【畢業(yè)學(xué)位論文】家蠶、野桑蠶LSP與HSC70-4基因啟動子功能特性分析博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 家蠶、野桑蠶 究 生： 唐順明指 導(dǎo) 教 師： 李奕仁 張志芳申請學(xué)位類別： 農(nóng)學(xué)博士專業(yè)領(lǐng)域名稱： 特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng)研 究 方 向：家蠶遺傳育種 培 養(yǎng) 單 位： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)研究所提交日期 2004 年 06 月 2004 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議) 研究生簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 論文評閱人與答辯委員會成員名單 論 文 評 閱 人：呂鴻聲 研究員 中國農(nóng)科院植保所 徐俊良 教 授 浙江大學(xué) 孫崇榮 教 授 復(fù)旦大學(xué) 答辯委員會主席：吳祥甫 研究員 中國科學(xué)院上海生化所 答辯委員會成員：沈桂芳 研究員 中國農(nóng)科院生物技術(shù)所 孫崇榮 教 授 復(fù)旦大學(xué) 魯興萌 教 授 浙江大學(xué) 貢成良 教 授 蘇州大學(xué) 郭錫杰 研究員 中國農(nóng)科院蠶業(yè)研究所 何家祿 研究員 中國農(nóng)科院蠶業(yè)研究所 論文答辯日期：2004 年6月 目 錄 英文縮寫說明 摘要 第一章 文獻(xiàn)綜述 1 因轉(zhuǎn)錄水平的順式作用元件 1 心啟動子 1 動子上游序列 2 強(qiáng)子 2 緣子 3 序與組織特異性調(diào)控序列 3 別控制與同源異型盒 3 應(yīng)元件 4 式作用因子 4 素對昆蟲基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控 5 種主要昆蟲激素的生物學(xué)功能 5 蟲激素對相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控 7 蠶基因啟動子調(diào)控序列研究進(jìn)展 9 素基因啟動子10 膠基因啟動子 11 25 基因啟動子 12 藏蛋白基因啟動子12 殼蛋白基因啟動子13 動蛋白基因啟動子14 結(jié) 15 第二章 研究目的與內(nèi)容 16 究目的與意義 16 究內(nèi)容 17 蠶、野桑蠶 動子的特性分析17 蠶、野桑蠶 動子的功能特性分析17 家蠶、野桑蠶 動子活性的增強(qiáng)功能17 第三章 一般實驗材料和方法 18 驗材料 18 蟲細(xì)胞、 家蠶與野桑蠶18 蟲激素18 粒和菌種18 試劑及試劑盒18 它主要試劑18 菌培養(yǎng)基18 蟲細(xì)胞培養(yǎng)基19 用溶液及緩沖液19 用主要儀器和設(shè)備21 通實驗方法 21 胞的傳代21 胞的凍存21 胞的復(fù)蘇22 胞計數(shù)22 能質(zhì)粒由脂質(zhì)體介導(dǎo)在昆蟲細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染22 能質(zhì)粒在細(xì)胞和家蠶幼蟲中的轉(zhuǎn)染、瞬間表達(dá)及激素處理22 能質(zhì)粒在細(xì)胞中的轉(zhuǎn)染、瞬間表達(dá)及熱激處理22 能質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后四齡家蠶幼蟲的熱激處理23 能質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后五齡家蠶幼蟲的熱激處理 23 能質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后五齡家蠶幼蟲的冷激處理23 蠶、野桑蠶基因組 制備方法23 度測定24 因組 堿變性方法24 應(yīng)24 法少量快速抽提質(zhì)粒 25 法大量制備質(zhì)粒 25 制性內(nèi)切酶反應(yīng)25 段的分離與回收26 連接26 粒 轉(zhuǎn)化26 組質(zhì)粒的鑒定26 胞抽提物的制備27 光素酶分析27 白質(zhì)濃度測定27 27 第四章 野桑蠶、家蠶 因 5側(cè)翼區(qū)的克隆與序列分析 29 料與方法 29 驗材料與試劑29 物的合成29 桑蠶、家蠶基因組 提取29 克隆野桑蠶、家蠶 因 5側(cè)翼區(qū)片段及其純化30 蠶的 因 5側(cè)翼區(qū)片段的亞克隆及測序 30 果與分析30 桑蠶、家蠶 因 5側(cè)翼區(qū)片段的擴(kuò)增30 組質(zhì)粒 R、 R 的酶切鑒定30 R、 R 測序結(jié)果與序列分析30 論 31 第五章 家蠶幼蟲血清蛋白基因( 動子特性分析37 料與方法 37 驗材料37 告質(zhì)粒 