【畢業(yè)學位論文】灰葡萄孢菌35kDa激活蛋白的純化及其cDNA文庫構(gòu)建碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 學位論文 灰葡萄孢菌 35活蛋白的純化 及其 庫構(gòu)建 5 士 研 究 生：武曉麗 指導教師：邱德文 研究員 申請學位類別：理學碩士 專 業(yè)：生物化學與分子生物學 研 究 方 向：蛋白藥物工程 培 養(yǎng) 單 位：中國農(nóng)業(yè)科學院研究生院 植物保護研究所 提交日期 2007 年 6 月 F 5 007 基金來源聲明 本學位論文是國家“863” 計劃（項目編號： 2006國家“ 973”計劃（項目編號：2003的部分內(nèi)容。 I 獨 創(chuàng) 性 聲 明 本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下 進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得中國農(nóng)業(yè)科學院或其它教育機構(gòu)的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。 研究生簽名： 時間： 年 月 日 關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明 本人完全了解中國農(nóng)業(yè)科學院有關(guān)保留、使用學位論文的規(guī)定，即：中國農(nóng)業(yè)科學院有權(quán)保留送交論文的復印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意中國農(nóng)業(yè)科學院可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內(nèi)容。 (保密的學位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議 ) 論文作者簽名： 時間： 年 月 日 導師簽名： 時間： 年 月 日 摘 要 激活蛋白（是一類源于真菌的新型蛋白激發(fā)子，前期研究發(fā)現(xiàn)該蛋白激發(fā)子具有誘導植物抗性和促進植物生長的作用。本研究以灰葡萄孢菌為實驗材料，首次從中提取出一種分子量為 35激活蛋白，生物活性測定表明，該蛋白可顯著提高煙草懸浮細胞過氧化氫含量的增加，并可促進豌豆幼苗生長，提高番茄對灰霉病的抗性?；移咸焰呔醇せ畹鞍椎陌l(fā)現(xiàn)豐富了激活蛋白家族，為激活蛋白作用機理的深入研究奠定了基礎(chǔ)。 1 首次利用 GE 0)純化出灰葡萄孢菌激活蛋白：先經(jīng) 子交換柱層析，再利用 5 分子篩層析進一步純化；經(jīng) 泳檢測得到 35單一條帶，該蛋白可顯著促進煙草懸浮細胞過氧化氫含量的增加，說明利用該方法可分離出灰葡萄孢菌激活蛋白。質(zhì)譜鑒定出三條肽段信息：該純化蛋白的兩條肽段 脈胞菌的肽段 2度相似，同時, 肽段序列 水稻 白 6575976 保守序列相同；肽段 比對與泛素化蛋白 551中多肽序列同源。 2 生物活性檢測結(jié)果首次證明了該蛋白不僅能促進豌豆幼苗的生長；還可有效抑制番茄灰霉病，結(jié)果表明，經(jīng)灰葡萄孢菌激活蛋白處理的幼苗葉片病指由 降到 葉率降低 21%，控制效果達 此外，研究發(fā)現(xiàn)，該蛋白還可誘導豌豆幼苗的醇脫氫酶活性的提高，說明灰葡萄孢菌激活蛋白可增強植物的抗?jié)承浴?3 成功利用磁珠構(gòu)建出灰葡萄孢菌到庫容總量為 07，滴度為 106性克隆率為 平均插入片段大小超過 12004 用簡并引物通過 增灰葡萄孢菌總 到 261基因片斷，待驗證其可靠性后，下一步實驗再將其作為探針，從 庫中調(diào)取全長基因，為獲得灰葡萄孢菌激活蛋白全長編碼基因奠定了基礎(chǔ)。 