【畢業(yè)學(xué)位論文】家蠶無鱗片翅突變體scaleless 產(chǎn)生機(jī)理的研究博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 學(xué)位論文 家蠶無鱗片翅突變體 生機(jī)理的研究 on of in 士 研 究 生：周慶祥 指 導(dǎo) 教 師：張志芳 研究員 申 請 學(xué) 位 類 別：農(nóng)學(xué)博士 專 業(yè)：特種經(jīng)濟(jì)動物飼養(yǎng) 研 究 方 向：昆蟲發(fā)育生物學(xué) 培 養(yǎng) 單 位：蠶業(yè)研究所 研究生院 提交日期 2007 年 6 月 on of in 2007 獨(dú) 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下 進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導(dǎo)師簽名： 時間： 年 月 日 要 翅面被覆鱗片是鱗翅目昆蟲的主要特征之一；鱗片對于鱗翅目昆蟲具有重要的生理意義，而鱗片構(gòu)成的各種翅面圖案具有特定的發(fā)育機(jī)制和進(jìn)化模式，因此鱗翅目昆蟲的鱗片在昆蟲生理學(xué)、發(fā)育生物學(xué)以及生物進(jìn)化，甚至害蟲防治上都具有重要的研究價值。本文以家蠶無鱗片翅突變體 材料，從形態(tài)學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)角度對突變體的產(chǎn)生機(jī)理進(jìn)行了研究， 力圖闡明無鱗片翅突變表型的發(fā)生機(jī)理； 并為鱗翅目昆蟲鱗片的發(fā)育機(jī)制提供理論參考。 首先從探明家蠶翅的生長發(fā)育機(jī)制入手，調(diào)查了五齡幼蟲及蛹期翅原基（翅）的大小和形態(tài)變化，并建立了翅原基摘除和移植技術(shù)，為論文的深入研究提供實(shí)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)。翅原基在五齡前期生長緩慢，變態(tài)前生長最快；蛹期翅芽大小基本不變，但伴隨有鱗片的形成和色素沉積過程。家蠶幼蟲期的造血器官緊密附著在翅原基上，形成造血器官 齡早期將 4 個造血器官 蠶幼蟲仍能正常生長并發(fā)育成蛹和具有交配及產(chǎn)卵能力的蛾；同時其發(fā)育過程中血球總數(shù)仍呈增長趨勢，但是明顯低于正常蠶，由此推測化蛹變態(tài)中造血器官的崩解是變態(tài)的結(jié)果而不是其必要因素。 全部造血器官 H 或 認(rèn)為保幼激素在造血器官 運(yùn)用建立的翅原基（翅）解剖技術(shù)，分析了家蠶突變體 表型性狀，發(fā)現(xiàn)其成蟲翅面鱗片明顯比野生型（ 少，并且所具有的少量鱗片比野生型的小且分叉少。五齡幼蟲翅原基的相互移植實(shí)驗(yàn)證明決定這一突變性狀的調(diào)控因子不存在于體液中，而是存在于翅原基自身內(nèi)部?；记?翅原基與 在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上沒有明顯差異，化蛹后 蠶的翅脈開始出現(xiàn)氣管分叉并延伸進(jìn)入翅面， 2 d 蛹時已經(jīng)可以看到翅脈之間的氣管相互交織形成網(wǎng)狀；但是 蠶蛹的翅脈中氣管分叉少并且延伸不良。蛹期經(jīng)過高氧分壓處理可以部分挽回蠶翅面的鱗片，使其成蟲翅面鱗片明顯增多。在幼蟲五齡早期的翅原基表面劃一道淺的刻痕使翅脈受傷，亦可形成成蟲翅面鱗片少的表型。因此我們推測翅原基的翅脈中氣管發(fā)育異常致使翅面細(xì)胞缺氧是導(dǎo)致 片變少的一個重要原因。 進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)闡明了 變體家蠶細(xì)胞生物學(xué)方面的產(chǎn)生機(jī)理。 B 染色及 活性分析結(jié)果顯示在蛹的早期，翅面鱗片的發(fā)育伴隨有細(xì)胞凋亡的參與。 2 d 時大量翅面細(xì)胞凋亡，存活的細(xì)胞則整齊地排列在翅的表面。 蠶不同于野生型，其翅面大量細(xì)胞凋亡現(xiàn)象比 現(xiàn)的晚 1 天，且翅面細(xì)胞幾乎全部死亡；并且 的最大活性相當(dāng)于 近 10 倍。 同時有關(guān)凋亡小體和 段化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也說明 期翅面細(xì)胞過度凋亡，從而產(chǎn)生了成蟲翅面少鱗片的突變性狀。 因與果蠅背板剛毛的發(fā)育有關(guān)； 同源體基因（ 控制著蝴蝶翅面鱗片的形成。為了從分子生物學(xué)角度闡明家蠶 變體的產(chǎn)生機(jī)理，克隆并鑒定了家蠶的 源體基因。 發(fā)現(xiàn)家蠶至少有四個 因， 分別命名為 四個基因均具有明顯的 序， 并且前三個基因編碼的蛋白質(zhì)的 617 個氨基酸組成的保守區(qū)，這些都符合 源體基因的特點(diǎn)。同源性比較和進(jìn)化分析說明三 最早分化形成的一個； 源性最高，推測相對于 成較晚。用 實(shí)時熒光定量 測了家蠶 因在幼蟲期不同組織器官及胚胎發(fā)育過程中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn) 達(dá)范圍最廣，胚胎發(fā)育過程中也有較高的表達(dá)量；而 達(dá)特異性相對較高，因此推斷其形成較 晚，即四個家蠶 因中最晚形成的一個。 