I） 構(gòu)建 38 失不同調(diào)控元件的啟動子的報告質(zhì)粒構(gòu)建38 粒的提取、酶切、段制備、連接與轉(zhuǎn)化 38 蠶細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 38 時表達(dá)測定分析 39 果與分析 42 失突變啟動子的報告質(zhì)粒的酶切鑒定42 胞中 I） 啟動子的轉(zhuǎn)錄活性 42 一內(nèi)含子對 因啟動子活性影響42 動子上游區(qū)對 因啟動子活性影響 45 調(diào)控元件對 因啟動子活性影響的比較分析 45 源昆蟲激素對 因啟動子活性影響 46 論 48 第六章 野桑蠶、家蠶熱激同源蛋白基因（ 5側(cè)翼區(qū)的克隆與序列分析 50 料與方法 50 驗材料50 物的合成50 桑蠶、家蠶基因組 提取51 克隆野桑蠶、家蠶 因 5側(cè)翼區(qū)片段及其純化51 桑蠶、家蠶的 因 5側(cè)翼區(qū)片段的亞克隆及測序51 列分析與可能的順式調(diào)控元件的預(yù)測51 果與分析51 桑蠶、家蠶 因 5側(cè)翼區(qū)片段的擴(kuò)增 51 桑蠶、家蠶、因 5側(cè)翼區(qū)片段的測序結(jié)果與序列分析51 論 52 第七章 家蠶 因啟動子的功能分析 55 料與方法 55 料55 法 55 果與分析 58 告質(zhì)粒 酶切鑒定58 58 激處理對 動子在 f 細(xì)胞和蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性的影響 59 激處理對 動子在五齡家蠶體內(nèi)轉(zhuǎn)錄活性的影響60 動子在五齡家蠶不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄活性61 源昆蟲激素對 動子轉(zhuǎn)錄活性的影響 61 論 62 第八章 野桑蠶 因啟動子的功能分析 65 料與方法 65 料 65 法 65 果與分析 65 告質(zhì)粒 酶切鑒定65 常態(tài)下 動子的轉(zhuǎn)錄活性65 激處理對 動子在 胞和蠶體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄活性的影響 66 論 66 第九章 家蠶、野桑蠶 因啟動子活性的增強(qiáng)功能 68 料與方法 69 料69 法 69 果與分析 70 告質(zhì)粒的酶切鑒定70 胞內(nèi) 動子轉(zhuǎn)錄活性的增強(qiáng)作用 71 家蠶體內(nèi) 動子的轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)作用 71 動子組合在五齡家蠶不同發(fā)育階段的轉(zhuǎn)錄活性 72 動子組合的活性的影響73 論 74 第十章 結(jié)論 75 m/R 克隆與 動子功能特性分析結(jié)論75 m/R 片段克隆及其功能特性分析結(jié)論 77 著增強(qiáng) 動子轉(zhuǎn)錄活性79 參考文獻(xiàn) 81 致謝 91 附錄（測序圖） 92 攻讀博士期間發(fā)表論文統(tǒng)計 102 作者簡歷 104 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 英文縮寫說明 英文縮寫說明 55m: 0-4 0-4 0-4 0-4 0 H: f: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 摘要 摘 要 從家蠶、 野桑蠶基因組 隆了 因啟動子 調(diào)控區(qū)， 以 報告基因，構(gòu)建了系列報告質(zhì)粒， 經(jīng) 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞或蠶體內(nèi)瞬時表達(dá)， 對 m/為進(jìn)一步闡明 因的表達(dá)調(diào)控分子機(jī)理奠定了基礎(chǔ)， 同時為 因啟動 子實際應(yīng)用進(jìn)行了探索研究。 本論文的主要研究內(nèi)容如下： 一、 R 克隆與 動子功能特性分析 克隆的 R 片段經(jīng) 測序分析， 涵蓋了 第一內(nèi)含子， 第一外顯子、 核心啟動子區(qū)及其 5上游 區(qū)四部分；在啟動子區(qū)域內(nèi)有經(jīng)典的 ，脂肪體內(nèi)組織特異性表達(dá)基因的共 有 序列和推 定 的激素響 應(yīng) 元件， 5上游 區(qū)發(fā)現(xiàn)了 與 家蠶絲素 輕 鏈基因第 一 內(nèi)含子 區(qū)域的高度同源序列和失活的部分水手轉(zhuǎn)座子元件 （ 。采 用 和限制 性內(nèi)切酶法獲得了系列缺失 因啟動子， 在 胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)考察了第一內(nèi)含子 （ I） 、 含絲素 輕鏈基因第一內(nèi)含子區(qū)域同源序列（ S）以及 因啟動子的轉(zhuǎn)錄活性的影響，結(jié)果表明 I 能顯著增加啟動子的轉(zhuǎn)錄活性達(dá) ， S 增加 啟動子轉(zhuǎn)錄活性 ，暗示在 I、 S 中可能存在類似增強(qiáng)子的元件。