關(guān)鍵詞：灰葡萄孢菌；激活蛋白；純化；活性檢測；庫； is a of it is to to of a 35a in 1. A of of GE 0) 5 a 55is to 2O2 in is in of is of 6575976 in is 551. 2. as as to of 1% In of It is is to to 3. NA to by of of is 107, 06of 200a 4. A 261bp CR It be as a to of 目 錄 第一章 文獻綜述 .白激發(fā)子的種類及研究現(xiàn)狀 . 1 敏蛋白 . 1 發(fā)素 . 2 活蛋白 . 3 發(fā)子誘導植物獲得抗性的機制及早期事件 . 4 物抗病性反應(yīng)機制 . 4 發(fā)子誘導植物抗性發(fā)生的早期事件 . 5 1.3 庫的構(gòu)建方法研究進展 . 9 相 庫構(gòu)建法 . 9 . 10 . 10 . 11 . 11 用體外特異位點重組反應(yīng)構(gòu)建 庫 . 12 究目的與意義 . 12 第二章 灰葡萄孢菌激活蛋白的純化及生物活性測定 .料 . 14 種和植物材料 . 14 驗試劑 . 14 養(yǎng)基及緩沖液的配制 . 14 驗儀器 . 15 法 . 16 葡萄孢菌的培養(yǎng) . 16 葡萄孢菌激活蛋白的純化 . 16 品的制備及電泳 . 16 草愈傷組織和懸浮細胞的獲得 . 17 化過程各個步驟得到的激活蛋白對煙草 懸浮細胞過氧化氫含量的影響 . 17 化蛋白的鑒定氨基酸序列測定 . 17 葡萄孢菌激活蛋白的生物活性測定 . 17 果與分析 . 18 葡萄孢菌最適培養(yǎng)基的確定 . 18 V 草愈傷組織和懸浮細胞的獲得 . 19 葡萄孢菌激活蛋白的分離純化及純化蛋 白對煙草懸浮細胞過氧化氫含量的影響 . 20 譜鑒定純化蛋白及氨基酸序列測定 . 22 活蛋白生物活性測定結(jié)果 . 24 結(jié)與討論 . 26 第三章 灰葡萄孢菌 庫的構(gòu)建及基因克隆 .料 . 29 株和載體 . 29 要試劑 . 29 沖液配制 . 29 要實驗儀器及耗材 . 30 驗方法 . 30 葡萄孢菌總 提取 . 30 磁珠 獲得灰葡萄孢菌總 . 30 葡萄孢菌 庫的構(gòu)建 . 33 庫滴度檢測與保存 . 34 葡萄孢菌激活蛋白基因的克隆 . 35 果與分析 . 37 提取 . 37 成與純化 . 38 庫滴度與重組效率 . 38 因的克隆 . 39 結(jié)與討論 . 40 第四章 全文結(jié)論 .考文獻 .謝 .者簡歷 . 第一章 文獻綜述 第一章 文獻綜述 白激發(fā)子的種類及研究現(xiàn)狀 蛋白激發(fā)子是病原菌- 植物相互識別的重要信號分子，被激發(fā)子誘導后，相關(guān)的植物防御基因可迅速地得到表達，經(jīng)過一系列反應(yīng)過程誘導抗性。蛋白類激發(fā)子作為一種新型微生物農(nóng)藥具有傳統(tǒng)農(nóng)藥所不具備的特點和優(yōu)勢，傳統(tǒng)生物農(nóng)藥是直接作用于防治對象( 病原菌) ，而蛋白激發(fā)子在體外不表現(xiàn)殺菌作用，僅通過啟動植物體內(nèi)的防御機制而在抗病性中發(fā)揮作用，誘導植物本身的抗病基因或防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達從而達到抗病、促進生長的作用。