因主要在神經(jīng)前體細(xì)胞中表達(dá)，因此達(dá)范圍較窄，組織中總體表達(dá)量較低。但同源比較和功能分析都不能將家蠶的三個原神經(jīng)基因和果蠅的一一對應(yīng)，因此其命名依然按照發(fā)現(xiàn)的先后順序進(jìn)行。 通過半定量 現(xiàn)家蠶的吐絲期和蛹期， 因在 蠶中的表達(dá)時相幾乎一致； 在 0 d 2 d 的 翅中表達(dá)，而 沒有檢測到表達(dá)信號。原位雜交結(jié)果也證明 翅中不能正常表達(dá)。將 因起始密碼子上游的啟動子序列克隆并測序，發(fā)現(xiàn) 游1 027 有一段連續(xù) 26 缺失突變。利用家蠶細(xì)胞瞬時表達(dá)系統(tǒng)分析了 因啟動子活性，發(fā)現(xiàn) 得多，只與截去了其缺失的 26 979 T 啟動子片段的活性相當(dāng)。 果顯示 失的 26 列可以特異性結(jié)合某種核蛋白。遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)則證明 26 列缺失與無鱗片翅突變表型緊密連鎖。 這些都說明 因因啟動子突變而使其不能正常轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。利用瞬時表達(dá)系統(tǒng)使 因在 期蛹翅中表達(dá)，可以使翅面鱗片明顯增多，進(jìn)一步說明 家蠶翅面鱗片產(chǎn)生的關(guān)鍵因子。從而初步闡明了家蠶無鱗片翅突變體 生的分子機(jī)理。 關(guān)鍵詞： 家蠶， 變體，翅原基，鱗片，產(chǎn)生機(jī)理 he of on of is a of by a So of In we on to of on of We of in We in of We a of is or to in of by a as We of of we of on of by of of in We of of be a of a of in a of of in by us We of it in of T T a a a in a WT T at to no T to a on in At no of if of a T. we 2of in of in in It is is on of in We to of of at O/EB in d, be on of sl at in sl T. in sl as as T. NA in sl a of In to of of sl at we by a a 16aa at of We in CR in of a in so we it at to so we of of in in d WT in a 6 1 027 bp in s of T, as 79 bp T 6 6 bp a 6 bp of in s s If in on is a of 錄 第一章 引 言 . 1 內(nèi)外研究現(xiàn)狀（文獻(xiàn)綜述） . 1 全變態(tài)昆蟲的成蟲盤之一 翅原基 . 鱗翅目昆蟲的翅面鱗片 . 果蠅剛毛的發(fā)育 . 合體（ 其同源體（ . 氧氣供應(yīng)與鱗片發(fā)育的關(guān)系及氣管發(fā)生的調(diào)控機(jī)制 . 家蠶血球的生成機(jī)理 .究目的和意義 . 11 究目的 . 11 究意義 . 11 究內(nèi)容 . 12 蠶翅原基發(fā)育規(guī)律的研究及翅原基摘除、移植技術(shù)的建立 . 家蠶無鱗片翅突變體 形態(tài)學(xué)分析 . 家蠶無鱗片翅突變 體 期翅面細(xì)胞凋亡研究 . 家蠶 源體基因的克隆、鑒定與分析 . 家蠶無鱗片翅突變體 成的分子機(jī)理 .二章 家蠶翅原基發(fā)育規(guī)律的研究 . 14 料與方法 . 14 蠶 . 翅原基的解剖與測量 . 翅原基的摘除實(shí)驗(yàn) . 翅原基的移植實(shí)驗(yàn) .果 . 15 齡幼蟲及變態(tài)過程中翅原基的大小變化 . 家蠶五齡幼蟲翅原基及蛹期翅芽形態(tài)的變化 . 家蠶翅原基的摘除 . 家蠶翅原基的移植 .論 . 19 第三章 造血器官 . 21 料與方法 . 21 蠶 . 造血器官 . 造血器官 . 血細(xì)胞記數(shù) .果 . 22 部造血器官 . 造血器官 . 外源激素對 4蠶體內(nèi)血球數(shù)的影響 . 摘除不同數(shù)量翅原基對熟蠶體內(nèi)血球數(shù)的影響 .論 . 25 第四章 家蠶無鱗片翅突變體 形態(tài)學(xué)分析 . 27 料與方法 . 27 蠶 . 突變體 野生型家蠶翅（翅原基）的形態(tài)比較 . 突變體 野生型家蠶之間翅原基的解剖及相互異位移植 . 翅原基受傷對鱗片和翅發(fā)育的影響 . 高氧分壓處理蠶蛹 . 氣管叢的解剖 .果 . 29 T 與 蟲翅的形態(tài)比較 . 蠶間的翅原基相互異位移植 . 蠶五齡幼蟲翅原基及蛹期翅芽的解剖與觀察 . 翅原基表面劃痕和主氣管切斷對鱗片和翅發(fā)育的影響 . 高氧分壓對翅面鱗片發(fā)育的影響 . 無鱗片翅突變體 野生型家蠶氣管系統(tǒng)的比較 .論 . 33 第五章 家蠶無鱗片翅突變體 期翅面細(xì)胞凋亡研究 . 35 料與方法 . 36 蠶 . 吖啶橙 /溴化乙錠（ B）和