而 抑制啟動子的轉(zhuǎn)錄活性。昆蟲激素 動子轉(zhuǎn)錄活性影響呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)， 1 g/理增加 ， 2 g/理 不影響， 8 g/理顯著降低轉(zhuǎn)錄活性 ；而 理對其活性沒有顯著影響。 二、 隆及啟動子功能特性分析 克隆的 R 經(jīng)測序分 析涵蓋了部分第一外顯子和啟動子區(qū)； 推測了可能存在的順式作用元件有 6 個 、 2 個 和 2 個 熱激響應(yīng)因子（ 合元件，但沒有發(fā)現(xiàn)經(jīng)典的 與 。在常態(tài)下 動 子 、 動子在 胞、 胞和五齡蠶體內(nèi)都呈現(xiàn)高轉(zhuǎn)錄活性； 37熱 激處理 胞和四齡蠶體能增加啟動子的轉(zhuǎn)錄活性， 且在 胞中熱激效果更為明顯， 而在五齡家蠶體內(nèi)熱激處理卻抑制其轉(zhuǎn)錄活性； 在五齡家蠶體內(nèi)， 影響 動子 轉(zhuǎn)錄活性， 低劑量 而高劑量 （ 5 g ） 處理沒有顯著影響； 在家蠶五齡蠶體內(nèi)不同發(fā)育階段 動子的轉(zhuǎn)錄 活 性有所波 動 ，到熟蠶 期 達(dá)到最高 。 以上結(jié)果 表 明 動子既具有組成型特征，又有一定的誘導(dǎo)型特征。 三、 動子活性的增強(qiáng)功能 來源 于 源序列，具有 制起始位點和增強(qiáng)子的雙重功能。結(jié)果表明 增 強(qiáng) 動子活性，在 胞內(nèi)增強(qiáng) 16，且 與 入方向無關(guān)；在蠶體內(nèi)分別增強(qiáng) , ；在五齡家蠶體內(nèi)， 影響 ，不同劑 量 理顯著提高 轉(zhuǎn)錄活性； 在家蠶五 齡 蠶體內(nèi)不 同 發(fā)育階段動子組合的轉(zhuǎn)錄活性有所波動，到熟蠶期達(dá)到最高，這與 動子一致，說明 是增強(qiáng) 轉(zhuǎn)錄活性，并不改變特性。以上結(jié)果顯示 動 子組合更適合在細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因家蠶中驅(qū)動目的蛋白基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。 關(guān)鍵詞： 家 蠶 ， 野桑蠶 ， 幼蟲血清 蛋白基因， 熱激同源蛋白 70因 ， 啟動子功 能特性分析 摘要 he SP NA . . A of SP mN or by of be to SP to of in or 1. FR of in in S) CR a of by mN of on is by a on of on no 2. of C By 7 mN to a of no of H (1g H (5 g no of is at in in we 摘要 is in or 3. . as in NA of 6mN is In MH of g MH os is HA no on of is at of is t or to it is To of in by in we at or 0-4 of 第一章 文獻(xiàn)綜述 第一章 文獻(xiàn)綜述 在成千上萬的真核生物基因中， 在特定的時間， 只有 15%左右 的基因能在特定的細(xì)胞中表達(dá) 。根據(jù)機(jī)體的不同發(fā)育階段， 不同的組織及不同的功能狀態(tài)， 選擇性、 程序性地在特定數(shù)量的特定基因被激活 (et 992)，表達(dá)有 功能的 蛋白質(zhì)等產(chǎn)物，從而使生物的組織與器官在一定的環(huán)境條件下保持正常的功能。 這一系列的過程稱為基因表達(dá)的調(diào)控。 基因的表達(dá)調(diào)控根據(jù)其在同一事件中發(fā)生的先后次序， 可分為轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控 （ ， 轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控（ ， 翻譯水平調(diào)控（ ，蛋白質(zhì) 加工水平的調(diào)控 （ 等。而 轉(zhuǎn) 錄水平 調(diào)控 被認(rèn)為 基因 表達(dá)最 重要 的調(diào)控 方式 之一。 基 因的轉(zhuǎn)錄受特定的順式作用元件 （ 的影響， 如啟動子， 增強(qiáng)子等功能元件， 同時還受到反式 作用因子（ 調(diào)控 ，如蛋白質(zhì) 分子、激素 蛋白質(zhì)的復(fù) 合物等一 些具有可擴(kuò)散特性的物質(zhì)。 一般來說， 轉(zhuǎn)錄水平上基因的表達(dá)調(diào)控是通過順式作用元件與反式作用因子間復(fù)雜的相互作用來實現(xiàn)的。 昆蟲是地球上最多的物種，包括一些有益經(jīng)濟(jì)昆蟲（如蜜蜂、家蠶等）和大量的有害昆蟲。