因此在當前化學防治造成嚴重生態(tài)惡化、抗病育種無法解決抗性不穩(wěn)定等難題的情況下，蛋白激發(fā)子將成為農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中病害控制的新思路( 趙淑清& 郭劍波， 2003)。蛋白激發(fā)子多年來得到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注與研究，目前發(fā)現(xiàn)的植物蛋白激發(fā)子大體上分為以下幾類：過敏蛋白 發(fā)素 及本實驗室新近分離純化得到的激活蛋白 敏蛋白 992 年，美國 學韋忠民博士等人首次報道了植物病原歐氏桿菌 因，試驗人員從梨火疫病的病原細菌( 分離到一種由 因編碼的約 44激發(fā) 用 示), 繼而對細菌產(chǎn)生的 白的研究廣泛開展，近年來，有很多關(guān)于 報道，見表 1 1報道的過敏蛋白(白名稱 來源 編碼基因 分子量 參考文獻 6 W et 1995 c. 6 et , 1997 4 M et , 1992 . 2.9 O et , 1998 . 4 et 1998 O et 1998 et 1995 s. et 1995 s. et 1995 1中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 8 et 1994 . o. 4 et 1996 o. 偉剛 等, 2001 . o. 偉剛 等, 2001 對目前分離獲得的 白研究表明， 白具有親水性，富含甘氨酸，缺少半胱氨酸，無四級結(jié)構(gòu)，對熱穩(wěn)定。 白分子經(jīng) 100處理 10導非寄主產(chǎn)生 能力不會喪失，但對蛋白酶及紫外線敏感(et 1992; et 1995; 1996)。 白能誘導煙草、馬鈴薯、番茄、矮牽牛、大豆、黃瓜、辣椒以及擬南芥菜等多種植物的多個品種產(chǎn)生過敏反應(yīng)( 王鈞,1995; He et 1993 )，其本身又是寄主植物的一種致病因子( 王金生，1999; He et 1993)，從病原菌中清除其基因，會降低或完全消除病原菌對寄主的致病力和誘導非寄主產(chǎn)生過敏反應(yīng)的能力。作用機理與常用農(nóng)藥相比，主要有兩點顯著區(qū)別：能直接殺菌防病和殺蟲，而是靠提高植物自身的免疫力和植株的素質(zhì)抵御病蟲危害和其他不良環(huán)境的影響； 2. 是激素，也不含激素，但是有激素的作用。 白作為一種信號物質(zhì)和植物表面受體接觸后，產(chǎn)生的信號傳入植物體內(nèi)起生長調(diào)節(jié)作用，它是一種非特異性激發(fā)子，多種植物都存在接受它的信號的受體，通過信號傳導系統(tǒng)誘導植物產(chǎn)生廣譜性誘導抗病性及促進生長的生理效應(yīng)( 梁元存等，2001) 。 發(fā)素 一種來源于疫霉菌的抗病信號傳導蛋白，自從發(fā)現(xiàn)以來，一直是植物病理學和分子生物學的研究熱點之一。隨著 究的深入，新的 白不斷被發(fā)現(xiàn)，同時其生物活性也逐步被闡明。迄今為止已發(fā)現(xiàn) 17 種疫霉菌中存在 性蛋白(et 1993)，根據(jù)其等電點和煙草的防御反應(yīng)可分為酸性) 和堿性) 兩類，兩種類型 白的氨基酸序列同源性達到 60%以上 (et 1989)。 大部分 白的氨基酸序列高度相似和保守，蛋白質(zhì)前體含 19 或 20 個氨基酸的信號肽，成熟蛋白質(zhì)含 98 個氨基酸，分子量一般為 10 有少數(shù) 有不同(et 1993)。 有 6 個保守的半胱氨酸形成 3 對二硫鍵，使 球狀(et 1996)。 