理化學(xué)誘變的方法使原生質(zhì)體喪失合成某種物質(zhì)的能力，在基本培養(yǎng)基上不能生長。兩親本分別帶有不同的營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，僅當(dāng)親本發(fā)生融合互補時，融合子才能在基本培養(yǎng)基上正常生長。如翁艷軍等（翁艷軍等， 2003）在青霉素產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體融合中采用營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記，取兩親本孢子懸液在 管下照射，影印法篩選營養(yǎng)缺陷型菌株，再通過生長譜測定法測出缺陷型菌株，其中一株為 另一株為過 合后，在基本培養(yǎng)基上篩選最終得到生物效價高的融合菌株。 營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記缺點在于進行誘變篩選常常使一些優(yōu)良性狀丟失和目標(biāo)產(chǎn)物生成量下降，再生率也有所降低，且存在回復(fù)突變現(xiàn)象。 (3) 抗藥性標(biāo)記 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 5 抗藥性標(biāo)記是利用親本細(xì)胞對某種藥物的敏感性差異的一種篩選融合子的方法。 1984 年， 用抗藥性標(biāo)記對融合子進行選擇，他們通過誘變得到 啶黃抗性， 啶黃敏感兩株親本，融合處理后在含有吖啶黃的基本培養(yǎng)基上選擇融 合子。徐京寧也通過抗藥性標(biāo)記進行了林可鏈霉菌原生質(zhì)體的融合?？顾幮詷?biāo)記需要掌握藥物的合理濃度，濃度過高會使融合頻率降低，濃度過低則會使親本生長影響融合子的檢出（章文賢 ,2001;曹軍 ,2001;羅立新， 2004）。 (4)熒光染色標(biāo)記 熒光染色標(biāo)記是利用一些熒光染料直接對原生質(zhì)體進行標(biāo)記。熒光染料是一類含有苯環(huán)的化合物，它們能夠進入活體細(xì)胞和蛋白質(zhì)或 合，在不同波長的激發(fā)光源下呈現(xiàn)不同顏色，通過熒光顯微鏡觀察到細(xì)胞呈現(xiàn)不同顏色。熒光素類如 異硫氰酸熒光素 ( 488氬離子激光激發(fā)能產(chǎn)生綠色 的發(fā)射光，是微生物融合中常用的熒光染料。此外也有若丹明類熒光染料。 燕克勤 等（ 燕克勤 等， 1997）在紫孢側(cè)耳與糙皮側(cè)耳的原生質(zhì)體融合中，采用 異硫氰酸熒光素 (記的紫孢側(cè)耳單核原生質(zhì)體與未標(biāo)記的糙皮側(cè)耳單核原生質(zhì)體經(jīng) 在倒置顯微鏡下 ,用顯微操縱儀直接吸取一方帶有熒光另一方不帶熒光的原生質(zhì)體對 ,經(jīng)培養(yǎng)后 ,根據(jù) “ 鎖狀聯(lián)合 ” 這一形態(tài)特征挑選出融合子 ,融合率為 0 外，在金針菇、香菇的原生質(zhì)體融合中也都有使用熒光染色（ 成亞利等， 1997）。 綠色熒光蛋白（ （ 2002）是一種能產(chǎn)生綠色熒光的蛋白質(zhì)，人們通過轉(zhuǎn)基因的方法使其在細(xì)胞中表達，從而使細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，因此它可以用來標(biāo)記細(xì)胞融合， (999)于 1999 年將其應(yīng)用到柑橘類植物細(xì)胞的融合中。 (5)滅活標(biāo)記 滅活標(biāo)記是通過物理、化學(xué)方法使原生質(zhì)體存活率降低，如使用 射，高溫處理，化學(xué)試劑碘乙酰胺處理。原生質(zhì)體經(jīng)過處理后其細(xì)胞內(nèi)某些成分被破壞，或重要代謝途徑被抑制阻斷，從而不能在再生培養(yǎng)基上正常生長。人們通常 認(rèn)為射線有破壞細(xì)胞核的作用，而溫度可以使核糖體 16S 小亞基受損，碘乙酰胺處理則抑制巰基酶的活性（ 岑沛霖， 2001）。 單株親本滅活后與未滅活的親本發(fā)生融合，通過遺傳重組使受損部位得到恢復(fù)，再同其它標(biāo)記結(jié)合起來就能方便篩選融合子。王澄澈等（王澄澈等， 2000）利用香菇雙核野生型菌株經(jīng) 60高溫滅活原生質(zhì)體 ,與 理篩選到脯氨酸營養(yǎng)缺陷型鳳尾菇單核體菌株 ,通過 學(xué)融合的方法篩選到不同的融合子 ,經(jīng)傳代培養(yǎng)得到綜合兩親本特性的子實體。 對兩親本分別采用不同的滅活方法滅活，由于所破壞的部位不同，因此融合子通過 互補作用能恢復(fù)生長。 李祥鍇 等（ 李祥鍇 等， 2001） 分別以紫外線、熱滅活林肯鏈霉菌 947 和 9502 原生質(zhì)體 ,然后進行滅活雙親的原生質(zhì)體融合 ,從 16 株融合子篩選到林肯霉素高產(chǎn)株。 孫劍秋等（孫劍秋等， 2002）以紫杉醇產(chǎn)生菌樹狀多節(jié)孢的誘發(fā)突變株 出發(fā)菌株 ,4熱滅活 5分鐘 ,05S,滅活雙親經(jīng) 融合頻率達到 10選得到融合株 (6) 分子標(biāo)記 不同種類細(xì)胞含有的蛋白質(zhì)、 有特異性，這些特異性的分子就可以作為菌株的分子標(biāo)記，利用這些特異性分子標(biāo)記來檢測融合子。常用的分子標(biāo)記有同工酶標(biāo)記， 記， 記等。王淑珍等（王淑珍等， 2003）利用 記對靈芝和糙皮側(cè)耳原生質(zhì)體融中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 6 合子基因組進行了分析，證明兩親本的核物質(zhì)在融和子中發(fā)生了重組，而融合子在 平上更接近于靈芝。分子標(biāo)記能夠?qū)θ诤献舆M行精細(xì)準(zhǔn)確的鑒定分析，并可以驗證其它標(biāo)記篩選的結(jié)果，越來越多地被人們所采用。 生質(zhì)體融合技術(shù)在新菌株培育中的應(yīng)用 原生質(zhì)體融合技術(shù)作為一種相對獨 立的生物工程技術(shù)，是其它生物工程技術(shù)不可替代的。因為用常規(guī)的物理化學(xué)誘變方法進行育種時，雖然能夠使微生物發(fā)生突變，偶爾可以篩選到個別正突變的菌株，但當(dāng)菌株的性狀達到一定水平之后，再重復(fù)使用常規(guī)的誘變育種就會受到極大的限制，而使用基因工程進行育種往往要求較高的設(shè)備條件，難以廣泛開展。因此原生質(zhì)體融合技術(shù)在基因工程育種中占有不可替代的地位，被廣泛應(yīng)用于真菌、細(xì)菌、以及植物的選育中。 （ 1）抗生素高產(chǎn)菌株的選育 利用原生質(zhì)體融合技術(shù)不但可以用于提高抗生素的產(chǎn)量，同時可以用于融合子產(chǎn)生新的抗生素研究，特別是在鏈霉菌 育種中（ 2001）。賀敏霞等（賀敏霞等， 1989）通過諾卡氏菌原生質(zhì)體融合重組研究發(fā)現(xiàn) 3 株融合子產(chǎn)生親株沒有的抗生物質(zhì)，還得到 1 株甾體轉(zhuǎn)化活力明顯高于親株的融合子。