昆蟲基因表達(dá)調(diào)控機(jī)理的解析是了解包括殺蟲劑與抗病性、 行為、 進(jìn)化和發(fā)育等在內(nèi)的昆蟲相關(guān)的重大問題的重要組成部分。 運用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段， 相關(guān)的結(jié)構(gòu)基因已經(jīng)可以得到闡明， 而這些基因的表達(dá)調(diào)控卻知之甚少。順式作用元件 列 引導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白質(zhì)（反式作用因子） 的裝配與否或效率高低直接影響到基因轉(zhuǎn)錄水平。 另外， 與編碼區(qū)相比， 順式作用元件的變異更為頻繁以適應(yīng)環(huán)境條件的變化， 而這些變 異被認(rèn)為是昆蟲形態(tài)學(xué)多樣性與發(fā)育機(jī)理進(jìn)化等方面的主要驅(qū)動力（ 2001; 2000） 。 因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的順式作用元件 是指一個基因轉(zhuǎn)錄起始位點 5端 緊鄰的 列，一般由 （ 、 起始 區(qū) （ 和下 游啟動子元件 （ 組成。 核 心啟動子的堿基序列、 位置與功能上具有高度的保守性。 單一的核心啟動子元件能使基因在一個較為恒定的低水平上表達(dá)。 ： 核心啟動子區(qū)通常包含一段富含 基對的 基序列基序， 稱為 （又稱 ） 。 的功能受到與轉(zhuǎn)錄起始位點相對應(yīng)的方向、 序列及位置的限制， 一般位于帽位點上游 30 合蛋白質(zhì) （ 結(jié)合， 后者充當(dāng)其它轉(zhuǎn)錄因子和 合酶的互作點。因而 的主 要功能是參與轉(zhuǎn)錄的起始，從而影響基因的轉(zhuǎn)錄水平。 起始區(qū) （ ： 在無脊椎動物中， 與轉(zhuǎn)錄起始位點相鄰的一段保守的 列構(gòu)成的調(diào)控元件稱為起始區(qū)。 結(jié)合 et 1999; et 1994） 。 下游啟動子元件（ ：一般位于 +30有 保守的 A/C/列，可以與 子另外的錨定位點（ et 1998） 。 1中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士學(xué)位論文 第一章 文獻(xiàn)綜述 上述的三種元件并不是存在于所有的核心啟動子中。 對果蠅的 205 個 啟動子調(diào)查表明， 將近50%啟動子存 在可識別的 列， 50%啟動子存 在 約三分之一的啟動子兩者都不存在（ et 2000） 。四分之一節(jié)肢動物基因啟動子存在 et 993） 。 在 合酶 制轉(zhuǎn)錄的基因的 5端上游區(qū)常發(fā)現(xiàn)一些特征調(diào)控序列， 如 富 含 啟動子元件， 這些調(diào)控序列統(tǒng)稱為啟動子上游序列。如八體序列（ ， 基因表達(dá)的時序性、組織特異性有關(guān)。 啟動子上游序列的位置一般比較固定， 距帽位點上游 但方向卻 不定。它對啟動子高活性是必需的。 +30 基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄啟動子 增強(qiáng)子 （ 小一般在 或絕緣子（ 強(qiáng)子（在 的et 998)盡管增強(qiáng)子自己并不能啟動自己進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，性， 可以使基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄速率增加那么它便可以在所有類型的細(xì)胞中發(fā)揮作用；因子的結(jié)(2003)增強(qiáng)子具有下列的一般特性：增強(qiáng)子不 錄調(diào)控的順式作用元件示意圖 （ 包括轉(zhuǎn)錄起 始位點 （ 上下 100結(jié)合普通的轉(zhuǎn)錄因子。50點不固定，與特殊的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，控制基礎(chǔ)轉(zhuǎn)錄的水平。邊界元件（指阻止臨近的調(diào)控元件對其所界定的基因的啟動子起增強(qiáng)或抑制作用的一類邊界序列。 增強(qiáng)子是一種參 與基因轉(zhuǎn)錄 激活的順式 作用的調(diào)節(jié) 元件，最早啟動子中發(fā)現(xiàn)的，現(xiàn)已在多種生物的基因啟動子中找到了增強(qiáng)子元件。增強(qiáng)子可以在遠(yuǎn)位置， 無論 是在其 上游 或下游 ，無 論何種 取向 ，均可 發(fā)揮 其功能 (et 1981; 。 但卻能以不同的效率等級， 增強(qiáng)啟動子的表達(dá)活1左右。 如果增強(qiáng)子含有組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點 ，而 如果增強(qiáng)