通過比較 2 種 2 種 結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)， 13 位的氨基酸是纈氨酸，而 此位上是賴氨酸(et 1989)，因此 更高的親水性，更易溶解。兩種類型蛋白引發(fā)可見防御反應(yīng)所需的濃度有很大差別，低于 100濃度即可引發(fā)可見反應(yīng)，而起可見反應(yīng)的濃度為10 et 1989)。 誘導煙草和十字花科的油菜，蘿卜等發(fā)生過敏反應(yīng)及系統(tǒng)性抗性等防御反應(yīng)，以避免進一步感染(et 1993)。研究證明， 通過水楊酸介導抗病信號途徑，激發(fā)2中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 植物獲得系統(tǒng)性抗性(，同時產(chǎn)生活性氧自由基、脂過氧化物、植保素(、病程相關(guān)蛋白(防御反應(yīng)相關(guān)物質(zhì)。 在眾多 白中，隱地蛋白(受到了更為廣泛的關(guān)注和更加深入的研究。隱地蛋白(一種由隱地疫霉(所分泌的蛋白類激發(fā)子，屬于 子量為 10電點為 98 個氨基酸組成，在培養(yǎng)液中很豐富(et ,1996)，在極低濃度(100 可誘導煙草產(chǎn)生 應(yīng)（1997 ）。蔣冬花等(2002) 從隱地疫霉( 成功克隆了隱地蛋白(基因，并構(gòu)建植物表達載體轉(zhuǎn)化煙草，獲得了抗黑脛病的轉(zhuǎn)基因植株。該研究還發(fā)現(xiàn)，隱地蛋白(3 位上的賴氨酸在誘導細胞死亡中起著關(guān)鍵的作用。 活蛋白 活蛋白 本試驗室從多種病原真菌如：交鏈孢菌（）、紋枯病菌（ 、黃曲霉菌（） 、葡萄孢菌（） 、稻瘟菌（、青霉菌（）、木霉菌（）和鐮刀菌（中分離純化出新型耐熱蛋白。相關(guān)核心技術(shù)已獲得 1 項發(fā)明專利，公開兩項專利，研究證明，從交鏈孢菌和稻瘟菌分離得到的激活蛋白氨基酸序列和核酸序列均不同于過敏蛋白和隱地蛋白，是一類新型的蛋白類激發(fā)子（邱德文，2006 ）。 植物激活蛋白并不直接作用于病原菌，而是通過激活植物本身的防御系統(tǒng)和生長系統(tǒng)，從而抵御病蟲害的侵襲，促進植物生長，該蛋白不誘導煙草植株的過敏反應(yīng)，這與過敏蛋白 (激發(fā)素 (均誘導煙草等非寄主植物產(chǎn)生過敏反應(yīng)不同。近年來，本實驗室對激活蛋白的研究取得了一系列有意義的成果，得到了突破性進展。趙利輝等 (2005)研究表明經(jīng)植物激活蛋白處理后，水稻幼苗增強了對稻瘟菌的抗性，幾丁質(zhì)酶和酶活性的變化趨勢與稻瘟菌抗性的變化趨勢接近，表明它們可能介入了激活蛋白誘導的水稻幼苗對稻瘟菌抗性的提高。徐鋒等（2006 ）利用抑制性消減雜交技術(shù)（成功構(gòu)建了激活蛋白處理水稻與非處理組水稻中差異表達的消減 庫，從文庫中篩選到 1756 個克隆，通過反向 交，從中得到 264 個有效克隆并測序，利用 據(jù)庫進行序列相似性比對分析，獲得 28 個上調(diào)表達差異基因。其中一些基因與植物的光合作用、營養(yǎng)物質(zhì)的運輸代謝等多種植物的生理生化功能相關(guān)?；钚詼y定研究發(fā)現(xiàn)，稻瘟菌激活蛋白可明顯提高絲瓜、番茄等發(fā)芽率，促進種子發(fā)芽整齊，同時對促進植物幼苗生長、健壯也有明顯的作用。處理水稻后，控制稻瘟菌效果達 抗旱綜合指數(shù)也從 55 提高到 92。經(jīng)激活蛋白處理后，植物的纖維素酶和醇脫氫酶活性增強，過氧化氫和脯氨酸的含量也提高，這些酶和活性物質(zhì)在促進植物生長抗逆方面能發(fā)揮重要作用（徐鋒等， 2006）。