林容團等（林容團等， 1990）以天然無抗菌活性的變青鏈霉素菌 1326 與鏈霉菌 1254 營養(yǎng)缺陷型突變株進行種間原生質(zhì)體融合，篩選得到 5 株抗菌活性較穩(wěn)定的融合菌株。曾紅梅等（曾紅梅 1995）通過原生質(zhì)體融合的方法提高了農(nóng)抗武夷菌素的效價。陳五嶺等 (陳五嶺等 ,1998)通過比較 光和聚乙二醇（ 紅霉素鏈霉菌 (龜 裂鏈霉菌（ 活原生質(zhì)體的誘導(dǎo)融合，篩選得到幾株紅霉素產(chǎn)量明顯高于親株的融合子。王金盛等 (王金盛， 1999)以小諾霉素（ 生菌棘胞小單胞菌（ 出發(fā)菌株，通過單親滅活原生質(zhì)體融合，鏈霉素產(chǎn)量為篩選條件選出融合株，得到 量高于親株的融合子。 （ 2）酵母菌工程菌構(gòu)建 龐小燕等 (龐小燕 ,2001)以酒精酵母和熱帶假絲酵母為親株，通過原生質(zhì)體融合技術(shù)獲得了即具有糖化酶活性又能高產(chǎn)酒精的穩(wěn)定的酵母融合株。高玉榮（高玉榮， 2001）利用發(fā)酵能力強的葡萄酒酵母和降酸能力強、發(fā)酵性能好的粟酒裂殖酵母進行融合，獲得穩(wěn)定性強融合子，用原生質(zhì)體融合技術(shù)培養(yǎng)選育出的優(yōu)良菌株降酸率可達 比葡萄酒酵母降酸性能提高 20。1994）等將能夠分解纖維素的 從葡萄糖產(chǎn)酒精的 行融合，得到兩株具有很強將纖維素轉(zhuǎn)化為酒精的能力。文鐵橋等（文鐵橋， 1999）通過 導(dǎo)典乙 酸滅活呼吸缺陷克魯維酵母原生質(zhì)體與釀酒酵母原生質(zhì)體融合，獲得 45發(fā)酵產(chǎn)酒率達 高溫酵母菌株 （ 3）其它有益菌的選育 原生質(zhì)體融合技術(shù)廣泛應(yīng)用于產(chǎn)酶菌株的選育，主要是淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶的產(chǎn)酶菌株，通過融合提高菌種的產(chǎn)酶活力、改變菌種酶分泌的種類或使產(chǎn)酶菌株獲得新的優(yōu)良性狀。日本 學(xué)以檸檬酸生產(chǎn)菌株黑曲霉（ 纖維素酶生產(chǎn)菌株綠色木酶（ 親株進行原生質(zhì)體的融合，篩選得到一類融合子能夠在甘蔗渣固體培養(yǎng)基上生長并產(chǎn)生檸檬酸。 融合子兼具了綠色木酶產(chǎn)纖維素酶的能力和黑曲霉產(chǎn)檸檬酸的能力。曹軍等（曹軍， 2001）中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院碩士學(xué)位論文 第一章 文獻綜述 7 以棲土曲霉種內(nèi)非營養(yǎng)缺陷型進行原生質(zhì)體融合，融合子為一雜合二倍體，產(chǎn)角蛋白酶活力較親株明顯提高。 周德明（周德明 ,2001）采用原生質(zhì)體融合技術(shù)將球形紅假單胞菌和釀酒酵母構(gòu)建成高效降解工程菌，用于廢水處理的比降解率明顯提高。裘娟萍等（裘娟萍，王普 ,2001）以紅發(fā)夫酵母（ 出發(fā)菌株經(jīng)誘變產(chǎn)生總色素產(chǎn)量高的突變株，再同野生型進行原生質(zhì)體融合，融合子總色素產(chǎn)量比親株提高 169 。程樹培等（程樹培，鄧良偉 ,1997）將光合細(xì)菌與酵母菌進行融合，用于連續(xù)發(fā)酵豆制品廢水處理。 (2004)用紫外誘變根霉（ 子篩選營養(yǎng)缺陷型突變株，選擇其