此外，激活蛋白對白術(shù)根腐病和斑枯病的誘抗效果分別達 產(chǎn)量提高 46%以上（蘇朝安等， 2006）；對蠶豆赤斑病，根腐病，病毒病誘抗效3中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 果分別達 和 吳全聰?shù)龋?006 ）；對臍橙日灼病，臍黃病，裂果病三大病害達 誘抗效果（吳全聰?shù)龋?2006）。激活蛋白能顯著誘導煙草抑制花葉病的發(fā)生和發(fā)展，枯斑抑制率達 且對改善煙草品質(zhì)有明顯作用（邱德文等，2005 ）。進一步研究表明，激活蛋白對甜菜夜蛾幼蟲生長和幼蟲體內(nèi)的蛋白合成有抑制作用，同時激活蛋白與 用后，大幅度提高了幼蟲死亡率，表明激活蛋白可作為蘇云金桿菌的新型增效劑（邱德文等，2005 ）。 隨著可持續(xù)農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展以及化學農(nóng)藥抗性和污染問題的日益嚴重，生物農(nóng)藥越來越受到重視，并成為綜合防治的主要部分。激活蛋白農(nóng)藥是基于誘導增強植物抗病性，抗逆性而研制的新型蛋白質(zhì)農(nóng)藥，產(chǎn)品安全無毒，不會引起植物的抗性，對植物有顯著抗病增產(chǎn)作用，同時能提高作物品質(zhì)，生產(chǎn)上可以減少或不使用化學農(nóng)藥，生產(chǎn)的產(chǎn)品可以達到綠色產(chǎn)品和有機食品的要求，特別是在有機蔬菜和果品生產(chǎn)中將發(fā)揮重要作用，符合當前我國農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整，有利于提高農(nóng)產(chǎn)品附加值，增加農(nóng)民收入，具有非常廣闊的市場前景和良好的市場競爭力，具有較好的綜合效益（邱德文& 楊秀芬，2006 ）。 發(fā)子誘導植物獲得抗性的機制及早期事件 物抗病性反應(yīng)機制 植物體在生長發(fā)育過程中會遭受到各種侵害，這些引起植物病害的因素包括：病毒，細菌，真菌及有害昆蟲。然而，病害僅在特定條件下發(fā)生，因為植物自身具有防御系統(tǒng)，如覆蓋在植物體表層的表皮細胞及細胞壁結(jié)構(gòu)，都是天然的物理屏障，可以阻止病原菌的侵入，此外，在非特異性侵染時，植物體還可分泌一些物質(zhì)來消滅病原菌，進行自我保護。但是，當發(fā)生特異性侵染時，病原菌就會越過植物體的這些自身保護屏障進而對植物造成危害。特異性侵染又可分為兩種情況，一種為非親和性互作，當植物體識別入侵病原菌后就會快速激發(fā)一系列防御反應(yīng)，繼而阻止了病原菌的進一步侵害。在發(fā)生非親和性互作時，植物體感染處的細胞會發(fā)生過敏反應(yīng)(，這部分的細胞死亡可以延緩或抑制病菌的生長和擴散，也使得這部分細胞與周圍的健康細胞相區(qū)別（ et 2003），同時來源于感染處的信號分子誘導植物的其余部分產(chǎn)生局部獲得抗性或系統(tǒng)獲得抗性（，以防止病菌的擴散和植株第二次受病菌感染。 應(yīng)均由相互連接的通路控制，包括水楊酸途徑，茉莉酸途徑和乙烯通路。腐生病原菌激發(fā)了由茉莉酸途徑和乙烯途徑控制的防御反應(yīng)，而水楊酸途徑控制的防御反應(yīng)是由寄生病原菌激發(fā)的（et 2001）。一些研究還表明，由水楊酸途徑控制的反應(yīng)會和由茉莉酸途徑或乙烯途徑控制的反應(yīng)相互抑制，說明這些途徑會相互交叉，使得植物體在遭受不同類型病原菌入侵時激發(fā)相關(guān)的反應(yīng)（et 1998; et 2003）。另一種為親和性互作，在這種情況下，植物體無法識別入侵病原菌或經(jīng)過一段時間后才能激發(fā)防御反應(yīng)，這就使病原菌可進入植物體進而造成病害。早期研究表明，很多植物是依靠植物抗性基因 R 基因和病原菌無毒基因 因之間的互作引發(fā)抗4中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 文獻綜述 病性反應(yīng)的（ et 1947）。 R 基因的產(chǎn)物可直接或間接的作為 白受體（et 1972），這兩種分子的互作可以引發(fā)植物體一系列的防御反應(yīng)。但是，在大部分 R 基因與 白相互作引發(fā)植物體防御反應(yīng)的機制中，白并未被明確指出，導致這種模式只局限于某些互作反應(yīng)中（et ,2000; et 2000; et 1996; et 1996）。研究發(fā)現(xiàn)，許多 其是寄主植物體不能表達相關(guān)的 R 基因時。這種防御模式的模擬機制是， 蛋白觸發(fā)了植物體內(nèi)可在基礎(chǔ)水平引發(fā)植物防御反應(yīng)的某種蛋白，在這種情況下， R 蛋白可識別 白復合物，并可激發(fā)植物的防御反應(yīng)（et 2001; et 2003; et 2003）。然而， 植物體并不僅僅是通過特定的 物激發(fā)防御反應(yīng)觸發(fā)抗性基因的表達這一種途徑而獲得抗病性的，激發(fā)子也可誘導多種植物發(fā)生防御反應(yīng)，進而獲得抗性。激發(fā)子是一大類化學物質(zhì)的總稱，包括：蛋白，糖蛋白，多糖，脂類物質(zhì)和一些合成的分子物質(zhì)，激發(fā)子可以是病原菌的組成成分或分泌物，還可以是寄主植物體的細胞壁被酶解釋放出的物質(zhì)。 關(guān)于激發(fā)子信號傳導途徑的早期研究發(fā)現(xiàn)，動物體與植物體遭受病原菌侵害時，激發(fā)子引發(fā)的信號傳導途徑十分形似。這些研究強調(diào)指出，各種生物體在進化過程中，與激發(fā)防御反應(yīng)相關(guān)的信號傳導系統(tǒng)都有著高度的保守性，從而使生物體獲得了先天的免疫防御功能（ et 2001） 。早期事件，如蛋白的磷酸化或產(chǎn)生多種信號分子（活性氧物質(zhì)或胞質(zhì)鈣離子等）這些控制多種反應(yīng)的相互關(guān)聯(lián)途徑，通過影響代謝途徑引發(fā)了一系列生理反應(yīng)，特別是當這些早期事件引發(fā)了激素合成基因的改變時，就會影響生物體激素代謝的平衡。對植物- 病原菌互作系統(tǒng)的研究發(fā)現(xiàn)，不同類型的病原菌可以引發(fā)植物體相應(yīng)的防御反應(yīng)，而這些反應(yīng)的控制因素各異（et 2002）。 總之，無論是由微生物還是激發(fā)子引發(fā)的信號傳導途徑，均導致以下結(jié)果：植物體細胞壁的增厚；產(chǎn)生抑制病原菌的代謝物，白以及保護性的過氧化物酶；植物體木質(zhì)化的發(fā)生 ；發(fā)生過敏性反應(yīng)（以延緩或抑制病菌的生長和擴散。這些反應(yīng)會引發(fā)植物體獲得系統(tǒng)獲得抗性（，可有效抗擊大量廣譜病原菌（1997 ） 。 發(fā)子誘導植物抗性發(fā)生的早期事件 以懸浮細胞系及完整植株為研究對象，運用多種細胞生物學，生物化學以及基因技術(shù)鑒定了多項激發(fā)子誘導產(chǎn)生的早期事件。研究發(fā)現(xiàn)，受激發(fā)子誘導產(chǎn)生的信號不是以線性形式進行傳遞的，而是通過復雜的多分支傳遞網(wǎng)絡(luò)被逐步放大，每一路分支都由不同的二級信號控制，